Le double test de règle d’ADN peut fournir des perspicacités mécanistes pour la translocation ribosome et sonder d’autres déplacements d’acide nucléique. Notre double analyse de règle d’ADN est actuellement la seule méthode qui peut objectivement sonder les côtés d’entrée et de sortie de l’ARNm dans les complexes ribosome avec la résolution de nucléotide simple. Des méthodes similaires sont également appliquées pour mesurer la force de liaison de l’ADN et la sélectivité des médicaments chimiothérapeutiques.
La démonstration visuelle de la méthode est une bonne occasion pour nous de montrer intuitivement les avantages de notre technique et d’aider d’autres chercheurs à la développer davantage en applications. Pour commencer, faire un puits d’échantillon en plastique avec une bande de styrène en perçant un cube au centre avec des dimensions de quatre millimètres par trois millimètres par deux millimètres. Puis, à l’aide d’époxy, collez un morceau de verre recouvert de biotine, d’environ cinq millimètres de long, à la surface inférieure.
Ajouter 20 microlitres de 0,25 milligramme par solution aqueuse de streptavidine millilitres dans le puits de l’échantillon, et incuber à température ambiante pendant 40 minutes. Rincez ensuite bien l’échantillon deux fois avec tam10 tampon. Pour immobiliser les complexes ribosome sans antibiotiques, retirez d’abord le tampon du puits de l’échantillon et ajoutez 20 microlitres de 0,1 micromolaire MF-Pre ou MF-Post ribosome complexe dans le puits de l’échantillon.
Incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure, puis rincer une fois avec tam10 tampon. Le complexe ribosome se lie maintenant avec la streptavidine à la surface par l’intermédiaire de la biotine à cinq extrémités sur l’ARNm. Pour l’expérience à l’aide d’antibiotiques, incuber neuf microlitres du complexe MF-Pre avec un microlitre de quatre millimolaires de néomycine, 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.
Puis combiner dans un tube 0,6 microlitres de 60 micromolaire EFG, 0,8 microlitres de 100 micromolaire GTP, 0,8 microlitres de PEP 100 millimlaires, 0,3 microlitres de 1,3 milligramme par millilitre pyruvate kinase, 6,43 microlitres TAM10 tampon, et un microlitre de cinq millimolaires acide fusidique. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, mélanger les deux mélanges, et incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes supplémentaires.
Effectuer les autres expériences antibiotiques de la même manière, avec des concentrations de 0,2 millimolaire viomycine, 0,4 millimolar hygromycine B, et 0,25 millimolaire acide fusidique. Pour l’étude de changement de cadre, répétez l’incubation pour les complexes MFNF-Pre impliquant le motif glissant, U6A. Inclure des antibiotiques d’acide fusidique plus la néomycine.
Suffisamment de temps est nécessaire pour assurer l’achèvement du processus d’hybridation. Il est également conseillé d’utiliser le tampon TAM10 avec un chlorure de sodium mole réel pour maintenir un système homosteady. Après l’incubation, retirer le tampon du puits de l’échantillon.
Ajouter 20 microlitres d’un brin d’ADN biotinylé biotinylé micromolaire et incuber à température ambiante pendant la nuit. Le matin, rincez le duplex ADN/ARNm formé une fois avec tam10 tampon. Retirez bien le tampon de l’échantillon.
Ajouter ensuite 20 microlitres de 0,5 milligramme par millilitre de perles magnétiques enduites de streptavidine dans le puits de l’échantillon, et incuber à température ambiante pendant deux heures. Après cela, insérez soigneusement l’échantillon bien dans un support, et placez-le dans une centrifugeuse pour enlever les particules magnétiques libres de la surface à 84 fois g pendant cinq minutes. Allumez le laser.
Appuyez ensuite sur le bouton d’alimentation. Réglez la sensibilité à 500 millivolts et attendez environ deux heures pour réchauffer et stabiliser le magnétomètre atomique. Pour configurer le magnétomètre atomique, exécutez le logiciel de commande de l’instrument et configurez le mode de déplacement du moteur vers le bruit et la position par défaut à zéro.
Appuyez sur Verrou sur le panneau avant. Réglez la sensibilité à 200 millivolts. Réglez le courant et la tension du laser, et trouvez le pic de résonance approprié et le niveau de signal-au-bruit pour la meilleure résolution de signal.
Appuyez sur Sweep sur le panneau avant. Assurez-vous que le rapport amplitude/largeur est supérieur à 0,5 et que la valeur de phase est inférieure à cinq degrés avec une largeur inférieure à 170 hertz. Branchez la sortie d’un autre amplificateur de verrouillage SR530 à la rétroaction du laser pour verrouiller sa fréquence.
Branchez le générateur de fonction ATF20B pour entrer une onde carrée de 500 millivolts de pointe à pic, 100 millihertz comme signal de référence pour convertir le courant en signal magnétique. Débranchez ensuite le générateur de fonction. Configurer le mode de déplacement du moteur en position dans les deux sens et par défaut à 260 millimètres.
Vérifiez l’état du contrôleur de température, pour vous assurer que la température est d’environ 37 degrés Celsius, du capteur atomique. Vérifiez la stabilité de l’ensemble du système deux fois en exécutant directement le programme sans charger d’échantillons pour mesurer les signaux du support de l’échantillon vide. Pour magnétiser les échantillons, utilisez doucement des pinces à épiler pour retirer l’échantillon du support et placez-le sur le stade de magnétisation pendant deux minutes.
Ensuite, remettre l’échantillon dans le porte-échantillon, et la centrifugeuse à 335,4 fois g pendant 20 minutes. Enlevez les particules magnétiques non liées. Chargez ensuite l’échantillon sur le moteur avec des pinces à épiler.
Cliquez sur Verrouiller sur le panneau avant pour exécuter le programme. Pendant ce temps, utilisez des pinces à épiler pour charger un autre échantillon dans le support et placez-le dans la centrifugeuse. Faire le côté en verre enduit face au centre de la centrifugeuse, et commencer la centrifugation à 335,4 fois g pendant quatre minutes.
Lorsque le moteur revient à zéro, après environ cinq minutes, cliquez sur Enregistrer sur le panneau avant. Utilisez soigneusement des pinces à épiler pour transférer un échantillon du moteur vers le porte-centrifugeuse. Appliquez une force plus forte en augmentant la vitesse centrifuge de 100 rpm ou une taille d’étape similaire.
Échangez l’échantillon contre la centrifugeuse. Processus alternativement pour augmenter progressivement la force à chaque fois. Un spectre de force complet est obtenu après 10 à 12 points de données.
Lorsque toutes les expériences prévues sont terminées, éteignez l’équipement, en procédant dans l’ordre opposé au fur et à mesure qu’il est allumé. Retirez les échantillons du support et plongez-les dans de l’éthanol pour le nettoyage et l’utilisation future. Nettoyez le porte-échantillon avec de l’acétone en cas de contamination par la perle magnétique.
Dans ce protocole, le complexe ribosome a été immobilisé à la surface, par l’extrémité à cinq premiers de l’ARNm, et a rendu le côté cinq-premier et trois-prime facilement accessible pour les règles d’ADN sondant. Quand le lien pour le côté cinq-prime était plus long que 50 thymine, un signal magnétique fort a été détecté, indiquant la formation réussie des duplex d’ADN/ARNm. En variant le nombre de nucléotides sur l’ADN, la corrélation de la force de dissociation à la longueur duplex a été atteinte pour les côtés à trois et cinq premiers, respectivement.
Les résultats de la translocation normale de MF-Pre à MF-Post, en l’absence d’antibiotiques, montrent que le ribosome déplacé par trois nucléotides vers l’extrémité à trois premiers des deux côtés. MF-Pre transportait un fMet-tRNA vagabond et un phenylalanine-tRNA aux sites P et A, respectivement, tandis que MF-Post transportait respectivement du fMet-tRNA et de la phénylalanine-tRNA sur les sites E et P, avec un site A vacant. Cependant, quand l’acide fusidique et les antibiotiques d’adiomycine étaient présents, le ribosome s’est déplacé par seulement un nucléotide au côté de cinq-prime mais deux nucléotides au côté de trois-prime.
Après lavage des antibiotiques, la translocation normale s’est produite, comme en témoignent trois mouvements de nucléotide des côtés cinq-prime et trois-prime. Lors de la magnétisation de l’échantillon, la surface enduite doit s’approcher et laisser l’aimant verticalement. Et l’élimination des particules magnétiques non liées à des données est très importante pour la précision et la qualité des données.
Notre technique fournit une haute résolution et un moyen généralement applicable d’étudier le déplacement moléculaire de l’acide nucléique qui est largement rencontré en biologie moléculaire.
