Cette recherche a été soutenue par le fonds de démarrage VCU (à Y.G.) et l’Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health sous le numéro de prix R01GM132329 (à Y.G.) Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des Instituts nationaux de la santé. Nous remercions Montserrat Samso et Kevin McRoberts pour leur généreux soutien à l’enregistrement vidéo.

1. Expression protéique
<ol><li>Inoculer 15 mL de bouillon formidable (TB) médias avec des antibiotiques spécifiques aux plasmides avec BL21 (DE3) cellules pLysS contenant l’AcrB exprimant des plasmides dans des tubes de 50 mL pendant la nuit à 37 °C avec secousse à 250 rpm.</li>
	<li>Vérifiez la densité optique de la culture nocturne à 600 nm (OD600) et assurez-vous qu’elle est de plus de 2,0.</li>
	<li>Diluer 5 mL de culture cellulaire en 1 L de médias antituberculeux contenant des antibiotiques spécifiques aux plasmides et incuber à 37 °C en secouantjusqu’à 600OD =0,8, puis induire avec iPTG qui a une concentration finale de 1 mM.</li>
	<li>Effectuer l’induction à 20 °C en secouant pendant 20 h.</li>
	<li>Pelleter les cellules à l’aide de centrifugation pendant 15 min à 4 °C et 4 000 x g.</li>
</ol>2. Lyse cellulaire et isolement membranaire
<ol><li>Resuspendez la pastille cellulaire dans le tampon A(tableau 1, utilisez le tampon A du DDM A ou le tampon A des NCMNs selon le schéma de purification qui doit suivre) en utilisant 80 mL pour chaque 20 g de granulés cellulaires.</li>
	<li>Homogénéisez les granulés de cellules résuspendus à l’aide d’un homogénéiseur Dounce en verre à 4 °C ou si, à température ambiante, assurez-vous de mettre sur la glace immédiatement après.</li>
	<li>Transférer l’échantillon dans un bécher métallique sur la glace et lyser les cellules en les chargeant dans un homogénéiseur haute pression à 4 °C et 1 500 barres.<ol>
<li>Répétez le processus de chargement des cellules dans l’homogénéisant et leur permettant de passer à travers l’homogénéiseur pendant 3-4 cycles ou jusqu’à ce que le lysate commence à clarifier.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugeuse le lysate à 15.000 x g pendant 30 min à 4 °C.</li>
	<li>Recueillir le supernatant et charger dans des tubes d’ultracentrifugeuse et une centrifugeuse à 215 000 x g pendant 1 h à 4 °C.</li>
	<li>Jetez le supernatant et recueillez les granulés membranaires des tubes d’ultracentrifugeuse. Conserver tout excès de granulés membranaires à -80 °C.</li>
</ol>3. Préparation de nanoparticules de membrane cellulaire indigène
<ol><li>Resuspendez 1 g de granulés membranaires dans le tampon A de 10 mL NCMNs (tableau 1).</li>
	<li>Homogénéiser l’échantillon de membrane cellulaire résuspendée à l’homogénéiseur dounce en verre à 20 °C.</li>
	<li>Transférer l’échantillon de membrane en suspension dans un tube de polypropylène de 50 mL et ajouter une solution de stock de polymères actifs membranaires et d’autres NCMN Tampon A pour amener l’échantillon à une concentration finale de 2,5 % (w/v) de polymère actif membranaire (NCMNP1-1 ou NCMNP5-2). REMARQUE : Les solutions de stock de polymères actifs membranaires doivent être faites dans de l’eau distillée double et peuvent être conservées à des concentrations variables, mais généralement à 10 % (w/v).</li>
	<li>Agiter l’échantillon pendant 2 h à 20 °C.</li>
	<li>Chargez l’échantillon dans une ultracentrifugeuse et tournez à 150 000 x g pendant 1 h à 20 °C.</li>
	<li>Alors que l’échantillon est ultra-centrifugé commencent à équilibrer une colonne Ni-NTA de 5 mL avec 25 mL de NCMNs Tampon A.</li>
	<li>Recueillir le supernatant après l’ultracentrifugation est terminé et le charger sur 5 mL de colonne Ni-NTA à température ambiante avec un débit de 0,5 mL/min à l’aide d’une pompe à seringues.</li>
	<li>Lavez les lignes de chromatographie liquide à protéine rapide (FPLC) avec suffisamment de NCMNs Buffer B (Tableau 1) pour rincer complètement le système, puis connectez la colonne à la machine FPLC.</li>
	<li>Lavez la colonne avec 30 mL de NCMNs Buffer B avec un débit de 1 mL/min et recueillez le flux à travers.</li>
	<li>Lavez la colonne avec 30 mL de NCMNs Buffer C (Tableau 1) avec un débit de 1 mL/min et de recueillir le flux à travers.</li>
	<li>Elutez la protéine avec 20 mL de NCMNs Buffer D (Tableau 1) à un débit de 0,5 mL/min et recueillez l’échantillon à l’aide d’un collecteur de fractions et les fractions étant chacune réglées à 1,0 mL.</li>
	<li>Conserver les échantillons de protéines à 4 °C.</li>
	<li>Exécutez un test d’électrophoresis gel SDS-PAGE afin de vérifier les échantillons qui correspondent aux pics observés sur le graphique d’élitution FPLC.</li>
</ol>4. Électrophoresis gel SDS-PAGE
<ol><li>Préparer la chambre de coulée en serrant le verre à l’appareil de coulée.</li>
	<li>Préparez le gel de séparation de 12 % selon la recette énumérée dans le tableau 1. REMARQUE : Une fois que temed est ajouté le gel polymérisera rapidement ainsi ajoutez seulement ceci une fois prêt à verser le gel.</li>
	<li>Verser le gel, en laissant 2 cm sous le fond du peigne pour le gel d’empilage.</li>
	<li>Enlevez les bulles en superposant le dessus du gel avec 100% isopropanol et attendez que le gel de séparation polymérise.</li>
	<li>Retirer l’isopropanol et laver toute trace de l’isopropanol avec de l’eau distillée.</li>
	<li>Préparer le gel d’empilage selon la recette énumérée dans le tableau 1. REMARQUE : Une fois que temed est ajouté le gel polymérisera rapidement ainsi ajoutez seulement ceci une fois prêt à verser le gel.</li>
	<li>Verser le gel d’empilage sur le gel de séparation.</li>
	<li>Ajouter un peigne à la chambre pour former les puits et attendre que le gel empilage soit complètement polymérisé.</li>
	<li>Placer 1 μL de 1 M de TNT dans un tube de microcentrifugeuse pour chaque échantillon de fraction qui doit être exécuté sur le gel.</li>
	<li>Ajoutez également 7 μL de tampon de chargement 4x à chaque tube.</li>
	<li>Ajouter 20 μL d’échantillon à partir des fractions qui doivent être exécutés sur le gel à chaque tube de microcentrifugeuse.</li>
	<li>Vortex les tubes contenant les échantillons.</li>
	<li>Faites tourner les tubes de l’échantillon à l’aide d’une microcentrifugeuse de table de 3 s et assurez-vous que tout l’échantillon est retourné au fond des tubes.</li>
	<li>Préparer la cellule d’électrophoresis gel en sécurisant une cassette de gel polyacrylamide de 12% en place et en remplissant les chambres intérieures et externes de la cellule avec Tris-acétate-EDTA (TAE) Buffer (Tableau 1).</li>
	<li>Chargez le marqueur de poids moléculaire dans la première voie du gel avec le volume approprié requis par ses instructions.</li>
	<li>Chargez 28 μL de l’échantillon de chaque tube mélangé à la TNT et au tampon de chargement.</li>
	<li>Placez le couvercle de la cellule électrophoresis sur le dessus de la boîte et branchez le couvercle dans l’alimentation électrique.</li>
	<li>Allumez l’alimentation électrique et réglez-la à 100 V et laissez-la fonctionner pendant 20 min.</li>
	<li>Après 20 min, augmenter le courant d’alimentation à 140 V et continuer à l’exécuter pendant encore 30-40 min ou jusqu’à ce que la bande de colorant tampon de chargement atteint le fond de la cassette de gel.</li>
	<li>Après avoir complété la tache d’électrophorésie et de détenir le gel pour visualiser les bandes protéiques contenues dans le gel.</li>
</ol>5. Purification des protéines à l’aide de DDM
REMARQUE : Le but de ce processus de purification est de servir de contrôle pour les expériences utilisant les polymères actifs membranaires.
<ol><li>Resuspendez 6-10 g de granulés membranaires, à partir de l’étape 2.6, dans le tampon A du DDM (tableau 1) à l’aide de 5 mL/g de granulés membranaires.</li>
	<li>Homogénéisez l’échantillon resuspendi avec un homogénéiseur dounce en verre à 4 °C ou si à température ambiante assurez-vous de mettre sur la glace immédiatement après.</li>
	<li>Transférer l’échantillon dans un tube de polypropylène de 50 mL et ajouter le DDM et le tampon A additionnel de DDM pour amener l’échantillon à une concentration finale de 2 % de DDM.</li>
	<li>Agiter l’échantillon pendant 2 h à 4 °C.</li>
	<li>Charger l’échantillon dans des tubes d’ultracentrifugeuse et une centrifugeuse de 1 h à 4 °C et 150 000 x g.</li>
	<li>Alors que l’échantillon est ultra-centrifugé commencer à préparer les 5 mL de colonne Ni-NTA en se lavant avec 25 mL de tampon DDM A (tableau 1).</li>
	<li>Une fois l’ultracentrifugation terminée, recueillez le supernatant et chargez-le sur la colonne Ni-NTA de 5 mL à 4 °C avec un débit de 0,5 mL/min à l’aide d’une pompe à seringues.</li>
	<li>Lavez les lignes FPLC avec suffisamment de DDM Buffer B + 0,05% DDM (Tableau 1) pour rincer complètement le système, puis fixez la colonne à la machine FPLC.</li>
	<li>Lavez la colonne avec 30 mL de Tampon B DDM + 0,05% DDM avec un débit de 1 mL/min et recueillez le flux à travers.</li>
	<li>Lavez la colonne avec 30 mL de Tampon DDM C + 0,05% DDM (Tableau 1) avec un débit de 1 mL/min et de recueillir le flux à travers.</li>
	<li>Elute la protéine avec 20 mL de DDM Buffer D + 0,05% DDM (Tableau 1) à un débit de 0,5 mL/min et de recueillir le flux à l’aide d’un collecteur de fractions et les fractions étant ensemble à 1,0 mL.</li>
	<li>Sélectionnez les fractions contenant le pic d’élitution pour la mise en commun et la concentration à l’aide d’un concentrateur centrifuge et d’une centrifugeuse à 4 000 x g et 4 °C jusqu’à atteindre 500 μL.</li>
	<li>À l’aide d’une boucle de 500 μL, chargez l’échantillon dans la machine FPLC, puis sur la colonne d’exclusion de taille de 25 mL à 4 °C. Elute utilisant 30 mL de Tampon DDM E + 0,05% DDM (Tableau 1) à un débit de 0,5 mL/min et de recueillir en fractions avec les tailles de fraction s’est fixé à être de 0,5 mL par fraction.</li>
	<li>Prenez les fractions et mesurez la concentration en protéines à l’aide de l’absorption de 280 nm pour confirmer la courbe UV-Vis à partir du graphique d’élitution FPLC.</li>
	<li>Recueillir 20 μL à partir de chaque fraction d’échantillon qui correspond aux pics observés sur le graphique d’élitution fplc et ont été confirmés pour être précis avec le test d’absorption.</li>
	<li>Congeler le reste de ces fractions d’échantillon à l’aide d’azote liquide ou de glace sèche dans les aliquots désirés et conserver les échantillons de protéines à -80 °C.</li>
	<li>Exécutez un test d’électrophoresis gel SDS-PAGE tel que décrit précédemment pour vérifier les échantillons qui correspondent aux pics observés sur le graphique d’élitution FPLC.</li>
</ol>6. Préparation négative de grille de tache
<ol><li>Placez les grilles qui vont être utilisées pour la préparation de l’échantillon sur une glissière en verre enveloppée dans du papier filtre avec le côté carbone face vers le haut.</li>
	<li>Placez la glissière de verre avec les grilles de microscope électronique dans la chambre d’un déchargeur de lueur entre les deux électrodes et remplacez le couvercle en verre en s’assurant qu’il est centré et bien scellé.</li>
	<li>Exécutez la machine de déchargement de lueur et assurez-vous que la lumière pourpre générée par le plasma est visible.</li>
	<li>Lorsque la machine est terminée en marche, attendez que la chambre ait atteint la pression atmosphérique pour enlever le couvercle en verre, puis retournez la glissière avec les grilles sur le banc où les échantillons seront chargés sur eux.</li>
	<li>Ajuster la concentration des échantillons de protéines purifiées à environ 0,1 mg/mL en diluant l’échantillon avec le tampon approprié ou en se concentrant à l’aide d’un concentrateur centrifuge.</li>
	<li>Chargez 3,5 μL d’échantillon de protéines sur la grille de carbone de 10 nm d’épaisseur et attendez 1 min.</li>
	<li>Retirez le liquide de la surface de la grille EM à l’aide d’un papier filtre.</li>
	<li>Lavez la surface de la grille 3x en ramassant 3 gouttelettes d’eau de μL avec la grille et en enlevant l’eau de la grille avec du papier filtre entre la cueillette de chaque gouttelette.</li>
	<li>Lavez la surface de la grille 2x en ramassant 3 gouttelettes de μL d’acétate d’uranium frais filtré à 2 % et enlevez les solutions de lavage sur la grille avec du papier filtre entre la cueillette de chaque gouttelette.</li>
	<li>Tacher la grille avec une gouttelette de 3 μL d’acétate d’uranium frais filtré à 2 % pendant 1 min.</li>
	<li>Retirez la solution d’acétate d’uranium à la surface du réseau EM avec du papier filtre et séchez la grille pendant au moins 1 min.</li>
	<li>Conservez la grille dans une boîte de grille pour une utilisation ultérieure.</li>
</ol>7. Imagerie EM
<ol><li>Chargez la grille préparée dans le support du réseau à un établi sécuritaire.</li>
	<li>Préparer le microscope en plaçant les microscopes dewar dans une boîte en polystyrène et remplir la dewar 3/4e pleine d’azote liquide.</li>
	<li>Confirmez que le couvercle en caoutchouc de la fenêtre du microscope le recouvre, puis chargez la dewar sur le microscope en plaçant les fils de cuivre dans la dewar jusqu’à ce qu’il s’adapte sur la plate-forme.</li>
	<li>Remplissez le reste de la dewar d’azote liquide et placez un bouchon sur le dessus de la dewar pour le couvrir.</li>
	<li>Allumez la haute tension, conditionner le microscope, et attendre que le microscope se réchauffe et d’établir un niveau de vide sûr pour une utilisation.</li>
	<li>Une fois que le microscope est prêt, ouvrez la valve de la colonne et confirmez que le faisceau est présent en enlevant le couvercle en caoutchouc sur la fenêtre du microscope.</li>
	<li>Vérifiez la stigmatisation du faisceau en vous répandant dans et hors en ajustant l’intensité du faisceau. Si l’astigmatisme est présent, le faisceau aura une forme elliptique que l’on s’éloigne de cross-over et le faisceau doit être la même forme ovale des deux côtés.</li>
	<li>Ajustez les jumelles au microscope pour qu’ils soient de la bonne hauteur et de la bonne distance selon les yeux de l’observateur.</li>
	<li>Vérifiez le positionnement du faisceau pour les modes Recherche, Focuset Exposition en parcyclant les trois modes jusqu’à ce que le faisceau soit centré dans chacun d’eux.</li>
	<li>Fermez la valve de la colonne et chargez le support de grille dans le microscope électronique.</li>
	<li>Réglez le microscope à la hauteur eucentrique en utilisant la fonction wobbler microscopes et en ajustant le mouvement de la scène en utilisant l’axe Z jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de mouvement d’un côté à l’autre de l’échantillon au centre.</li>
	<li>En utilisant le mode de recherche à faible dose sur le microscope rechercher la grille pour une zone souhaitable de contraste raisonnable avec les molécules échantillon présentes pour se concentrer sur l’échantillon.</li>
	<li>Concentrez-vous sur l’échantillon en mode Focus en utilisant une taille d’étape élevée jusqu’à ce que l’échantillon soit vu, puis diminuez les étapes pour trouver le niveau de mise au point correct.</li>
	<li>Zéro et vider le faisceau, puis assurez-vous que le tampon en caoutchouc couvre la fenêtre du microscope.</li>
	<li>En utilisant le mode Exposition prendre l’image de la zone de grille désirée pour une exposition de 1 s à 62.000x grossissement et vérifier l’image obtenue.</li>
	<li>Une fois l’imagerie effectuée, une grille ferme les vannes de colonne et retire le support de grille de la colonne.</li>
	<li>Une fois terminé l’imagerie de toutes les grilles d’intérêt arrêter le microscope en éteignent la puissance de filament et en enlevant la dewar d’azote liquide du microscope.</li>
	<li>Placez quelque chose pour absorber l’humidité sur le stand où la dewar s’est assise pour attraper la condensation des bobines de cuivre du microscope.</li>
	<li>Activez le mode Cryo Cycle et assurez-vous que la pompe turbo est éteinte.</li>
</ol>

<ol>
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(132), e57199 (2018).</li><li>Lu, W., Zhong, M., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+AcrB+Subunit+Precedes+Trimerization.">Folding of AcrB Subunit Precedes Trimerization.</a> Journal of Molecular Biology. 411 (1), 264-274 (2011).</li><li>Lebon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structure and Function of GPCRs. , 229-230 (2019).</li><li>Rames, M., Yu, Y., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+negative+staining:+a+high-throughput+protocol+for+examining+small+and+asymmetric+protein+structure+by+electron+microscopy.">Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).</li><li>Lee, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+detergent-free+isolation+of+membrane+proteins+in+their+local+lipid+environment.">A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).</li><li>Hall, S. C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acid-compatible+co-polymer+for+the+solubilization+of+membranes+and+proteins+into+lipid+bilayer-containing+nanoparticles.">An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles.</a> Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).</li><li>Oluwole, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+of+Membrane+Proteins+into+Functional+Lipid-Bilayer+Nanodiscs+Using+a+Diisobutylene/Maleic+Acid+Copolymer.">Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer.</a> Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).</li></ol>

Y.G est répertorié comme inventeur du polymère actif membranaire NCMNP5-2 et du système NCMN.

Les interactions protéine-protéine sont importantes pour l’intégrité de la structure et de la fonction des protéines membranaires. De nombreuses approches ont été développées pour étudier les interactions protéines-protéines. Par rapport aux protéines solubles, les protéines membranaires et leurs IPP sont plus difficiles à étudier en raison des propriétés intrinsèques uniques des protéines membranaires. Cette difficulté provient principalement de l’exigence de protéines membranaires à intégrer...

Les interactions protéine-protéine (IPP) jouent un rôle central tout au long de la biologie, depuis le maintien de la structure et de la fonction des protéines jusqu’à la régulation de systèmes entiers. Les IPP se sous de nombreuses formes différentes peuvent être classés en fonction des types d’interactions qu’ils forment. L’une de ces catégorisations est homooligomérique ou hétérooligomérique, selon que les interactions sont entre des sous-unités identiques ou différentes protéines agissant sous-units. Une autre catégorisation est basée sur la force de l’interaction si les interactions conduit à la formation de complexes stables ou d’états complexes transitoires. L’information structurelle sur les IPP entre les protéines est cruciale pour comprendre le mécanisme par lequel les protéines effectuent leur fonction. On estime que plus de 80 % des protéines reposent sur une formation complexe pour s’acquitter de leurs rôles fonctionnels1. Étant donné le pourcentage de protéines observées comme dépendant des IPP pour un bon fonctionnement inné, leur importance en biologie est évidente, mais être en mesure d’étudier correctement les protéines qui s’engagent dans ces interactions est resté difficile en raison des limitations dans les techniques disponibles pour observer expérimentalement lorsque les protéines forment des IPP.
Il y a un degré élevé de désaccord entre les résultats pour beaucoup d’IPP expérimentalement déterminés en raison de la quantité élevée de bruit, de faux positifs, et de faux négatifs qui sont dérivés de beaucoup des techniques de détermination actuellement disponibles de PPI. C’est particulièrement le cas pour le système de levure à deux hybrides (Y2H), la spectrométrie de purification de masse d’affinité en tandem (TAP-MS) et le transfert d’énergie par résonance fluorescence (FRET), qui représentent trois des méthodes les plus couramment utilisées pour la détermination PPI2,3,4,5,6,7. En comparaison, les techniques de biologie structurale protéique, telles que la résonance magnétique nucléaire (RM), la cristallographie aux rayons X et la microscopie électronique (EM), peuvent être utilisées pour obtenir des informations structurelles à haute résolution sur les interactions protéine-protéine jusqu’au niveau atomique et permettre la confirmation visuelle directe des interactions se produisant pour une protéine cible d’intérêt. Toutes les techniques de recherche non fondées sur la structure actuellement disponibles (p. ex., Y2H, TAP-MS et FRET) n’ont pas cette capacité et souffrent en outre de la difficulté à identifier les interactions faibles et transitoires entre les protéines5. Ces lacunes sont encore améliorées lors de l’étude des protéines membranaires en raison de la complexité supplémentaire provoquée par la variable supplémentaire de l’environnement lipidique qui influence la formation d’une structure quaternaire appropriée et d’un assemblage complexe hétéromérique.
Les protéines membranaires composent une grande partie du protéome et sont connues pour jouer de nombreux rôles cruciaux dans le bon fonctionnement cellulaire dans tous les organismes vivants. Malgré le fait que les protéines membranaires représentent 27 % du génome humain et constituent environ 60 % de toutes les cibles actuelles en matière demédicaments,il existe une anomalie majeure dans le nombre de modèles résolus pour les protéines membranaires qui ne représentent que ~2,2 % de toutes les structuresprotéiques publiées 8,9,10. La principale cause de l’écart dans la disponibilité de l’information structurelle réside dans les propriétés intrinsèques des protéines membranaires elles-mêmes. En raison de leur faible solubilité, de leur dépendance à l’égard des interactions avec un environnement lipidique pour maintenir la structure et la fonction indigènes, et des diverses propriétés physicochimiques de la membrane lipidique elle-même, les protéines membranaires continuent de représenter un problème important lors de la mise en œuvre de techniques de biologie structurelle pour les étudier. De ces propriétés intrinsèques, la plus importante pour obtenir des informations structurelles précises est l’exigence d’avoir des interactions avec leur environnement lipidique naturel pour qu’ils maintiennent leur structure et leur fonction indigènes. L’environnement lipidique fait tellement partie intégrante de la structure et de la fonction des protéines membranaires que le concept de mémtéine (une combinaison des mots membrane et protéine) a été proposé comme unité fondamentale de la structure membranaire-protéique et de lafonction 11. Malgré l’importance des interactions lipidiques-protéines, les techniques de détermination de l’IPP basées sur la structure actuellement disponibles exigent souvent que les protéines étudiées soient solubles ou solubilisées avec des détergents. L’exposition à des détergents durs peut dénaturer les protéines ou causer de faux positifs et négatifs dus à la délipidation, qui peut induire l’agrégation, la dénaturation des protéines, la dissociation des interactions non covalentes et la formation d’états oligomériques artificiels. En raison de la nécessité de maintenir un environnement lipidique naturel pour la détermination précise de l’état oligomérique indigène des protéines membranaires, nous avons développé un système de nanoparticules de membrane cellulaire indigène (NCMNs)12 basé sur les particules de lipides mâles mâles (SMALP) précédemment rapportées (SMALP)13 méthode.
SMALP utilise le copolymère acide masculin styrène comme polymère actif membranaire pour extraire et solubiliser les protéines membranaires. Poly (Styrene-co-Maleic Acid) (SMA) est un polymère amphiphilique unique en raison de sa mastic styrène hydrophobe et diamétralement opposée à la moiety acide masculin hydrophilique. Il forme des nanoparticules en adsorber, déstabilisant et perturbant la membrane cellulaire dans un mécanisme dépendant du pH14. Cette activité fonctionnelle de SMA est ce qui lui permet d’être utilisé comme un système sans détergent pour l’extraction des protéines membranaires et la solubilisation. Le système NCMN est distinct du système SMALP à plusieurs égards. La caractéristique la plus unique du système NCMN est qu’il dispose d’une bibliothèque de polymères actifs membranaires avec une multitude de polymères qui ont des propriétés uniques qui les rendent adaptés à l’isolement de nombreuses protéines membranaires différentes qui nécessitent des conditions différentes pour la stabilité et le fonctionnement natif. Le système NCMN a également des protocoles différents par rapport à la méthode SMALP quand il s’agit de préparer les nanoparticules. Un tel exemple est que les NCMN utilisent une purification de colonne d’affinité de nickel en une seule étape pour la détermination de la structure à haute résolution; l’effet de ces différents protocoles peut être observé lors de la comparaison du protocole NCMNs, qui a généré 3.2 et 3.0 Å cryo-EM AcrB structures, avec une étude similaire utilisant la méthode SMALP, qui a abouti à une structure cryo-EM AcrB à une résolution 8.8 Å12,15. Ces caractéristiques uniques du système NCMN sont les améliorations apportées à la méthode SMALP précédemment établie et en font un candidat idéal pour l’étude des IPP.
Le transporteur multidrogue efflux AcrB existe en tant qu’homotrimère fonctionnel dans E. coli12. Une analyse mutagène a suggéré qu’une mutation unique de point de P223G, située sur une boucle qui est responsable de la stabilité du trimer d’AcrB, déstabilise l’état de trimer et donne un monomère d’AcrB une fois préparé avec le DDM détergent, qui pourrait être détecté avec l’électrophoresis bleu indigène de gel16. Cependant, l’analyse fret du mutant AcrB-P223G a suggéré que lorsque dans l’environnement de la bicouche lipidique de la membrane cellulaire indigène, la majorité des mutants AcrB-P223G existaient encore en tant que trimer et que les niveaux d’expression pour les deux types sauvages AcrB et AcrB-P223G sont similaires. Pourtant, malgré les résultats de l’analyse fret, un essai d’activité pour le transporteur mutant a montré que l’activité a considérablement diminué par rapport au typesauvage 16. Bien que la technologie FRET ait été populairement utilisée pour l’analyse des interactions protéines-protéines, la recherche a montré qu’elle peut souvent donner de faux positifs17,18,19,20.
Récemment, des structures cryo-EM à haute résolution du trimer AcrB ont été déterminées qui ont montré l’interaction de l’AcrB avec sa bicouche lipidique de membrane cellulaire indigène associée par l’utilisation des NCMNs12. En principe, les NCMN peuvent facilement être utilisés pour l’analyse des interactions protéine-protéine trouvées sur la membrane cellulaire indigène. Lors d’un test de ce système, des expériences ont été menées pour observer directement l’état oligomérique de l’AcrB-P223G avec l’utilisation de nanoparticules de membrane cellulaire indigène et de microscopie électronique colorante négative. Afin de comparer avec les nanoparticules sauvages de type AcrB, nous avons utilisé le même polymère actif membranaire (SMA2000 fabriqué dans notre laboratoire, qui est indexé comme NCMNP1-1 dans la bibliothèque NCMN) utilisé pour la détermination de la structure cryo-EM à haute résolution de l’AcrB et des polymères alternatifs trouvés dans la bibliothèquenCMNs 12. D’après les résultats précédemment rapportés, on s’attendait à ce que la majorité du mutant AcrB-P223G existe sous forme de nanoparticules de membrane cellulaire indigène trimeric21. Cependant, aucun trimers AcrB n’a été trouvé présent dans l’échantillon, comme ceux qui ont été observés avec le type sauvage AcrB. Ceci suggère que la majorité d’AcrB-P223G ne forme pas de garnitures sur la membrane cellulaire indigène comme précédemment suggéré.
Ici, nous rapportons une analyse détaillée du mutant E. coli AcrB-P223G dans une comparaison avec le type sauvage E. coli AcrB en utilisant les NCMN. Cette étude de cas de l’AcrB suggère que les NCMN sont un bon système pour l’analyse d’interaction protéine-protéine.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A38S-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>C-105-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (Dithiothreitol) (&#62; 99% pure) Protease free</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>DTT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>17525 1 KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>K-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AA3622636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-dimethylethylenediamine (EDTA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.03779.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCMNS-P5-2</td>
			<td>Not commercially available yet</td>
			<td>Submit request for obtaining to corresponding author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Dual Color Standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA2000</td>
			<td>Cray Valley</td>
			<td>Submit request for obtaining to corresponding author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>TCEP25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth Media</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75856 1 KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Ambinter</td>
			<td>Amb22348393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-26S XPI</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B14538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti JXN-30</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B34193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Electron Microscope Grids (10 nm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF300-Cu-TH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Con-Torque Tissue Homogenizer</td>
			<td>Eberbach</td>
			<td>E7265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning LSE Mini Microcentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>07-203-954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Avestin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction Collector F9-R</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29003875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-8004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000 Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>PN LL-IM-12AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000S-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>358013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump</td>
			<td>Razel Scientific Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai F20 200kV</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA pure 25 L1 FPLC</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)pLysS Cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C606003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP 5 ml Column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17524802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-24a</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>69749-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

native cell membrane nanoparticles system for membrane protein-protein interaction analysis

Les interactions protéine-protéine dans les systèmes membranaires cellulaires jouent un rôle crucial dans un large éventail de processus biologiques, des interactions cellule à cellule à la transduction du signal; de la détection des signaux environnementaux à la réponse biologique; de la régulation métabolique au contrôle du développement. Des informations structurelles précises sur les interactions protéine-protéine sont cruciales pour comprendre les mécanismes moléculaires des complexes protéiques membranaires et pour la conception de molécules très spécifiques pour moduler ces protéines. De nombreuses approches in vivo et in vitro ont été développées pour la détection et l’analyse des interactions protéine-protéine. Parmi eux, l’approche de biologie structurelle est unique en ce qu’elle peut fournir des informations structurelles directes sur les interactions protéines-protéines au niveau atomique. Cependant, la biologie structurale des protéines membranaires actuelles est encore largement limitée aux méthodes à base de détergent. L’inconvénient majeur des méthodes à base de détergent est qu’elles dissocient ou dnaturent souvent les complexes protéiques membranaires une fois que leur environnement de bicouche lipidique indigène est éliminé par des molécules détergentes. Nous avons développé un système de nanoparticules de membrane cellulaire indigène pour la biologie structurale de protéine de membrane. Ici, nous démontrons l’utilisation de ce système dans l’analyse des interactions protéine-protéine sur la membrane cellulaire avec une étude de cas de l’état oligomérique de l’AcrB.

À l’aide des procédures présentées ici, des échantillons de type sauvage E. coli AcrB et de mutant e. coli AcrB-P223G ont été purifiés. Les échantillons ont ensuite été adsorbés à des grilles de microscopie électronique tache négative de carbone et tachés à l’aide d’acétate d’uranyle avec la méthode de ballonnementlatéral 22. Des images négatives de tache ont été rassemblées utilisant la microscopie électronique de transmission. L’image de tache...

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Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Présenté ici est un protocole pour la détermination de l’état oligomérique des protéines membranaires qui utilise un système de nanoparticules de membrane cellulaire indigène en conjonction avec la microscopie électronique.

Système de nanoparticules de membrane cellulaire indigène pour l’analyse d’interaction protéine-protéine de membrane

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

native-cell-membrane-nanoparticles-system-for-membrane-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

5.9K vues.  Virginia Commonwealth University. Présenté ici est un protocole pour la détermination de l’état oligomérique des protéines membranaires qui utilise un système de nanoparticules de membrane cellulaire indigène en conjonction avec la microscopie électronique.

Vidéo: Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

Procédé pour l&#39;identification d&#39;inhibiteurs de petites molécules de l&#39;interaction protéine-protéine entre HCN1 et TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Recherche

Biochimie

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Utilisation de Scaffold Liposomes à Reconstituer interactions protéine-protéine Lipid-proximal<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

FRET de haute précision au niveau d&#39;une molécule pour la détermination de la structure biomoléculaire

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between proteins such as transcription factors (TFs) and their DNA target. The method presented here utilizes the underlying concept of the Y1H but is modified further to study and validate protein complexes binding to their target DNA. Hence, it is referred to as the modified yeast one-hybrid (Y1.5H) assay. This assay is cost effective and can be easily performed in a regular laboratory setting. Albeit using a heterologous system, the described method could be a valuable tool to test and validate the heteromeric protein complex binding to their DNA target(s) for functional genomics in any system of study, especially plant genomics.

The modified yeast one-hybrid assay described here is an extension of the classical yeast one-hybrid (Y1H) assay to study and validate the heteromeric protein complex-DNA interaction in a heterologous system for any functional genomics study.

Un système hybride de levure modifié pour les études d&#39;interaction complexe-ADN de protéines hétérogènes

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

Peptides de pénétration cellulaire biotinylé pour étudier les Interactions protéine-protéine intracellulaire

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

Analyse des Complexes de protéine de Membrane de Thylakoid par électrophorèse sur Gel natif bleu

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Un dosage de spectroscopie par Fluorescence Fluctuation d’Interactions protéine-protéine à Contacts cellule-cellule

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions largely depend on intracellular protein&#8211;protein interactions. Therefore, research regarding these interactions is indispensable to facilitating the understanding of physiologic processes. Co-precipitation of associated proteins, followed by mass spectrometry (MS) analysis, enables the identification of novel protein interactions. In this study, we have provided details of the novel technique of immunoprecipitation-liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis combined with on-membrane digestion for the analysis of protein&#8211;protein interactions. This technique is suitable for crude immunoprecipitants and can improve the throughput of proteomic analyses. Tagged recombinant proteins were precipitated using specific antibodies; next, immunoprecipitants blotted onto polyvinylidene difluoride membrane pieces were subjected to reductive alkylation. Following trypsinization, the digested protein residues were analyzed using LC-MS/MS. Using this technique, we were able to identify several candidate associated proteins. Thus, this method is convenient and useful for the characterization of novel protein&#8211;protein interactions.

Here, we present a protocol for an on-membrane digestion technique for the preparation of samples for mass spectrometry. This technique facilitates the convenient analysis of protein&#8211;protein interactions.

Évaluation des interactions protéines-protéines à l'aide d'une technique de digestion on-Membrane

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

Caractérisation des transporteurs de membrane par l'expression hétérologue dans E. coli et la production de vésicules membranaires

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial membrane is a challenging environment to distinguish regulatory factors. Experimental control of protein and lipid components can help answer specific questions of regulation. Yet, quantitative manipulation of these factors is challenging in cellular assays. To investigate the molecular mechanism of mitochondria inner-membrane fusion, we introduced an in vitro reconstitution platform that mimics the lipid environment of the mitochondrial inner-membrane. Here we describe detailed steps for preparing lipid bilayers and reconstituting mitochondrial membrane proteins. The platform allowed analysis of intermediates in mitochondrial inner-membrane fusion, and the kinetics for individual transitions, in a quantitative manner. This protocol describes the fabrication of bilayers with asymmetric lipid composition and describes general considerations for reconstituting transmembrane proteins into a cushioned bilayer. The method may be applied to study other membrane systems.

Mitochondrial fusion is an important homeostatic reaction underlying mitochondrial dynamics. Described here is an in vitro reconstitution system to study mitochondrial inner-membrane fusion that can resolve membrane tethering, docking, hemifusion, and pore opening. The versatility of this approach in exploring cell membrane systems is discussed.

Une plate-forme membranaire modèle pour reconstituer la dynamique memitochondriale de membrane

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...