Esta pesquisa foi apoiada pelo fundo de startups VCU (para Y.G.) e pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob o Prêmio Número R01GM132329 (para Y.G.) O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde. Agradecemos a Montserrat Samso e Kevin McRoberts pelo generoso apoio à gravação de vídeo.

1. Expressão proteica
<ol><li>Inocular 15 mL de mídia de caldo fantástico (TB) com antibióticos específicos para plasmídeos com células pLysS BL21(DE3) contendo o AcrB expressando plasmídeos em tubos de 50 mL durante a noite a 37 °C com agitação a 250 rpm.</li>
	<li>Verifique a densidade óptica da cultura overnight em 600 nm (OD600) e certifique-se de que ela tenha mais de 2,0.</li>
	<li>Diluir 5 mL de cultura celular em 1 L de mídia de TB contendo antibióticos específicos para plasmídeos e incubar a 37 °C com agitação até OD600=0,8 e, em seguida, induzir com IPTG que tem uma concentração final de 1 mM.</li>
	<li>Realizar indução a 20 °C com agitação por 20 h.</li>
	<li>Pelota para baixo das células usando centrifugação por 15 minutos a 4 °C e 4.000 x g.</li>
</ol>2. Lise celular e isolamento da membrana
<ol><li>Resuspenda a pelota de célula no Buffer A (Tabela 1, use buffer DDM A ou NCMNs Buffer A, dependendo do esquema de purificação a seguir) usando 80 mL para cada 20 g da pelota celular.</li>
	<li>Homogeneize as pelotas de células resuspended usando um homogeneizador do Dounce de vidro a 4 °C ou se à temperatura ambiente certifique-se de colocar no gelo imediatamente depois.</li>
	<li>Transfira a amostra para um béquer metálico no gelo e lise as células carregando-as em um homogeneizador de alta pressão a 4 °C e 1.500 bar.<ol>
<li>Repita o processo de carregar as células no homogeneizador e permitindo que elas passem pelo homogeneizador por 3-4 ciclos ou até que o lise comece a esclarecer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugar o lysate a 15.000 x g para 30 min a 4 °C.</li>
	<li>Colete o supernatante e carregue em tubos ultracentrífugas e centrífuga a 215.000 x g por 1 h a 4 °C.</li>
	<li>Descarte o supernatante e colete as pelotas de membrana dos tubos ultracentrífugas. Armazene qualquer excesso de pelota de membrana a -80 °C.</li>
</ol>3. Preparação de nanopartículas de membrana celular nativa
<ol><li>Resuspend 1 g de pelota de membrana em 10 mL NCMNs Buffer A (Tabela 1).</li>
	<li>Homogeneize a amostra de membrana celular resuspended com um homogeneizador do Dounce de vidro a 20 °C.</li>
	<li>Transfira a amostra de membrana suspensa para um tubo de polipropileno de 50 mL e adicione a solução de estoque de polímeros ativos de membrana e nCMNs buffer A adicional para levar a amostra a uma concentração final de polímero ativo de membrana de 2,5% (w/v) (NCMNP1-1 ou NCMNP5-2). NOTA: As soluções de estoque de polímeros ativos de membrana devem ser feitas em água dupla destilada e podem ser mantidas em concentrações variadas, mas tipicamente 10% (w/v).</li>
	<li>Agite a amostra por 2h a 20 °C.</li>
	<li>Carregue a amostra em uma ultracentrifuagem e gire a 150.000 x g por 1 h a 20 °C.</li>
	<li>Enquanto a amostra está sendo ultra-centrífugas começam a equilibrar uma coluna Ni-NTA de 5 mL com 25 mL de NCMNs Buffer A.</li>
	<li>Colete o supernatante após a ultracentrifugação estiver completa e carregue-o em 5 mL de coluna Ni-NTA à temperatura ambiente com uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min usando uma bomba de seringa.</li>
	<li>Lave linhas de cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC) com o suficiente NCMNs Buffer B(Tabela 1) para lavar completamente o sistema e, em seguida, conectar a coluna à máquina FPLC.</li>
	<li>Lave a coluna com 30 mL de NCMNs Buffer B com uma taxa de fluxo de 1 mL/min e colete o fluxo através.</li>
	<li>Lave a coluna com 30 mL de NCMNs Buffer C(Tabela 1) com uma taxa de fluxo de 1 mL/min e colete o fluxo através.</li>
	<li>Elute a proteína com 20 mL de NCMNs Buffer D(Tabela 1) a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min e colete a amostra usando um coletor de frações e as frações cada uma sendo definidas para 1,0 mL.</li>
	<li>Armazene as amostras de proteína a 4 °C.</li>
	<li>Execute um ensaio de eletroforese de gel SDS-PAGE para verificar as amostras que correspondem aos picos observados no gráfico de eluição FPLC.</li>
</ol>4. Eletroforese de gel SDS-PAGE
<ol><li>Prepare a câmara de fundição fixando o vidro no aparelho de fundição.</li>
	<li>Prepare o gel de separação de 12% de acordo com a receita listada na Tabela 1. NOTA: Uma vez que temed é adicionado o gel irá polimerizar rapidamente, por isso só adicione esta uma vez pronta para derramar o gel.</li>
	<li>Despeje o gel, deixando 2 cm abaixo da parte inferior do pente para o gel de empilhamento.</li>
	<li>Remova as bolhas colocando a parte superior do gel com isopropanol 100% e espere o gel de separação polimerizar.</li>
	<li>Remova o isopropanol e lave os traços do isopropanol com água destilada.</li>
	<li>Prepare o gel de empilhamento de acordo com a receita listada na Tabela 1. NOTA: Uma vez que temed é adicionado o gel irá polimerizar rapidamente, por isso só adicione esta uma vez pronta para derramar o gel.</li>
	<li>Despeje o gel de empilhamento em cima do gel de separação.</li>
	<li>Adicione um pente à câmara para formar os poços e espere que o gel de empilhamento polimerize completamente.</li>
	<li>Coloque 1 μL de 1 M DTT em um tubo de microcentrífuga para cada amostra de fração que precisa ser executada no gel.</li>
	<li>Adicione 7 μL de 4x tampão de carga a cada tubo também.</li>
	<li>Adicione 20 μL de amostra das frações que precisam ser executadas no gel a cada tubo de microcentrifuuagem.</li>
	<li>Vórtice os tubos contendo as amostras.</li>
	<li>Gire os tubos de amostra usando um microcentrifuuge de mesa para 3 s e certifique-se de que toda a amostra tenha retornado ao fundo dos tubos.</li>
	<li>Prepare a célula de eletroforese de gel, fixando um de gel de poliacrilamida de 12% no lugar e preenchendo as câmaras internas e externas da célula com Tampão Tris-acetato-EDTA (TAE)(Tabela 1).</li>
	<li>Coloque o marcador de peso molecular na primeira faixa do gel com o volume apropriado exigido por suas instruções.</li>
	<li>Carregue 28 μL da amostra de cada tubo misturado com DTT e tampão de carga.</li>
	<li>Coloque a tampa da célula de eletroforese em cima da caixa e conecte a tampa na fonte de alimentação.</li>
	<li>Ligue a fonte de alimentação e coloque-a em 100 V e deixe-a funcionar por 20 minutos.</li>
	<li>Depois de 20 minutos, aumente a corrente de alimentação para 140 V e continue a executá-la por mais 30-40 minutos ou até que a faixa de corante tampão de carga atinja a parte inferior do de gel.</li>
	<li>Após completar a mancha de eletroforese e desfoca o gel para visualizar as faixas proteicas contidas dentro do gel.</li>
</ol>5. Purificação de proteínas usando DDM
NOTA: O objetivo de realizar este processo de purificação é servir como um controle para os experimentos que utilizam os polímeros ativos da membrana.
<ol><li>Resuspend 6-10 g de pelota de membrana, a partir da etapa 2.6, em DDM Buffer A (Tabela 1) utilizando 5 mL/g de pelota de membrana.</li>
	<li>Homogeneize a amostra resuspended com um homogeneizador do Dounce de vidro a 4 °C ou se à temperatura ambiente certifique-se de colocar gelo imediatamente depois.</li>
	<li>Transfira a amostra para um tubo de polipropileno de 50 mL e adicione DDM e buffer DDM adicional A para levar a amostra a uma concentração final de 2% DDM.</li>
	<li>Agite a amostra por 2h a 4 °C.</li>
	<li>Carregue a amostra em tubos ultracentrífugas e centrífuga por 1h a 4 °C e 150.000 x g.</li>
	<li>Enquanto a amostra está sendo ultra-centrífugas começam a preparar os 5 mL da coluna Ni-NTA lavando com 25 mL de Buffer DDM A (Tabela 1).</li>
	<li>Depois que a ultracentrifugação estiver completa, colete o supernatante e carregue-o na coluna Ni-NTA de 5 mL a 4 °C com uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min usando uma bomba de seringa.</li>
	<li>Lave as linhas FPLC com buffer DDM suficiente B + 0,05% DDM(Tabela 1) para lavar completamente o sistema e, em seguida, anexar a coluna à máquina FPLC.</li>
	<li>Lave a coluna com 30 mL de DDM Buffer B + DDM 0,05% DDM com uma vazão de 1 mL/min e colete o fluxo através.</li>
	<li>Lave a coluna com 30 mL de DDM Buffer C + 0,05% DDM(Tabela 1) com uma taxa de fluxo de 1 mL/min e colete o fluxo através.</li>
	<li>Elute a proteína com 20 mL de DDM Buffer D + 0,05% DDM(Tabela 1) a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min e colete o fluxo através de um coletor de frações e as frações cada uma sendo definidas para 1,0 mL.</li>
	<li>Selecione as frações que contêm o pico de elução para agrupamento e concentração usando um concentrador centrífugo e centrifugação a 4.000 x g e 4 °C até atingir 500 μL.</li>
	<li>Usando um loop de 500 μL, carregue a amostra na máquina FPLC e, em seguida, na coluna de exclusão de tamanho de 25 mL a 4 °C. Elute utilizando 30 mL de Buffer DDM E + 0,05% DDM(Tabela 1) a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min e coletar como frações com os tamanhos de fração definidos para ser 0,5 mL por fração.</li>
	<li>Pegue as frações e meça a concentração proteica usando absorvância de 280 nm para confirmar a curva UV-Vis do gráfico de eluição FPLC.</li>
	<li>Colete 20 μL de cada fração amostral que corresponda aos picos observados no gráfico de eluição fplc e foi confirmado ser preciso com o teste de absortância.</li>
	<li>Congele o restante dessas frações amostrais usando nitrogênio líquido ou gelo seco em alíquotas desejadas e armazene amostras de proteínas a -80 °C.</li>
	<li>Execute um ensaio de eletroforese de gel SDS-PAGE como descrito anteriormente para verificar as amostras que correspondem aos picos observados no gráfico de eluição FPLC.</li>
</ol>6. Preparação negativa da grade de manchas
<ol><li>Coloque as grades que serão usadas para a preparação da amostra em um slide de vidro envolto em papel filtro com o lado carbono voltado para cima.</li>
	<li>Coloque o deslizamento de vidro com as redes de microscópio eletrônico na câmara de um descarregador de brilho entre os dois eletrodos e substitua a tampa de vidro certificando-se de que está centrada e bem selada.</li>
	<li>Execute a máquina de descarregamento de brilho e certifique-se de que a luz roxa gerada pelo plasma esteja visível.</li>
	<li>Quando a máquina terminar de funcionar, espere até que a câmara tenha atingido a pressão atmosférica para remover a tampa de vidro e, em seguida, retornar o slide com as grades para o banco onde as amostras serão carregadas sobre eles.</li>
	<li>Ajuste a concentração das amostras de proteínas purificadas para cerca de 0,1 mg/mL diluindo a amostra com o buffer apropriado ou concentrando-se usando um concentrador centrífuga.</li>
	<li>Carregue 3,5 μL de amostra de proteína na rede de carbono de 10 nm de espessura e espere por 1 min.</li>
	<li>Remova o líquido da superfície da rede EM com um papel filtro.</li>
	<li>Lave a superfície da rede 3x pegando gotículas de 3 μL de água com a rede e removendo a água da rede com papel filtro entre a coleta de cada gota.</li>
	<li>Lave a superfície da rede 2x pegando gotículas de 3 μL de acetato de urânio fresco e filtrado de 2% e remova as soluções de lavagem na rede com papel filtro entre a captação de cada gota.</li>
	<li>Manche a rede com uma gota de 3 μL de acetato de urânio fresco e filtrado de 2% por 1 min.</li>
	<li>Remova a solução de acetato de urânio na superfície da rede EM com papel filtro e o ar seque a rede por pelo menos 1 min.</li>
	<li>Armazene a grade em uma caixa de grade para uso posterior.</li>
</ol>7. Imagem EM
<ol><li>Coloque a grade preparada no suporte da grade em uma bancada segura.</li>
	<li>Prepare o microscópio colocando os microscópios deguerr em uma caixa de poliestireno e encher o dewar 3/4 cheio de nitrogênio líquido.</li>
	<li>Confirme que a tampa de borracha da janela do microscópio está cobrindo-a e, em seguida, carregue o deguerr o microscópio colocando os fios de cobre na dewar até que ele se encaixe na plataforma.</li>
	<li>Encha o resto da de guerra com nitrogênio líquido e coloque uma tampa em cima da de guerra para cobri-la.</li>
	<li>Ligue a alta tensão, condiciona o microscópio e espere que o microscópio aqueça e estabeleça um nível de vácuo seguro para uso.</li>
	<li>Uma vez que o microscópio esteja pronto abra a válvula da coluna e confirme que o feixe está presente removendo a tampa de borracha na janela do microscópio.</li>
	<li>Verifique a estigma da viga espalhando-se para dentro e para fora ajustando a intensidade do feixe. Se o astigmatismo estiver presente, o feixe terá uma forma elíptica à medida que se afasta do cruzamento e o feixe deve ser a mesma forma oval em ambos os lados.</li>
	<li>Ajuste os binóculos do microscópio para ser a altura e distância certas de acordo com os olhos do observador.</li>
	<li>Verifique o posicionamento do feixe para os modos De Pesquisa, Focoe Exposição pedalando pelos três modos até que o feixe esteja central em cada um.</li>
	<li>Feche a válvula da coluna e prossiga para carregar o suporte da grade no microscópio eletrônico.</li>
	<li>Ajuste o microscópio à altura eucêntrica usando o recurso oscilador dos microscópios e ajustando o movimento do estágio usando o eixo Z até que não haja movimento lado a lado da amostra no centro.</li>
	<li>Usando o modo de pesquisa de baixa dose no microscópio procure na grade uma área desejável de contraste razoável com moléculas de amostra presentes para se concentrar na amostra.</li>
	<li>Concentre-se na amostra no modo Focus usando um tamanho de passo alto até que a amostra seja vista e, em seguida, diminua as etapas para encontrar o nível de foco correto.</li>
	<li>Zero e branco o feixe e, em seguida, certifique-se de que a almofada de borracha está cobrindo a janela do microscópio.</li>
	<li>Usando o modo Exposição, pegue a imagem da área de grade desejada para uma exposição de 1 s a uma ampliação de 62.000x e verifique a imagem obtida.</li>
	<li>Quando feito a imagem de uma grade feche as válvulas da coluna e remova o suporte da grade da coluna.</li>
	<li>Quando terminou a imagem todas as grades de juros desligam o microscópio desligando a energia do filamento e removendo o de guerra de nitrogênio líquido do microscópio.</li>
	<li>Coloque algo para absorver umidade no suporte onde o dewar sentou-se para pegar condensação das bobinas de cobre do microscópio.</li>
	<li>Ative o modo Ciclo Cryo e certifique-se de que a bomba turbo está desligada.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berggard, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li><li>Huang, H., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+recall+estimates+for+two-hybrid+screens.">Precision and recall estimates for two-hybrid screens.</a> Bioinformatics. 25 (3), 372-378 (2009).</li><li>Serebriiskii, I. G., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-hybrid+system+and+false+positives.+Approaches+to+detection+and+elimination.">Two-hybrid system and false positives. Approaches to detection and elimination.</a> Methods in Molecular Biology. 177, 123-134 (2001).</li><li>Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+complexes+using+mass+spectrometry.">Analysis of protein complexes using mass spectrometry.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (8), 645-654 (2007).</li><li>Ngounou Wetie, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+stable+and+transient+protein-protein+interactions:+Past,+present,+and+future.">Investigation of stable and transient protein-protein interactions: Past, present, and future.</a> Proteomics. 13 (3-4), 538-557 (2013).</li><li>Schaufele, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+the+quantitative+accuracy+and+reproducibility+of+Forster+resonance+energy+transfer+measurement+for+screening+by+high+throughput+widefield+microscopy.">Maximizing the quantitative accuracy and reproducibility of Forster resonance energy transfer measurement for screening by high throughput widefield microscopy.</a> Methods. 66 (2), 188-199 (2014).</li><li>Berney, C., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+or+no+FRET:+a+quantitative+comparison.">FRET or no FRET: a quantitative comparison.</a> Biophysical Journal. 84 (6), 3992-4010 (2003).</li><li>Almen, M. S., Nordstrom, K. J., Fredriksson, R., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+human+membrane+proteome:+a+majority+of+the+human+membrane+proteins+can+be+classified+according+to+function+and+evolutionary+origin.">Mapping the human membrane proteome: a majority of the human membrane proteins can be classified according to function and evolutionary origin.</a> BMC Biology. 7, 50 (2009).</li><li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+drug+targets+are+there.">How many drug targets are there.</a> Nature Reviews in Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).</li><li>Berman, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Data+Bank.">The Protein Data Bank.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).</li><li>Overduin, M., Esmaili, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memtein:+The+fundamental+unit+of+membrane-protein+structure+and+function.">Memtein: The fundamental unit of membrane-protein structure and function.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 218, 73-84 (2019).</li><li>Qiu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+activity+of+lipid+bilayer+within+a+membrane-protein+transporter.">Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 115 (51), 12985-12990 (2018).</li><li>Knowles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins+solubilized+intact+in+lipid+containing+nanoparticles+bounded+by+styrene+maleic+acid+copolymer.">Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (22), 7484-7485 (2009).</li><li>Xue, M., Cheng, L., Faustino, I., Guo, W., Marrink, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+Lipid+Nanodisk+Formation+by+Styrene-Maleic+Acid+Copolymers.">Molecular Mechanism of Lipid Nanodisk Formation by Styrene-Maleic Acid Copolymers.</a> Biophysical Journal. 115 (3), 494-502 (2018).</li><li>Parmar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+SMALP+platform+to+determine+a+sub-nm+single+particle+cryo-EM+membrane+protein+structure.">Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure.</a> Biochimica and Biophysica Acta Biomembrames. 1860 (2), 378-383 (2018).</li><li>Yu, L., Lu, W., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AcrB+trimer+stability+and+efflux+activity,+insight+from+mutagenesis+studies.">AcrB trimer stability and efflux activity, insight from mutagenesis studies.</a> PLoS One. 6 (12), 28390 (2011).</li><li>Broussard, J. A., Rappaz, B., Webb, D. J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy+as+demonstrated+by+measuring+the+activation+of+the+serine/threonine+kinase+Akt.">Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt.</a> Nature Protocols. 8 (2), 265-281 (2013).</li><li>Ma, L., Yang, F., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+in+protein+studies.">Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).</li><li>Sachl, R., Humpolickova, J., Stefl, M., Johansson, L. B., Hof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+electronic+energy+transfer+in+the+determination+of+lipid+nanodomain+sizes.">Limitations of electronic energy transfer in the determination of lipid nanodomain sizes.</a> Biophysical Journal. 101 (11), 60-62 (2011).</li><li>Woehler, A., Wlodarczyk, J., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal/noise+analysis+of+FRET-based+sensors.">Signal/noise analysis of FRET-based sensors.</a> Biophysical Journal. 99 (7), 2344-2354 (2010).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+in+vitro+and+in+vivo+oligomeric+states+of+a+wild+type+and+mutant+trimeric+inner+membrane+multidrug+transporter.">Comparison of in vitro and in vivo oligomeric states of a wild type and mutant trimeric inner membrane multidrug transporter.</a> Biochemical and Biophysical Reports. 16, 122-129 (2018).</li><li>Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+on+Negative+Stain+Electron+Microscopy+Methods:+Tools+for+Tackling+Challenging+Systems.">Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).</li><li>Lu, W., Zhong, M., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+AcrB+Subunit+Precedes+Trimerization.">Folding of AcrB Subunit Precedes Trimerization.</a> Journal of Molecular Biology. 411 (1), 264-274 (2011).</li><li>Lebon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structure and Function of GPCRs. , 229-230 (2019).</li><li>Rames, M., Yu, Y., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+negative+staining:+a+high-throughput+protocol+for+examining+small+and+asymmetric+protein+structure+by+electron+microscopy.">Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).</li><li>Lee, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+detergent-free+isolation+of+membrane+proteins+in+their+local+lipid+environment.">A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).</li><li>Hall, S. C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acid-compatible+co-polymer+for+the+solubilization+of+membranes+and+proteins+into+lipid+bilayer-containing+nanoparticles.">An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles.</a> Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).</li><li>Oluwole, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+of+Membrane+Proteins+into+Functional+Lipid-Bilayer+Nanodiscs+Using+a+Diisobutylene/Maleic+Acid+Copolymer.">Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer.</a> Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).</li></ol>

Y.G é listado como inventor do polímero ativo de membrana NCMNP5-2 e sistema NCMN.

As interações proteína-proteína são importantes para a integridade da estrutura e função das proteínas da membrana. Muitas abordagens foram desenvolvidas para investigar interações proteína-proteína. Quando comparadas com proteínas solúveis, as proteínas de membrana e seus PPIs são mais difíceis de estudar devido às propriedades intrínsecas únicas das proteínas da membrana. Essa dificuldade vem principalmente da exigência de proteínas de membrana para serem incorporadas em um ambiente nativo de bic...

As interações proteína-proteína (PPI) desempenham papéis fundamentais ao longo da biologia, desde a manutenção da estrutura e função das proteínas até a regulação de sistemas inteiros. Os PPIs vêm de muitas formas diferentes e podem ser categorizados com base em que tipos de interações formam. Uma dessas categorizações é homooligomerica ou heterooligomerica, baseada em se as interações são entre subunidades idênticas ou proteínas diferentes agindo como subunidades. Outra categorização baseia-se na força da interação se as interações levarem à formação de complexos estáveis ou estados complexos transitórios. Informações estruturais sobre os PPIs entre proteínas são cruciais na compreensão do mecanismo pelo qual as proteínas exercem sua função. Estima-se que mais de 80% das proteínas dependem de formação complexa para exercer suas funções funcionais1. Dado que a porcentagem de proteínas observadas para depender de PPIs para o bom funcionamento inato seu significado na biologia é facilmente aparente, mas ser capaz de investigar adequadamente as proteínas que se envolvem nessas interações tem permanecido desafiador devido a limitações nas técnicas disponíveis para observar experimentalmente quando as proteínas estão formando PPIs.
Há um alto grau de discordância entre os resultados de muitos PPIs experimentalmente determinados devido à alta quantidade de ruídos, falsos positivos e falsos negativos que são derivados de muitas das técnicas de determinação do PPI atualmente disponíveis. Isto é particularmente para o sistema de leveduras dois híbridos (Y2H), espectrometria tandem affinity purificação-massa (TAP-MS) e transferência de energia de ressonância fluorescência (FRET), que representam três dos métodos mais utilizados para a determinação do PPI2,3,4,5,6,7. Em comparação, técnicas de biologia estrutural proteica, como ressonância magnética nuclear (RMN), cristalografia de raios-X e microscopia eletrônica (EM), podem ser usadas para obter informações estruturais de alta resolução sobre interações proteína-proteína até o nível atômico e permitir a confirmação visual direta das interações ocorridas para uma proteína alvo de interesse. Todas as técnicas de pesquisa de determinação de PPI não estruturadas atualmente disponíveis (por exemplo, Y2H, TAP-MS e FRET) não têm essa capacidade e, além disso, sofrem com dificuldade em identificar interações fracas e transitórias entre as proteínas5. Essas deficiências são ainda mais aprimoradas ao estudar proteínas de membrana devido à complexidade adicional trazida pela variável adicional do ambiente lipídico que influencia a formação de estrutura quaternária adequada e montagem complexa heteromica.
As proteínas da membrana compõem uma grande parte do proteome e são conhecidas por desempenhar muitos papéis cruciais no bom funcionamento celular dentro de todos os organismos vivos. Apesar de as proteínas de membrana serem estimadas em 27% do genoma humano e constituir ~60% de todos os alvos atuais de medicamentos, há uma anomalia importante no número de modelos resolvidos para proteínas de membrana que compõem apenas ~2,2% de todas as estruturas proteicas publicadas8,9,10. A principal causa da discrepância na disponibilidade de informações estruturais está nas propriedades intrínsecas das próprias proteínas de membrana. Devido à sua baixa solubilidade, dependência de interações com um ambiente lipídico para manter a estrutura e a função nativas, e várias propriedades físico-químicas da própria membrana lipídica, as proteínas da membrana continuam a representar um problema substancial ao implementar técnicas de biologia estrutural para estudá-las. Dessas propriedades intrínsecas, a mais importante para obter informações estruturais precisas é a exigência de ter interações com seu ambiente lipídico natural para que eles mantenham sua estrutura e função nativas. O ambiente lipídico é uma parte tão integral da estrutura e função das proteínas de membrana que o conceito de memteina (uma combinação das palavras membrana e proteína) tem sido proposto como a unidade fundamental da estrutura e função membrana-proteína11. Apesar da importância das interações lipídica-proteínas, as técnicas de determinação do PPI atualmente disponíveis na estrutura exigem que as proteínas que estão sendo estudadas sejam solúveis ou solubilizadas com detergentes. A exposição a detergentes severos pode desnaturar as proteínas ou causar falsos positivos e negativos devido à delipidação, que pode induzir agregação, desnaturação de proteínas, dissociação de interações não covalentes e formação de estados oligomeóricos artificiais. Devido à necessidade de manter um ambiente lipídico natural para determinação precisa do estado oligomerico nativo das proteínas da membrana, desenvolvemos um sistema de nanopartículas de membrana celular nativa (NCMNs)12 com base no método Styrene Maleic Acid Lipid Particles (SMALP)13.
O SMALP usa copolímero de ácido estireno macho como polímero ativo de membrana para extrair e solubilizar proteínas de membrana. Poly (Styrene-co-Maleic Acid) (SMA) é um polímero anfílico único devido à sua moiety hidrofóbica e diametralmente oposta moiety ácido hidrofílico masculino. Ele forma nanopartículas por adsorviar, desestabilizar e interromper a membrana celular em um mecanismo dependente de pH14. Esta atividade funcional de SMA é o que permite que ela seja utilizada como um sistema livre de detergente para extração e solubilização de proteínas de membrana. O sistema NCMN é distinto do sistema SMALP em vários aspectos. A característica mais única do sistema NCMN é que ele possui uma biblioteca de polímeros ativos de membrana com uma infinidade de polímeros que têm propriedades únicas que os tornam adequados para o isolamento de muitas proteínas de membrana diferentes que requerem condições diferentes para estabilidade e funcionamento nativo. O sistema NCMN também tem protocolos diferentes em comparação com o método SMALP quando se trata de preparar as nanopartículas. Um exemplo é que os NCMNs utilizam uma purificação de coluna de afinidade de níquel de um passo único para determinação da estrutura de alta resolução; o efeito desses diferentes protocolos pode ser observado ao comparar o protocolo NCMNs, que gerou estruturas AcrB 3.2 e 3.0 Å crio-EM, com estudo semelhante utilizando o método SMALP, que resultou em uma estrutura crio-EM AcrB em uma resolução12,15. Essas características únicas do sistema NCMN são as melhorias feitas no método SMALP previamente estabelecido e o tornam um candidato ideal para o estudo de PPIs.
O transporte multidroug efflux AcrB existe como homotrimer funcional em E. coli12. Uma análise mutagênica sugeriu que uma única mutação de ponto P223G, localizada em um loop responsável pela estabilidade do aparador AcrB, desestabiliza o estado do aparador e produz um monômero AcrB quando preparado com o detergente DDM, que poderia ser detectado com eletroforese de gel azul nativo16. No entanto, a análise FRET do mutante AcrB-P223G sugeriu que quando no ambiente de bicamadas lipídicas da membrana celular nativa, a maioria dos mutantes AcrB-P223G ainda existiam como um aparador e que os níveis de expressão tanto para o tipo selvagem AcrB quanto para AcrB-P223G são semelhantes. No entanto, apesar dos resultados da análise do FRET, um ensaio de atividade para o transportador mutante mostrou que a atividade diminuiu drasticamente quando comparada com o tipo selvagem16. Embora a tecnologia FRET tenha sido popularmente utilizada para a análise de interações proteína-proteína, pesquisas têm mostrado que ela pode frequentemente dar falsos positivos17,18,19,20.
Recentemente, foram determinadas estruturas crio-EM de alta resolução do aparador AcrB que mostraram a interação da AcrB com sua bicamada lipídica de membrana celular nativa associada através do uso das NCMNs12. Em princípio, os NCMNs podem ser facilmente utilizados para a análise de interações proteína-proteína encontradas na membrana celular nativa. Em um teste deste sistema, foram realizados experimentos para observar diretamente o estado oligomerico de AcrB-P223G com o uso de nanopartículas de membrana celular nativa e microscopia eletrônica de coloração negativa. Para comparar com as nanopartículas AcrB do tipo selvagem, utilizamos a mesma membrana polímera ativa (SMA2000 fabricada em nosso laboratório, que é indexada como NCMNP1-1 na biblioteca NCMN) usada para determinação de estrutura crio-EM de alta resolução de AcrB e polímeros alternativos encontrados na biblioteca NCMNs12. Com base nos resultados relatados anteriormente, esperava-se que a maioria do mutante AcrB-P223G existisse na forma de nanopartículas de membrana celular nativa trimeric21. No entanto, não foram encontrados aparadores AcrB presentes na amostra, como os observados com o tipo selvagem AcrB. Isso sugere que a maioria do AcrB-P223G não forma aparadores na membrana celular nativa como sugerido anteriormente.
Aqui relatamos uma análise detalhada do mutante E. coli AcrB-P223G em comparação com o tipo selvagem E. coli AcrB usando as NCMNs. Este estudo de caso da AcrB sugere que as NCMNs são um bom sistema para análise de interação proteína-proteína.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A38S-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>C-105-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (Dithiothreitol) (&#62; 99% pure) Protease free</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>DTT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>17525 1 KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>K-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AA3622636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-dimethylethylenediamine (EDTA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.03779.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCMNS-P5-2</td>
			<td>Not commercially available yet</td>
			<td>Submit request for obtaining to corresponding author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Dual Color Standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA2000</td>
			<td>Cray Valley</td>
			<td>Submit request for obtaining to corresponding author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>TCEP25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth Media</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75856 1 KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Ambinter</td>
			<td>Amb22348393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-26S XPI</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B14538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti JXN-30</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B34193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Electron Microscope Grids (10 nm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF300-Cu-TH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Con-Torque Tissue Homogenizer</td>
			<td>Eberbach</td>
			<td>E7265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning LSE Mini Microcentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>07-203-954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Avestin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction Collector F9-R</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29003875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-8004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000 Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>PN LL-IM-12AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000S-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>358013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump</td>
			<td>Razel Scientific Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai F20 200kV</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA pure 25 L1 FPLC</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)pLysS Cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C606003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP 5 ml Column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17524802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-24a</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>69749-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

native cell membrane nanoparticles system for membrane protein-protein interaction analysis

As interações proteína-proteína nos sistemas de membrana celular desempenham papéis cruciais em uma ampla gama de processos biológicos, desde interações célula-célula até transdução de sinais; desde a detecção de sinais ambientais até a resposta biológica; da regulação metabólica ao controle do desenvolvimento. Informações estruturais precisas das interações proteína-proteína são cruciais para a compreensão dos mecanismos moleculares dos complexos proteicos de membrana e para o desenho de moléculas altamente específicas para modular essas proteínas. Muitas abordagens in vivo e in vitro foram desenvolvidas para a detecção e análise de interações proteína-proteína. Entre eles, a abordagem da biologia estrutural é única na prática de fornecer informações estruturais diretas de interações proteína-proteína no nível atômico. No entanto, a biologia estrutural da proteína da membrana atual ainda está em grande parte limitada a métodos à base de detergente. A principal desvantagem dos métodos à base de detergente é que eles frequentemente dissociam ou desnaturam complexos proteicos de membrana de desnatura uma vez que seu ambiente de bicamadas lipídicas nativas é removido por moléculas de detergente. Estamos desenvolvendo um sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para biologia estrutural de proteína de membrana. Aqui, demonstramos o uso desse sistema na análise de interações proteína-proteína na membrana celular com estudo de caso do estado oligomerico da AcrB.

Utilizando os procedimentos aqui apresentados, foram purificadas amostras do tipo selvagem E. coli AcrB e E. coli mutante AcrB-P223G. As amostras foram então adsorvidas a redes de microscopia eletrônica de manchas negativas de carbono e manchadas usando acetato de urano com o método de mancha lateral22. Imagens de manchas negativas foram coletadas por meio de microscopia eletrônica de transmissão. A imagem de mancha negativa para a amostra do tipo selvagem AcrB purificada co...

Watch this Scientific Journal Video about Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis at JoVE.com

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Apresentado aqui é um protocolo para a determinação do estado oligomerico de proteínas de membrana que utiliza um sistema de nanopartículas de membrana celular nativa em conjunto com microscopia eletrônica.

Sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para análise de interação proteína-proteína de membrana

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

native-cell-membrane-nanoparticles-system-for-membrane-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

5.9K visualizações.  Virginia Commonwealth University. Apresentado aqui é um protocolo para a determinação do estado oligomerico de proteínas de membrana que utiliza um sistema de nanopartículas de membrana celular nativa em conjunto com microscopia eletrônica.

Vídeo: Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

Método para a identificação de molécula pequena inibidores da interacção proteína-proteína entre HCN1 e TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Bioquímica

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

FRET de alta precisão em nível de molécula única para determinação de estrutura de biomoléculas

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between proteins such as transcription factors (TFs) and their DNA target. The method presented here utilizes the underlying concept of the Y1H but is modified further to study and validate protein complexes binding to their target DNA. Hence, it is referred to as the modified yeast one-hybrid (Y1.5H) assay. This assay is cost effective and can be easily performed in a regular laboratory setting. Albeit using a heterologous system, the described method could be a valuable tool to test and validate the heteromeric protein complex binding to their DNA target(s) for functional genomics in any system of study, especially plant genomics.

The modified yeast one-hybrid assay described here is an extension of the classical yeast one-hybrid (Y1H) assay to study and validate the heteromeric protein complex-DNA interaction in a heterologous system for any functional genomics study.

Um Sistema Híbrido de Levedura-Um Modificado para Estudos de Interação de DNA de Complexo de Proteínas Heteroméricas

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

Peptídeos biotinylated célula-penetrante para estudar interações da proteína-proteína intracelular

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

Análise de complexos de proteínas de membrana tilacoides por electroforese em Gel azul nativo

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Um ensaio de espectroscopia de flutuação de fluorescência das interações da proteína-proteína em contatos do celular

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions largely depend on intracellular protein&#8211;protein interactions. Therefore, research regarding these interactions is indispensable to facilitating the understanding of physiologic processes. Co-precipitation of associated proteins, followed by mass spectrometry (MS) analysis, enables the identification of novel protein interactions. In this study, we have provided details of the novel technique of immunoprecipitation-liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis combined with on-membrane digestion for the analysis of protein&#8211;protein interactions. This technique is suitable for crude immunoprecipitants and can improve the throughput of proteomic analyses. Tagged recombinant proteins were precipitated using specific antibodies; next, immunoprecipitants blotted onto polyvinylidene difluoride membrane pieces were subjected to reductive alkylation. Following trypsinization, the digested protein residues were analyzed using LC-MS/MS. Using this technique, we were able to identify several candidate associated proteins. Thus, this method is convenient and useful for the characterization of novel protein&#8211;protein interactions.

Here, we present a protocol for an on-membrane digestion technique for the preparation of samples for mass spectrometry. This technique facilitates the convenient analysis of protein&#8211;protein interactions.

Avaliação de interações proteína-proteína usando uma técnica de digestão na membrana

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

Caracterização de transportadores de membrana por expressão heterologous em E. coli e produção de vesículas de membrana

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial membrane is a challenging environment to distinguish regulatory factors. Experimental control of protein and lipid components can help answer specific questions of regulation. Yet, quantitative manipulation of these factors is challenging in cellular assays. To investigate the molecular mechanism of mitochondria inner-membrane fusion, we introduced an in vitro reconstitution platform that mimics the lipid environment of the mitochondrial inner-membrane. Here we describe detailed steps for preparing lipid bilayers and reconstituting mitochondrial membrane proteins. The platform allowed analysis of intermediates in mitochondrial inner-membrane fusion, and the kinetics for individual transitions, in a quantitative manner. This protocol describes the fabrication of bilayers with asymmetric lipid composition and describes general considerations for reconstituting transmembrane proteins into a cushioned bilayer. The method may be applied to study other membrane systems.

Mitochondrial fusion is an important homeostatic reaction underlying mitochondrial dynamics. Described here is an in vitro reconstitution system to study mitochondrial inner-membrane fusion that can resolve membrane tethering, docking, hemifusion, and pore opening. The versatility of this approach in exploring cell membrane systems is discussed.

Uma plataforma de membrana modelo para reconstituir a dinâmica da membrana mitocondrial

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...