Diese Forschung wurde vom VCU Startup Fund (zu Y.G.) und dem National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Award-Nummer R01GM132329 (zu Y.G.) unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar. Wir danken Montserrat Samso und Kevin McRoberts für ihre großzügige Unterstützung bei der Videoaufnahme.

1. Proteinexpression
<ol><li>Impfung von 15 ml Terrific Broth (TB) Medien mit plasmidspezifischen Antibiotika mit BL21(DE3) pLysS-Zellen, die die AcrB-Exzids in 50 ml-Röhrchen über Nacht bei 37 °C mit Schütteln bei 250 U/min exemitenken.</li>
	<li>Überprüfen Sie die optische Dichte der Nachtkultur bei 600 nm (OD600) und stellen Sie sicher, dass sie über 2,0 liegt.</li>
	<li>5 ml Zellkultur in 1 L TB-Medien verdünnen, die plasmidspezifische Antibiotika enthalten, und bei 37 °C mit Schütteln bis OD600=0,8 inkubieren und dann mit IPTG induzieren, das eine Endkonzentration von 1 mM aufweist.</li>
	<li>Induktion bei 20 °C mit Schütteln für 20 h durchführen.</li>
	<li>Pellet die Zellen mit Zentrifugation für 15 min bei 4 °C und 4.000 x g.</li>
</ol>2. Zelllyse und Membranisolierung
<ol><li>Setzen Sie das Zellpellet in Puffer A(Tabelle 1, Verwenden Sie DDM-Puffer A oder NCMNs-Puffer A je nach dem zu folgenden Reinigungsschema) mit 80 ml für jeweils 20 g des Zellpellets aus.</li>
	<li>Homogenisieren Sie die resuspendierten Zellpellets mit einem Glas-Dounce-Homogenisator bei 4 °C oder bei Raumtemperatur sofort danach auf Eis legen.</li>
	<li>Die Probe in ein Metallbecher glasen auf Eis geben und die Zellen durch Beladen in einen Hochdruckhomogenisator bei 4 °C und 1.500 bar lysieren.<ol>
<li>Wiederholen Sie den Vorgang des Ladens der Zellen in den Homogenisator und lassen Sie sie durch den Homogenisator für 3-4 Zyklen passieren oder bis das Lysat beginnt zu klären.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Lysat bei 15.000 x g für 30 min bei 4 °C.</li>
	<li>Den Überstand sammeln und bei 4 °C bei 215.000 x g bei 215.000 x g in Ultrazentrifugenrohre und Zentrifuge laden.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand und sammeln Sie die Membranpellets aus den Ultrazentrifugenrohren. Überschüssiges Membranpellet bei -80 °C lagern.</li>
</ol>3. Herstellung von nativen Zellmembran-Nanopartikeln
<ol><li>1 g Membranpellet in 10 ml NCMNs Puffer A (Tabelle 1) aufheben</li>
	<li>Homogenisieren Sie die resuspendierte Zellmembranprobe mit einem Glas-Dounce-Homogenisator bei 20 °C.</li>
	<li>Übertragen Sie die suspendierte Membranprobe auf ein 50 ml Polypropylenrohr und fügen Sie membranaktive Polymere Lagerlösung und zusätzliche NCMNs Puffer A hinzu, um die Probe auf eine Endkonzentration von 2,5% (w/v) Membran-aktivem Polymer (NCMNP1-1 oder NCMNP5-2) zu bringen. HINWEIS: Lagerlösungen von membranaktiven Polymeren sollten in doppelt destilliertem Wasser hergestellt werden und können in unterschiedlichen Konzentrationen gehalten werden, in der Regel jedoch 10 % (w/v).</li>
	<li>Schütteln Sie die Probe für 2 h bei 20 °C.</li>
	<li>Die Probe in eine Ultrazentrifuge laden und bei 150.000 x g bei 1 h bei 20 °C drehen.</li>
	<li>Während die Probe ultrazentrifugiert wird, beginnen Sie, eine 5 ml Ni-NTA-Säule mit 25 ml NCMNs Puffer A auszubalancieren.</li>
	<li>Sammeln Sie den Überstand, nachdem die Ultrazentrifugation abgeschlossen ist, und laden Sie ihn mit einer Spritzenpumpe auf 5 ml Ni-NTA-Säule bei Raumtemperatur mit einer Durchflussrate von 0,5 ml/min.</li>
	<li>Waschen Sie schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC) Linien mit genügend NCMNs Puffer B (Tabelle 1), um das System vollständig zu spülen und dann die Säule mit der FPLC-Maschine zu verbinden.</li>
	<li>Waschen Sie die Säule mit 30 ml NCMNs Puffer B mit einer Durchflussrate von 1 ml/min und sammeln Sie den Durchfluss durch.</li>
	<li>Waschen Sie die Säule mit 30 ml NCMNs Puffer C (Tabelle 1) mit einer Durchflussrate von 1 ml/min und sammeln Sie den Durchfluss durch.</li>
	<li>Das Protein mit 20 ml NCMNs Puffer D (Tabelle 1) mit einer Durchflussrate von 0,5 ml/min und die Probe mit einem Fraktionskollektor und den jeweils auf 1,0 ml eingestellten Fraktionen zu sammeln.</li>
	<li>Bewahren Sie die Proteinproben bei 4 °C auf.</li>
	<li>Führen Sie einen SDS-PAGE-Gelelektrophorese-Assay durch, um die Proben zu überprüfen, die den im FPLC-Elutionsdiagramm beobachteten Spitzen entsprechen.</li>
</ol>4. SDS-PAGE Gelelektrophorese
<ol><li>Bereiten Sie die Gießkammer vor, indem Sie das Glas an das Gießgerät spannen.</li>
	<li>Bereiten Sie das 12% Trenngel nach dem in Tabelle 1aufgeführten Rezept vor. HINWEIS: Sobald TEMED hinzugefügt wurde, wird das Gel schnell polymerisieren, so fügen Sie diese nur einmal bereit, das Gel zu gießen.</li>
	<li>Gießen Sie das Gel, so dass 2 cm unter der Unterseite des Kamms für das Stapelgel.</li>
	<li>Entfernen Sie alle Blasen, indem Sie die Oberseite des Gels mit 100% Isopropanol schichten und warten, bis das Trenngel polymerisiert ist.</li>
	<li>Entfernen Sie das Isopropanol und waschen Sie alle Spuren des Isopropanols mit destilliertem Wasser aus.</li>
	<li>Bereiten Sie das Stapelgel gemäß dem in Tabelle 1aufgeführten Rezept vor. HINWEIS: Sobald TEMED hinzugefügt wurde, wird das Gel schnell polymerisieren, so fügen Sie diese nur einmal bereit, das Gel zu gießen.</li>
	<li>Gießen Sie das Stapelgel auf das Trenngel.</li>
	<li>Fügen Sie einen Kamm in die Kammer, um die Brunnen zu bilden und warten, bis das Stapelgel vollständig polymerisiert.</li>
	<li>Legen Sie 1 L 1 M DTT in ein Mikrozentrifugenrohr für jede Bruchprobe, die auf dem Gel ausgeführt werden muss.</li>
	<li>Fügen Sie jedem Rohr auch 7 l 4x Ladepuffer hinzu.</li>
	<li>Fügen Sie jedem Mikrozentrifugenrohr 20 L Proben aus den Fraktionen hinzu, die auf dem Gel ausgeführt werden müssen.</li>
	<li>Wirbel die Rohre, die die Proben enthalten.</li>
	<li>Drehen Sie die Probenröhrchen mit einer Tisch-Mikrozentrifuge für 3 s nach unten und stellen Sie sicher, dass die gesamte Probe auf den Boden der Rohre zurückgekehrt ist.</li>
	<li>Bereiten Sie die Gelelektrophoresezelle vor, indem Sie eine 12% Polyacrylamid-Gelkassette einstecken und die inneren und äußeren Kammern der Zelle mit Tris-Acetat-EDTA (TAE) Buffer füllen (Tabelle 1).</li>
	<li>Laden Sie die Molekulargewichtsmarkierung mit dem entsprechenden Volumen, das in den Anweisungen vorgeschrieben ist, in die erste Spur des Gels ein.</li>
	<li>Laden Sie 28 l der Probe aus jedem Rohr gemischt mit DTT und Ladepuffer.</li>
	<li>Legen Sie den Deckel der Elektrophoresezelle auf die Box und stecken Sie den Deckel in das Netzteil.</li>
	<li>Schalten Sie das Netzteil ein und stellen Sie es auf 100 V ein und lassen Sie es 20 min laufen.</li>
	<li>Nach 20 min erhöhen Sie den Netzstrom auf 140 V und führen Sie ihn weitere 30-40 min laufen oder bis das Band des Ladepufferfarbstoffs den Boden der Gelkassette erreicht.</li>
	<li>Nach Abschluss der Elektrophorese Fleck und Entfleckung des Gels, um die Proteinbänder im Gel enthalten zu visualisieren.</li>
</ol>5. Proteinreinigung mit DDM
HINWEIS: Der Zweck dieser Reinigung ist es, als Kontrolle für die Experimente unter Verwendung der membranaktiven Polymere zu dienen.
<ol><li>6-10 g Membranpellet ab Schritt 2.6 in DDM-Puffer A (Tabelle 1) mit 5 ml/g Membranpellet aufheben.</li>
	<li>Homogenisieren Sie die resuspendierte Probe mit einem Glas-Dounce-Homogenisator bei 4 °C oder wenn bei Raumtemperatur sofort danach auf Eis gelegt werden.</li>
	<li>Die Probe in ein 50 ml Polypropylenrohr übertragen und DDM und zusätzlichen DDM-Puffer A hinzufügen, um die Probe auf eine Endkonzentration von 2% DDM zu bringen.</li>
	<li>Schütteln Sie die Probe für 2 h bei 4 °C.</li>
	<li>Die Probe in Ultrazentrifugenrohre und Zentrifuge für 1 h bei 4 °C und 150.000 x gladen.</li>
	<li>Während die Probe ultrazentrifugiert wird, beginnen Sie mit der Vorbereitung der 5 ml Ni-NTA-Säule durch Waschen mit 25 ml DDM-Puffer A (Tabelle 1).</li>
	<li>Nach Abschluss der Ultrazentrifugation den Überstand sammeln und mit einer Spritzenpumpe bei 4 °C bei 4 °C auf die 5 ml Ni-NTA-Säule laden.</li>
	<li>Waschen Sie FPLC-Leitungen mit genügend DDM-Puffer B + 0,05% DDM (Tabelle 1), um das System vollständig zu spülen und dann die Säule an die FPLC-Maschine anzuhängen.</li>
	<li>Waschen Sie die Säule mit 30 ml DDM-Puffer B + 0,05% DDM mit einer Durchflussrate von 1 ml/min und sammeln Sie den Durchfluss durch.</li>
	<li>Waschen Sie die Säule mit 30 ml DDM-Puffer C + 0,05% DDM (Tabelle 1) mit einer Durchflussrate von 1 ml/min und sammeln Sie den Durchfluss durch.</li>
	<li>Das Protein mit 20 ml DDM-Puffer D + 0,05% DDM (Tabelle 1) bei einer Durchflussrate von 0,5 ml/min zu versenken und den Durchfluss mit einem Bruchkollektor und den jeweils auf 1,0 ml eingestellten Fraktionen zu sammeln.</li>
	<li>Wählen Sie die Fraktionen, die den Elutionsspitzenfürst für die Pooling- und Konzentrationsspitze enthalten, mit einem Zentrifugalkonzentrator und Zentrifugieren bei 4.000 x g und 4 °C bis zu 500 l.</li>
	<li>Laden Sie die Probe mit einer 500-L-Schleife in die FPLC-Maschine und dann bei 4 °C in die 25 ml-Aussperrsäule. Elute mit 30 ml DDM Puffer E + 0,05% DDM (Tabelle 1) bei einer Durchflussrate von 0,5 ml/min und sammeln als Brüche mit den Bruchgrößen auf 0,5 ml pro Bruch eingestellt.</li>
	<li>Nehmen Sie die Fraktionen und messen Sie die Proteinkonzentration mit 280 nm Absorption, um die UV-Vis-Kurve aus dem FPLC-Elutionsdiagramm zu bestätigen.</li>
	<li>Sammeln Sie 20 l aus jeder Stichprobenfraktion, die den im FPLC-Elutionsdiagramm beobachteten Spitzen entspricht und mit dem Absorptionstest als genau bestätigt wurde.</li>
	<li>Den Rest dieser Probenfraktionen mit flüssigem Stickstoff oder Trockeneis in den gewünschten Aliquots einfrieren und Proteinproben bei -80 °C lagern.</li>
	<li>Führen Sie einen SDS-PAGE-Gelelektrophorese-Assay durch, wie zuvor beschrieben, um die Proben zu überprüfen, die den im FPLC-Elutionsdiagramm beobachteten Spitzen entsprechen.</li>
</ol>6. Negative Fleckengittervorbereitung
<ol><li>Platzieren Sie die Gitter, die für die Probenvorbereitung verwendet werden, auf einem in Filterpapier eingewickelten Glasschlitten mit nach oben gerichteter Carbonseite.</li>
	<li>Legen Sie den Glasschlitten mit den Elektronenmikroskopgittern in die Kammer eines Glüh-Entladers zwischen den beiden Elektroden und ersetzen Sie den Glasdeckel, um sicherzustellen, dass er zentriert und gut versiegelt ist.</li>
	<li>Führen Sie die Glühlöschmaschine aus und stellen Sie sicher, dass das vom Plasma erzeugte violette Licht sichtbar ist.</li>
	<li>Wenn die Maschine fertig läuft, warten Sie, bis die Kammer den atmosphärischen Druck erreicht hat, um den Glasdeckel zu entfernen, und kehren Sie dann den Schlitten mit den Gittern auf die Bank zurück, wo Proben auf sie geladen werden.</li>
	<li>Stellen Sie die Konzentration der gereinigten Proteinproben auf etwa 0,1 mg/ml ein, indem Sie die Probe entweder mit dem entsprechenden Puffer verdünnen oder sich mit einem Zentrifugalkonzentrator konzentrieren.</li>
	<li>3,5 l Proteinprobe auf das 10 nm dicke Kohlenstoffgitter laden und 1 min warten.</li>
	<li>Entfernen Sie die Flüssigkeit mit einem Filterpapier von der Oberfläche des EM-Gitters.</li>
	<li>Waschen Sie die Gitteroberfläche 3x, indem Sie 3 L Wassertröpfchen mit dem Gitter aufnehmen und das Wasser mit Filterpapier zwischen den Tropfen entfernen.</li>
	<li>Waschen Sie die Gitteroberfläche 2x, indem Sie 3 L Tröpfchen frisches, gefiltertes 2% Uranacetat aufnehmen und die Waschlösungen auf dem Gitter mit Filterpapier zwischen den Entnahmen jedes Tröpfchens entfernen.</li>
	<li>Färben Sie das Gitter mit einem 3 L Tröpfchen frisch, gefiltert 2% Uranacetat für 1 min.</li>
	<li>Entfernen Sie die Uranacetatlösung auf der Oberfläche des EM-Gitters mit Filterpapier und trocknen Sie das Gitter mindestens 1 min.</li>
	<li>Speichern Sie das Raster feld in einem Rasterfeld für die spätere Verwendung.</li>
</ol>7. EM-Bildgebung
<ol><li>Laden Sie das vorbereitete Gitter an einer sicheren Werkbank in den Gitterhalter.</li>
	<li>Bereiten Sie das Mikroskop vor, indem Sie die Mikroskope in eine Polystyrol-Box legen und den Dewar 3/4 voller flüssigem Stickstoff füllen.</li>
	<li>Bestätigen Sie, dass die Gummiabdeckung des Mikroskopfensters es bedeckt, und laden Sie den Dewar dann auf das Mikroskop, indem Sie die Kupferdrähte in den Dewar legen, bis er auf die Plattform passt.</li>
	<li>Füllen Sie den Rest des Krieges mit flüssigem Stickstoff und legen Sie eine Kappe auf den Dewar, um ihn zu bedecken.</li>
	<li>Schalten Sie die Hochspannung ein, konditionieren Sie das Mikroskop und warten Sie, bis sich das Mikroskop erwärmt und einen sicheren Vakuumpegel für den Einsatz festlegt.</li>
	<li>Sobald das Mikroskop fertig ist, öffnen Sie das Säulenventil und bestätigen Sie, dass der Strahl vorhanden ist, indem Sie die Gummiabdeckung am Mikroskopfenster entfernen.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Strahlstigmation, indem Sie sich in und aus ausbreiten, indem Sie die Intensität des Strahls anpassen. Wenn Astigmatismus vorhanden ist, wird der Strahl eine elliptische Form haben, wenn man sich vom Cross-over entfernt und der Strahl sollte auf beiden Seiten die gleiche ovale Form haben.</li>
	<li>Passen Sie das Mikroskop-Fernglas so an, dass es die richtige Höhe und den richtigen Abstand gemäß den Augen des Beobachters hat.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Strahlpositionierung für Such-, Fokus-und Belichtungsmodi, indem Sie durch alle drei Modi radeln, bis der Strahl in jedem Modus zentriert ist.</li>
	<li>Schließen Sie das Säulenventil, und laden Sie den Gitterhalter in das Elektronenmikroskop.</li>
	<li>Stellen Sie das Mikroskop auf die euzentrische Höhe ein, indem Sie die Wackelfunktion der Mikroskope verwenden und die Bewegung der Bühne mithilfe der Z-Achse anpassen, bis sich keine Seitenbewegung der Probe in der Mitte befindet.</li>
	<li>Mit dem niedrig dosierten Suchmodus am Mikroskop suchen Sie das Raster nach einem wünschenswerten Bereich von vernünftigem Kontrast zu den vorhandenen Probenmolekülen, um sich auf die Probe zu konzentrieren.</li>
	<li>Konzentrieren Sie sich im Fokusmodus auf die Stichprobe, indem Sie eine hohe Schrittgröße verwenden, bis die Stichprobe angezeigt wird, und verringern Sie dann die Schritte, um die richtige Fokusebene zu finden.</li>
	<li>Null und leeren Sie den Strahl und stellen Sie dann sicher, dass das Gummipad das Mikroskopfenster bedeckt.</li>
	<li>Nehmen Sie mit dem Belichtungsmodus das Bild der gewünschten Rasterfläche für eine Belichtungszeit von 1 s bei 62.000-facher Vergrößerung auf und überprüfen Sie das erhaltene Bild.</li>
	<li>Wenn die Bildgebung erfolgt ist, schließen Sie die Säulenventile und entfernen Sie den Gitterhalter aus der Säule.</li>
	<li>Wenn die Bildgebung abgeschlossen ist, schalten alle von Interesse sind den Mikroskop ab, indem sie die Filamentleistung ausschalten und den Flüssigstickstoff-Dewar aus dem Mikroskop entfernen.</li>
	<li>Legen Sie etwas, um Feuchtigkeit auf dem Ständer zu absorbieren, wo der Dewar saß, um Kondensation von den Kupferspulen des Mikroskops zu fangen.</li>
	<li>Aktivieren Sie den Cryo-Zyklus-Modus und stellen Sie sicher, dass die Turbopumpe ausgeschaltet ist.</li>
</ol>

<ol>
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(132), e57199 (2018).</li><li>Lu, W., Zhong, M., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+AcrB+Subunit+Precedes+Trimerization.">Folding of AcrB Subunit Precedes Trimerization.</a> Journal of Molecular Biology. 411 (1), 264-274 (2011).</li><li>Lebon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structure and Function of GPCRs. , 229-230 (2019).</li><li>Rames, M., Yu, Y., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+negative+staining:+a+high-throughput+protocol+for+examining+small+and+asymmetric+protein+structure+by+electron+microscopy.">Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).</li><li>Lee, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+detergent-free+isolation+of+membrane+proteins+in+their+local+lipid+environment.">A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).</li><li>Hall, S. C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acid-compatible+co-polymer+for+the+solubilization+of+membranes+and+proteins+into+lipid+bilayer-containing+nanoparticles.">An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles.</a> Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).</li><li>Oluwole, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+of+Membrane+Proteins+into+Functional+Lipid-Bilayer+Nanodiscs+Using+a+Diisobutylene/Maleic+Acid+Copolymer.">Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer.</a> Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).</li></ol>

Y.G ist als Erfinder des membranaktiven Polymers NCMNP5-2 und des NCMN Systems gelistet.

Protein-Protein-Wechselwirkungen sind wichtig für die Integrität der Struktur und Funktion von Membranproteinen. Viele Ansätze wurden entwickelt, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Im Vergleich zu löslichen Proteinen sind Membranproteine und ihre PPI aufgrund der einzigartigen intrinsischen Eigenschaften von Membranproteinen schwieriger zu untersuchen. Diese Schwierigkeit ergibt sich vor allem aus der Anforderung von Membranproteinen, die in eine native Lipid-Bilayer-Umgebung eingebettet werden müss...

Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) spielen in der gesamten Biologie eine zentrale Rolle, von der Aufrechterhaltung der Struktur und Funktion von Proteinen bis hin zur Regulierung ganzer Systeme. PPIs gibt es in vielen verschiedenen Formen und können basierend auf den Arten von Interaktionen kategorisiert werden, die sie bilden. Eine solche Kategorisierung ist homooligomer oder heterooligomer, je nach, ob die Wechselwirkungen zwischen identischen Untereinheiten oder verschiedenen Proteinen, die als Untereinheiten wirken, bestehen. Eine weitere Kategorisierung basiert auf der Stärke der Wechselwirkung, wenn die Wechselwirkungen zur Bildung stabiler Komplexe oder transienter komplexer Zustände führen. Strukturelle Informationen über die PPI zwischen Proteinen sind entscheidend für das Verständnis des Mechanismus, mit dem Proteine ihre Funktion erfüllen. Es wurde geschätzt, dass über 80% der Proteine auf komplexe Bildung angewiesen sind, um ihre funktionellen Rollen durchzuführen1. Angesichts des Prozentsatzes der Proteine, die für eine ordnungsgemäße angeborene Funktion auf PPI angewiesen sind, ist ihre Bedeutung in der Biologie leicht erkennbar, aber die Fähigkeit, die Proteine, die an diesen Wechselwirkungen teilnehmen, richtig untersuchen zu können, ist aufgrund der Beschränkungen der Techniken, die zur experimentellen Beobachtung zur Verfügung stehen, um zu beobachten, wann Proteine PPI bilden, eine Herausforderung geblieben.
Es gibt ein hohes Maß an Uneinigkeit zwischen den Ergebnissen für viele experimentell ermittelte PPI aufgrund der hohen Menge an Rauschen, falsch positive und falsche Negative, die von vielen der derzeit verfügbaren PPI-Bestimmungstechniken abgeleitet werden. Dies gilt insbesondere für das Hefe-Zwei-Hybrid-System (Y2H), die Tandem-Affinitätsreinigungs-Massenspektrometrie (TAP-MS) und die Fluoreszenzresonanz-Energieübertragung (FRET), die drei der am häufigsten verwendeten Methoden zur PPI-Bestimmung2,3,4,5,6,7darstellen. Im Vergleich dazu können proteinstrukturbiologische Techniken wie Kernspinresonanz (NMR), Röntgenkristallographie und Elektronenmikroskopie (EM) verwendet werden, um hochauflösende Strukturinformationen über Protein-Protein-Wechselwirkungen bis auf atomare Ebene zu gewinnen und eine direkte visuelle Bestätigung der Wechselwirkungen zu ermöglichen, die für ein Zielprotein von Interesse auftreten. Alle derzeit verfügbaren nicht-strukturbasierten PPI-bestimmenden Forschungstechniken (z. B. Y2H, TAP-MS und FRET) haben diese Fähigkeit und leiden zusätzlich unter Schwierigkeiten bei der Identifizierung schwacher und vorübergehender Wechselwirkungen zwischen Proteinen5. Diese Unzulänglichkeiten werden bei der Untersuchung von Membranproteinen aufgrund der zusätzlichen Komplexität, die durch die zusätzliche Variable der Lipidumgebung, die die Bildung einer richtigen quaternären Struktur und heteromeren komplexen Montage beeinflusst, noch verstärkt.
Membranproteine machen einen großen Teil des Proteoms aus und sind dafür bekannt, viele entscheidende Rollen bei der ordnungsgemäßen Zellfunktion in allen lebenden Organismen zu spielen. Trotz der Tatsache, dass Membranproteine schätzungsweise 27 % des menschlichen Genoms ausmachen und 60 % aller aktuellen Wirkstoffziele ausmachen, gibt es eine große Anomalie in der Anzahl der gelösten Modelle für Membranproteine, die nur 2,2 % aller veröffentlichten Proteinstrukturenausmachen 8,9,10. Die Hauptursache für die Diskrepanz bei der Verfügbarkeit von Strukturinformationen liegt in den intrinsischen Eigenschaften von Membranproteinen selbst. Aufgrund ihrer schlechten Löslichkeit, der Abhängigkeit von Wechselwirkungen mit einer Lipidumgebung zur Aufrechterhaltung der einheimischen Struktur und Funktion und der verschiedenen physikalisch-chemischen Eigenschaften der Lipidmembran selbst stellen Membranproteine weiterhin ein wesentliches Problem bei der Implementierung strukturbiologischer Techniken zur Untersuchung dar. Von diesen intrinsischen Eigenschaften ist die wichtigste für die Beschaffung genauer struktureller Informationen die Anforderung, Wechselwirkungen mit ihrer natürlichen Lipidumgebung zu haben, damit sie ihre native Struktur und Funktion erhalten. Die Lipidumgebung ist ein so integraler Bestandteil der Struktur und Funktion von Membranproteinen, dass das Konzept von Memtein (eine Kombination der Wörter Membran und Protein) als grundlegende Einheit der Membran-Protein-Struktur und Funktion vorgeschlagen wurde11. Trotz der Bedeutung von Lipid-Protein-Wechselwirkungen erfordern die derzeit verfügbaren strukturbasierten PPI-Bestimmungstechniken oft, dass die untersuchten Proteine löslich sind oder mit Reinigungsmitteln löslich sind. Die Exposition gegenüber harten Waschmitteln kann die Proteine denaturiert oder falsche Positiv- und Negative aufgrund von Delipidation verursachen, die Aggregation, Denaturierung von Protein, Dissoziation nicht-kovalenter Wechselwirkungen und Bildung künstlicher oligomerer Zustände induzieren können. Aufgrund der Notwendigkeit, eine natürliche Lipidumgebung für die genaue Bestimmung des nativen oligomeren Zustands von Membranproteinen zu erhalten, haben wir ein Native Cell Membrane Nanoparticles System (NCMNs)12 auf Basis der zuvor berichteten Styrol Maleic Acid Lipid Particles (SMALP)13 Methode entwickelt.
SMALP verwendet Styrol-Maleinsäure-Copolymer als membranaktives Polymer, um Membranproteine zu extrahieren und zu löslich. Poly (Styrene-Co-Maleic Acid) (SMA) ist ein einzigartiges amphiphiles Polymer aufgrund seiner hydrophoben Styrol-Moiety und diametral entgegengesetzten hydrophilen Maleinsäure-Moiety. Es bildet Nanopartikel, indem es in einem pH-abhängigen Mechanismus14adsorbiert, destabilisiert und die Zellmembran stört. Diese funktionelle Aktivität von SMA ermöglicht es, als waschmittelfreies System für membranproteinextraktion und Löslichkeit verwendet werden. Das NCMN-System unterscheidet sich in mehreren Aspekten vom SMALP-System. Das einzigartigste Merkmal des NCMN-Systems ist, dass es eine membranaktive Polymerbibliothek mit einer Vielzahl von Polymeren hat, die einzigartige Eigenschaften haben, die sie für die Isolierung vieler verschiedener Membranproteine geeignet machen, die unterschiedliche Bedingungen für Stabilität und native Funktion erfordern. Das NCMN-System hat auch andere Protokolle im Vergleich zur SMALP-Methode, wenn es um die Herstellung der Nanopartikel geht. Ein beispiel dafür ist, dass NCMNs eine einstufige Nickelaffinitätssäulenreinigung für die hochauflösende Strukturbestimmung verwenden. die Wirkung dieser verschiedenen Protokolle kann beim Vergleich des NCMNs-Protokolls, das 3,2 und 3,0 -C-Cryo-EM-AcrB-Strukturen erzeugte, mit einer ähnlichen Studie mit der SMALP-Methode beobachtet werden, die zu einer Kryo-EM-AcrB-Struktur mit einer Auflösung von 8,8 °12,15führte. Diese einzigartigen Merkmale des NCMN-Systems sind die Verbesserungen an der zuvor etablierten SMALP-Methode und machen es zu einem idealen Kandidaten für die Untersuchung von PPI.
Der Multidrug Efflux Transporter AcrB existiert als funktioneller Homotrimer in E. coli12. Eine mutagene Analyse ergab, dass eine einzelne P223G-Punktmutation, die sich auf einer Schleife befindet, die für die Stabilität des AcrB-Trimmers verantwortlich ist, den Trimmerzustand destabilisiert und bei der Herstellung mit dem Waschmittel DDM ein AcrB-Monomer ergibt, das mit nativer Blaugelelektrophorese16nachgewiesen werden konnte. Die FRET-Analyse des AcrB-P223G-Mutanten ergab jedoch, dass in der nativen Zellmembran-Lipid-Bilayer-Umgebung die Mehrheit der mutierten AcrB-P223G noch als Trimmer existierte und dass die Expressionswerte für den Wildtyp AcrB und AcrB-P223G ähnlich sind. Doch trotz der ERGEBNISSE der FRET-Analyse zeigte ein Aktivitätstest für den mutierten Transporter, dass die Aktivität im Vergleich zum Wildtyp16dramatisch zurückging. Obwohl die FRET-Technologie im Volksmund für die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen verwendet wurde, hat die Forschung gezeigt, dass sie häufig falsch positive Ergebnisse geben kann17,18,19,20.
Kürzlich wurden hochauflösende Kryo-EM-Strukturen des AcrB-Trimers bestimmt, die die Wechselwirkung von AcrB mit der zugehörigen nativen Zellmembran Lipid-Bilayer durch den Einsatz der NCMNs12zeigten. Grundsätzlich können die NCMNs problemlos für die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen auf der nativen Zellmembran verwendet werden. In einem Test dieses Systems wurden Experimente durchgeführt, um den oligomeren Zustand von AcrB-P223G mit nativen Zellmembran-Nanopartikeln und negativer Färbeelektronenmikroskopie direkt zu beobachten. Um mit den wilden AcrB-Nanopartikeln zu vergleichen, verwendeten wir das gleiche membranaktive Polymer (SMA2000 made in our laboratory, which is indexed as NCMNP1-1 in the NCMN library), das für die hochauflösende Kryo-EM-Strukturbestimmung von AcrB und alternativen Polymeren verwendet wird, die in der NCMNs-Bibliothek gefunden werden12. Basierend auf den zuvor berichteten Ergebnissen wurde erwartet, dass die Mehrheit der AcrB-P223G-Mutation in Form von trimernativen Zellmembran-Nanopartikeln21existieren würde. Es wurden jedoch keine AcrB-Trimmer in der Stichprobe gefunden, wie z. B. diejenigen, die mit dem wilden Typ AcrB beobachtet wurden. Dies deutet darauf hin, dass die Mehrheit der AcrB-P223G nicht Trimmer auf der nativen Zellmembran bildet, wie zuvor vorgeschlagen.
Hier berichten wir über eine detaillierte Analyse des mutierten E. coli AcrB-P223G im Vergleich mit dem Wildtyp E. coli AcrB mit den NCMNs. Diese Fallstudie von AcrB legt nahe, dass NCMNs ein gutes System für die Protein-Protein-Interaktionsanalyse ist.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A38S-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>C-105-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (Dithiothreitol) (&#62; 99% pure) Protease free</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>DTT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>17525 1 KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>K-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AA3622636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-dimethylethylenediamine (EDTA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.03779.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCMNS-P5-2</td>
			<td>Not commercially available yet</td>
			<td>Submit request for obtaining to corresponding author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Dual Color Standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA2000</td>
			<td>Cray Valley</td>
			<td>Submit request for obtaining to corresponding author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>TCEP25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth Media</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75856 1 KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Ambinter</td>
			<td>Amb22348393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-26S XPI</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B14538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti JXN-30</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B34193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Electron Microscope Grids (10 nm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF300-Cu-TH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Con-Torque Tissue Homogenizer</td>
			<td>Eberbach</td>
			<td>E7265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning LSE Mini Microcentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>07-203-954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Avestin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction Collector F9-R</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29003875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-8004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000 Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>PN LL-IM-12AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000S-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>358013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump</td>
			<td>Razel Scientific Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai F20 200kV</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA pure 25 L1 FPLC</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)pLysS Cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C606003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP 5 ml Column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17524802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-24a</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>69749-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

native cell membrane nanoparticles system for membrane protein-protein interaction analysis

Protein-Protein-Wechselwirkungen in Zellmembransystemen spielen eine entscheidende Rolle in einer Vielzahl biologischer Prozesse - von Zell-zu-Zell-Interaktionen bis hin zur Signaltransduktion; von der Erfassung von Umweltsignalen bis hin zur biologischen Reaktion; von der metabolischen Regulierung bis zur Entwicklungskontrolle. Genaue strukturelle Informationen über Protein-Protein-Wechselwirkungen sind entscheidend für das Verständnis der molekularen Mechanismen von Membranproteinkomplexen und für die Entwicklung hochspezifischer Moleküle zur Modulation dieser Proteine. Für den Nachweis und die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen wurden zahlreiche In-vivo- und In-vitro-Ansätze entwickelt. Unter ihnen ist der strukturbiologische Ansatz insofern einzigartig, als er direkte strukturelle Informationen über Protein-Protein-Wechselwirkungen auf atomarer Ebene liefern kann. Die derzeitige Membranproteinstrukturbiologie beschränkt sich jedoch noch weitgehend auf Waschmittel-basierte Methoden. Der Hauptnachteil von Waschmittel-basierten Methoden ist, dass sie oft Membranproteinkomplexe dissoziieren oder denaturieren, sobald ihre native Lipid-Doppelschichtumgebung durch Waschmittelmoleküle entfernt wird. Wir haben ein natives Zellmembran-Nanopartikelsystem für die Strukturbiologie von Membranproteinen entwickelt. Hier zeigen wir den Einsatz dieses Systems bei der Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen auf der Zellmembran mit einer Fallstudie des oligomeren Zustands von AcrB.

Mit den hier vorgestellten Verfahren wurden Proben des Wildtyps E. coli AcrB und des E. coli-Mutanten AcrB-P223G gereinigt. Die Proben wurden dann auf kohlenstoffnegative Fleckenelektronenmikroskopiegitter adsorbiert und mit Uranylacetat mit der Side Blotting Methode22gebeizt. Negative Fleckenbilder wurden mittels Transmissionselektronenmikroskopie gesammelt. Das negative Fleckenbild für die mit DDM gereinigte AcrB-Wild-Musterprobe zeigt eine homogene Lösung monodisperser Parti...

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Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Hier wird ein Protokoll zur Bestimmung des oligomeren Zustands von Membranproteinen vorgestellt, das ein natives Zellmembran-Nanopartikelsystem in Verbindung mit der Elektronenmikroskopie nutzt.

Native Cell Membrane Nanoparticles System für Membran-Protein-Protein-Interaktionsanalyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

native-cell-membrane-nanoparticles-system-for-membrane-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

5.9K Aufrufe.  Virginia Commonwealth University. Hier wird ein Protokoll zur Bestimmung des oligomeren Zustands von Membranproteinen vorgestellt, das ein natives Zellmembran-Nanopartikelsystem in Verbindung mit der Elektronenmikroskopie nutzt.

Serie: Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

Verfahren zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren des Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen HCN1- und TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Forschung

Biochemie

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

Hochpräzisions-FRET auf Einzelmolekül-Niveau für die Bestimmung der Biomolekülstruktur

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between proteins such as transcription factors (TFs) and their DNA target. The method presented here utilizes the underlying concept of the Y1H but is modified further to study and validate protein complexes binding to their target DNA. Hence, it is referred to as the modified yeast one-hybrid (Y1.5H) assay. This assay is cost effective and can be easily performed in a regular laboratory setting. Albeit using a heterologous system, the described method could be a valuable tool to test and validate the heteromeric protein complex binding to their DNA target(s) for functional genomics in any system of study, especially plant genomics.

The modified yeast one-hybrid assay described here is an extension of the classical yeast one-hybrid (Y1H) assay to study and validate the heteromeric protein complex-DNA interaction in a heterologous system for any functional genomics study.

Ein modifiziertes Hefe-ein-Hybrid-System für Heteromere Protein-Komplex-DNA-Interaktionsstudien

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

Biotinylierte Zelle eindringen Peptide, intrazelluläre Protein-Protein-Wechselwirkungen zu studieren

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

Analyse der Thylakoidmembran Membran-Protein-komplexe durch blaue Native Gelelektrophorese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions largely depend on intracellular protein&#8211;protein interactions. Therefore, research regarding these interactions is indispensable to facilitating the understanding of physiologic processes. Co-precipitation of associated proteins, followed by mass spectrometry (MS) analysis, enables the identification of novel protein interactions. In this study, we have provided details of the novel technique of immunoprecipitation-liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis combined with on-membrane digestion for the analysis of protein&#8211;protein interactions. This technique is suitable for crude immunoprecipitants and can improve the throughput of proteomic analyses. Tagged recombinant proteins were precipitated using specific antibodies; next, immunoprecipitants blotted onto polyvinylidene difluoride membrane pieces were subjected to reductive alkylation. Following trypsinization, the digested protein residues were analyzed using LC-MS/MS. Using this technique, we were able to identify several candidate associated proteins. Thus, this method is convenient and useful for the characterization of novel protein&#8211;protein interactions.

Here, we present a protocol for an on-membrane digestion technique for the preparation of samples for mass spectrometry. This technique facilitates the convenient analysis of protein&#8211;protein interactions.

Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einer On-Membrane-Verdauungstechnik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

Charakterisierung von Membrantransportern durch heterologen Ausdruck in E. coli und Herstellung von Membranvesikeln

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial membrane is a challenging environment to distinguish regulatory factors. Experimental control of protein and lipid components can help answer specific questions of regulation. Yet, quantitative manipulation of these factors is challenging in cellular assays. To investigate the molecular mechanism of mitochondria inner-membrane fusion, we introduced an in vitro reconstitution platform that mimics the lipid environment of the mitochondrial inner-membrane. Here we describe detailed steps for preparing lipid bilayers and reconstituting mitochondrial membrane proteins. The platform allowed analysis of intermediates in mitochondrial inner-membrane fusion, and the kinetics for individual transitions, in a quantitative manner. This protocol describes the fabrication of bilayers with asymmetric lipid composition and describes general considerations for reconstituting transmembrane proteins into a cushioned bilayer. The method may be applied to study other membrane systems.

Mitochondrial fusion is an important homeostatic reaction underlying mitochondrial dynamics. Described here is an in vitro reconstitution system to study mitochondrial inner-membrane fusion that can resolve membrane tethering, docking, hemifusion, and pore opening. The versatility of this approach in exploring cell membrane systems is discussed.

Eine Modellmembranplattform zur Rekonstituierung der mitochondrialen Membrandynamik

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...