この研究は、VCUスタートアップファンド(Y.G.へ)と国立衛生研究所の国立総合医学研究所が賞番号R01GM132329(Y.G.に)によって支援されました。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。モンセラート・サムソとケビン・マクロバーツがビデオ録画を惜しんでサポートしてくれたことに感謝します。

1. タンパク質発現
<ol><li>BL21(DE3)PLysS細胞を含むプラスミドを含む素晴らしいブロス(TB)培地を15mLで37°Cで一晩で37°Cで250rpmで振盪させた。</li>
	<li>600 nm (OD600)での一晩培養の光学濃度を確認し、2.0 を超えるようにしてください。</li>
	<li>プラスミドに特異的な抗生物質を含む結核培地の1Lに5mLの細胞培養を希釈し、OD600=0.8まで振盪して37°Cでインキュベートし、最終的な濃度が1mMのIPTGで誘導する。</li>
	<li>20°Cで20時間振る回して誘導を行います。</li>
	<li>4°Cおよび4,000 x gで15分間の遠心分離を使用して細胞を下にペレット.</li>
</ol>2. 細胞のリシスと膜の分離
<ol><li>バッファーA内の細胞ペレットを再懸濁(表1、DDM バッファAまたはNCMNsバッファAに従う精製スキームに応じて)を用いて、細胞ペレットの20gごとに80 mLを使用する。</li>
	<li>ガラスDounceホモジナイザーを4°Cで使用するか、室温であれば、再懸濁セルペレットを均質化し、すぐに氷の上に置いてください。</li>
	<li>サンプルを氷の上の金属ビーカーに移し、4°Cおよび1,500棒で高圧ホモジナイザーにセットして細胞を溶解させる。<ol>
<li>ホモジナイザーに細胞をロードし、ホモジナイザーを通過させて3〜4サイクル、またはリセートが明確になるまで通過させるプロセスを繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>4°Cで30分間15,000xgでリセートを遠心分離する。</li>
	<li>上清を収集し、4 °Cで1時間215,000 x g で超遠心チューブと遠心分離機に負荷を入れ.</li>
	<li>上清を捨てて、超遠心チューブから膜ペレットを収集します。過剰な膜ペレットを-80°Cで保存します。</li>
</ol>3. 天然細胞膜ナノ粒子の調製
<ol><li>10 mL NCMNsバッファA中の膜ペレット1gを再懸濁する(表1)。</li>
	<li>再懸濁した細胞膜試料をガラスDounceホモジナイザーを20°Cで均質化する。</li>
	<li>懸濁膜試料を50 mLポリプロピレンチューブに移し、膜活性ポリマーストック溶液および追加のNCMNsバッファAを加えて、最終濃度2.5%(w/v)膜活性ポリマー(NCMNP1-1またはNCMNP5-2)にサンプルを持ち込みます。 注:膜活性ポリマーのストック溶液は、二重蒸留水で作られ、様々な濃度で保つことができますが、通常は10%(w/v)です。</li>
	<li>試料を20°Cで2時間振る。</li>
	<li>サンプルを超遠心分離機にロードし、20°Cで1時間150,000 x g で回転させます。</li>
	<li>サンプルが超遠分化されている間にNCMNsバッファAの25 mLと5 mL Ni-NTAカラムを平衡化し始める。</li>
	<li>超遠心分離が完了した後に上清を収集し、シリンジポンプを使用して0.5 mL /minの流量で室温でNi-NTAカラムの5mLにロードします。</li>
	<li>高速タンパク質液体クロマトグラフィー (FPLC) ラインを十分な NCMNs バッファ B (表 1)で洗浄し、システムを完全にフラッシュしてから、カラムを FPLC マシンに接続します。</li>
	<li>30 mLのNCMNsバッファBで1mL/minの流量でカラムを洗浄し、流れを通して集めます。</li>
	<li>30 mLのNCMNsバッファC(表1)で流量1 mL/minでカラムを洗い、流れを通して集めます。</li>
	<li>20 mL の NCMNs バッファ D (表 1)を流量 0.5 mL/min で溶出し、分画コレクタと画分をそれぞれ 1.0 mL に設定してサンプルを収集します。</li>
	<li>タンパク質サンプルを4°Cに保存してください。</li>
	<li>FPLC溶出グラフで観測されたピークに対応するサンプルを確認するために、SDS-PAGEゲル電気泳動アッセイを実行します。</li>
</ol>4. SDS-ページゲル電気泳動
<ol><li>ガラスを鋳造装置にクランプして鋳造室を準備します。</li>
	<li>表1に示したレシピに従って12%分離ゲルを調製する。 注:TEMEDが追加されると、ゲルはすぐに重合するので、ゲルを注ぐ準備ができたらこれを追加するだけです。</li>
	<li>ゲルを注ぎ、櫛の底から2cm下に2cm残して、スタッキングジェルを出します。</li>
	<li>ゲルの上部に100%イソプロパノールを重ねて気泡を取り除き、分離ゲルが重合するのを待ちます。</li>
	<li>イソプロパノールを取り除き、蒸留水でイソプロパノールの痕跡を洗い流します。</li>
	<li>表 1に示したレシピに従って、スタックゲルを準備します。 注:TEMEDが追加されると、ゲルはすぐに重合するので、ゲルを注ぐ準備ができたらこれを追加するだけです。</li>
	<li>分離ゲルの上に積み重ねゲルを注ぎます。</li>
	<li>ウェルを形成するために部屋に櫛を追加し、積層ゲルが完全に重合するのを待ちます。</li>
	<li>ゲル上で実行する必要がある各画分サンプルのマイクロ遠心分離チューブに1 M DTTの1 μLを入れる。</li>
	<li>各チューブに4x負荷バッファの7 μLを追加します。</li>
	<li>ゲル上で実行する必要のある分数から各マイクロ遠心チューブに20 μLのサンプルを加えます。</li>
	<li>サンプルを含むチューブを渦出します。</li>
	<li>3 sの卓上マイクロ遠心分離機を使用してサンプルチューブをスピンダウンし、すべてのサンプルがチューブの底に戻っていることを確認してください。</li>
	<li>ゲル電気泳動セルを調製するために、12%ポリアクリルアミドゲルカセットを所定の位置に固定し、細胞の内側および外側のチャンバーをトリス-酢酸EDTA(TAE)バッファで満たします(表1)。</li>
	<li>指示に必要な適切な体積で、ゲルの最初のレーンに分子量マーカーをロードします。</li>
	<li>DTTと負荷バッファを混合した各チューブからサンプルの28 μLをロードします。</li>
	<li>電気泳動セルの蓋を箱の上に置き、蓋を電源に差し込みます。</li>
	<li>電源を入れ、100 Vに設定し、20分間稼働します。</li>
	<li>20分後、電源電流を140Vに上げ、さらに30〜40分間、またはローディングバッファ色のバンドがゲルカセットの底に達するまでそれを実行し続けます。</li>
	<li>電気泳動染色を完了した後、ゲルを脱染色して、ゲル内に含まれるタンパク質バンドを可視化する。</li>
</ol>5. DDMを用いたタンパク質精製
注:この精製プロセスを実施する目的は、膜活性ポリマーを利用した実験の制御として機能することです。
<ol><li>6〜10gの膜ペレットを再懸濁し、ステップ2.6から、5mL/gの膜ペレットを用いてDDMバッファA(表1)に入れる。</li>
	<li>再懸濁試料をガラスDounceホモジナイザーを4°Cで均質化するか、室温であれば、すぐに氷の上に置いてください。</li>
	<li>サンプルをポリプロピレンチューブ50 mLに移し、DDMとDDMバッファAを追加して、サンプルを2%DDMの最終濃度にします。</li>
	<li>サンプルを4°Cで2時間振ります。</li>
	<li>4 °Cおよび150,000 x gで1時間超遠心チューブと遠心分離機にサンプルをロードします。</li>
	<li>試料が超遠心状態にある間、25mLのDDMバッファAで洗浄してNi-NTAカラムの5mLを調製し始める(表1)。</li>
	<li>超遠心分離が完了したら、上清を集め、シリンジポンプを使用して0.5 mL/minの流量で4°Cの5 mL Ni-NTAカラムに積み込みます。</li>
	<li>十分な DDM バッファ B + 0.05% DDM (表 1) で FPLC ラインを洗浄し、システムを完全にフラッシュしてから、FPLC マシンにカラムを取り付けます。</li>
	<li>30 mLのDDMバッファB + 0.05%DDMで、流量1 mL/minで洗浄し、流れを通して集めます。</li>
	<li>30 mLのDDMバッファC + 0.05%DDM(表1)の流量を1 mL/minで洗浄し、流れを通して集めます。</li>
	<li>20 mL の DDM バッファー D + 0.05% DDM (表 1) の流量 0.5 mL/min でタンパク質を溶出し、分画コレクタと各画分を使用して流れを 1.0 mL に設定して流れを収集します。</li>
	<li>500 μLに達するまで4,000 x g および4°Cで遠心濃縮器と遠心を使用して、プールおよび濃縮のための溶出ピークを含む分数を選択します。</li>
	<li>500 μL ループを使用して、サンプルを FPLC マシンにロードし、4 °C の 25 mL サイズの除外カラムに積み込みます。 30 mL の DDM バッファ E + 0.05% DDM (表 1) を流速 0.5 mL/min で使用し、分数サイズが 1 分あたり 0.5 mL に設定された分数として収集します。</li>
	<li>画分を取り、FPLC溶出グラフからUV-Vis曲線を確認するために280 nmの吸光度を使用してタンパク質濃度を測定する。</li>
	<li>FPLC溶出グラフで観測されたピークに対応する各サンプル画分から20μLを収集し、吸光度試験で正確であることが確認されました。</li>
	<li>必要なアリコートで液体窒素またはドライアイスを使用してこれらのサンプル画分の残りを凍結し、-80°Cでタンパク質サンプルを保存します。</li>
	<li>前述のとおり、SDS-PAGEゲル電気泳動アッセイを実行して、FPLC溶出グラフで観測されたピークに対応するサンプルを確認します。</li>
</ol>6. 陰性染色グリッドの準備
<ol><li>サンプル調製に使用するグリッドを、フィルターペーパーで包んだガラススライドに、カーボン側を上に向けて配置します。</li>
	<li>電子顕微鏡グリッドを備えたガラススライドを2つの電極間のグロー放電器のチャンバーに入れ、ガラス蓋を交換して、中央に収まり、密閉されていることを確認します。</li>
	<li>グロー放電機を実行し、プラズマによって生成された紫色の光が見えるようにします。</li>
	<li>機械の走行が終わったら、チャンバーが大気圧に達するまで待ってガラス蓋を取り外し、サンプルが積み込まれるベンチにグリッド付きのスライドを戻します。</li>
	<li>適切なバッファーでサンプルを希釈するか、遠心濃縮器を使用して濃縮することにより、精製されたタンパク質サンプルの濃度を約 0.1 mg/mL に調整します。</li>
	<li>3.5 μLのタンパク質サンプルを10 nm厚いカーボングリッドに積み込み、1分待ちます。</li>
	<li>フィルターペーパーでEMグリッドの表面から液体を取り除きます。</li>
	<li>グリッドで3μLの水滴を拾い、各滴を拾う間にフィルターペーパーでグリッドから水を取り除くことによって、グリッド表面3倍を洗浄します。</li>
	<li>3 μLの新鮮な、ろ過された2%の酢酸ウランの液滴を拾ってグリッド表面2xを洗浄し、各滴を拾う間にフィルターペーパーでグリッド上の洗浄液を取り除きます。</li>
	<li>3 μLの新鮮な、濾過された2%酢酸ウランの1分間のグリッドを染色します。</li>
	<li>EMグリッドの表面にある酢酸ウラン溶液を濾紙で取り除き、空気乾燥してグリッドを少なくとも1分間乾燥させます。</li>
	<li>後で使用するためにグリッド ボックスにグリッドを格納します。</li>
</ol>7. EMイメージング
<ol><li>準備したグリッドを安全なワークベンチのグリッドホルダーに積み込みます。</li>
	<li>顕微鏡をポリスチレンボックスに入れ、液体窒素の3/4を満たして顕微鏡を準備します。</li>
	<li>顕微鏡窓のゴムカバーが覆っていることを確認し、プラットフォームに収まるまで銅線をデュワーに入れて顕微鏡にロードします。</li>
	<li>残りの残りの部分を液体窒素で満たし、それをカバーするためにデュワーの上にキャップを置きます。</li>
	<li>ハイテンションをオンにし、顕微鏡を調整し、顕微鏡がウォームアップし、使用するための安全な真空レベルを確立するのを待ちます。</li>
	<li>顕微鏡が準備ができたら、カラムバルブを開き、顕微鏡ウィンドウのゴムカバーを取り外してビームが存在することを確認します。</li>
	<li>ビームの強度を調整して、広がってビームの汚名を確認します。乱視が存在する場合、ビームはクロスオーバーから離れて移動し、ビームは両側で同じ楕円形でなければならないので、楕円形になります。</li>
	<li>顕微鏡双眼鏡を、観察者の目に合わせて正しい高さと距離に調整します。</li>
	<li>3 つのモードすべてを循環して、ビームの位置を 検索、 フォーカス、 および露出 モードで確認します。</li>
	<li>カラムバルブを閉じて、グリッドホルダーを電子顕微鏡にロードします。</li>
	<li>顕微鏡のウォブラー特徴を使用し、中央にサンプルの左右の動きがなくなるまでZ軸を使用してステージの動きを調整することにより、マイクロスコープをユーセントリックな高さに調整します。</li>
	<li>顕微鏡上の低用量 検索 モードを使用して、サンプルに焦点を当てるために存在するサンプル分子との妥当な対比の望ましい領域をグリッドを検索します。</li>
	<li>サンプルが見えるまで高いステップサイズを使用して 、フォーカス モードでサンプルに焦点を当て、次にステップを減らすことで正しいフォーカスレベルを見つけます。</li>
	<li>ゼロとビームをブランクし、ゴムパッドが顕微鏡の窓を覆っていることを確認してください。</li>
	<li>露出モードを使用して、62,000x倍率で1s露光のために目的のグリッド領域の画像を取り、取得した画像を確認します。</li>
	<li>グリッドのイメージングが完了したら、列バルブを閉じ、グリッドホルダを列から取り外します。</li>
	<li>目的のすべてのグリッドのイメージングが終了すると、フィラメント電源をオフにして、顕微鏡から液体窒素デュワーを除去することによって、顕微鏡をシャットダウンします。</li>
	<li>顕微鏡の銅コイルから結露をキャッチするために、デュワーが座ったスタンドに水分を吸収するために何かを置きます。</li>
	<li>クライオサイクルモードを有効にして、ターボポンプがオフになっていることを確認します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berggard, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li><li>Huang, H., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+recall+estimates+for+two-hybrid+screens.">Precision and recall estimates for two-hybrid screens.</a> Bioinformatics. 25 (3), 372-378 (2009).</li><li>Serebriiskii, I. G., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-hybrid+system+and+false+positives.+Approaches+to+detection+and+elimination.">Two-hybrid system and false positives. Approaches to detection and elimination.</a> Methods in Molecular Biology. 177, 123-134 (2001).</li><li>Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+complexes+using+mass+spectrometry.">Analysis of protein complexes using mass spectrometry.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (8), 645-654 (2007).</li><li>Ngounou Wetie, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+stable+and+transient+protein-protein+interactions:+Past,+present,+and+future.">Investigation of stable and transient protein-protein interactions: Past, present, and future.</a> Proteomics. 13 (3-4), 538-557 (2013).</li><li>Schaufele, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+the+quantitative+accuracy+and+reproducibility+of+Forster+resonance+energy+transfer+measurement+for+screening+by+high+throughput+widefield+microscopy.">Maximizing the quantitative accuracy and reproducibility of Forster resonance energy transfer measurement for screening by high throughput widefield microscopy.</a> Methods. 66 (2), 188-199 (2014).</li><li>Berney, C., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+or+no+FRET:+a+quantitative+comparison.">FRET or no FRET: a quantitative comparison.</a> Biophysical Journal. 84 (6), 3992-4010 (2003).</li><li>Almen, M. S., Nordstrom, K. J., Fredriksson, R., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+human+membrane+proteome:+a+majority+of+the+human+membrane+proteins+can+be+classified+according+to+function+and+evolutionary+origin.">Mapping the human membrane proteome: a majority of the human membrane proteins can be classified according to function and evolutionary origin.</a> BMC Biology. 7, 50 (2009).</li><li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+drug+targets+are+there.">How many drug targets are there.</a> Nature Reviews in Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).</li><li>Berman, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Data+Bank.">The Protein Data Bank.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).</li><li>Overduin, M., Esmaili, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memtein:+The+fundamental+unit+of+membrane-protein+structure+and+function.">Memtein: The fundamental unit of membrane-protein structure and function.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 218, 73-84 (2019).</li><li>Qiu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+activity+of+lipid+bilayer+within+a+membrane-protein+transporter.">Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 115 (51), 12985-12990 (2018).</li><li>Knowles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins+solubilized+intact+in+lipid+containing+nanoparticles+bounded+by+styrene+maleic+acid+copolymer.">Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (22), 7484-7485 (2009).</li><li>Xue, M., Cheng, L., Faustino, I., Guo, W., Marrink, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+Lipid+Nanodisk+Formation+by+Styrene-Maleic+Acid+Copolymers.">Molecular Mechanism of Lipid Nanodisk Formation by Styrene-Maleic Acid Copolymers.</a> Biophysical Journal. 115 (3), 494-502 (2018).</li><li>Parmar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+SMALP+platform+to+determine+a+sub-nm+single+particle+cryo-EM+membrane+protein+structure.">Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure.</a> Biochimica and Biophysica Acta Biomembrames. 1860 (2), 378-383 (2018).</li><li>Yu, L., Lu, W., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AcrB+trimer+stability+and+efflux+activity,+insight+from+mutagenesis+studies.">AcrB trimer stability and efflux activity, insight from mutagenesis studies.</a> PLoS One. 6 (12), 28390 (2011).</li><li>Broussard, J. A., Rappaz, B., Webb, D. J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy+as+demonstrated+by+measuring+the+activation+of+the+serine/threonine+kinase+Akt.">Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt.</a> Nature Protocols. 8 (2), 265-281 (2013).</li><li>Ma, L., Yang, F., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+in+protein+studies.">Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).</li><li>Sachl, R., Humpolickova, J., Stefl, M., Johansson, L. B., Hof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+electronic+energy+transfer+in+the+determination+of+lipid+nanodomain+sizes.">Limitations of electronic energy transfer in the determination of lipid nanodomain sizes.</a> Biophysical Journal. 101 (11), 60-62 (2011).</li><li>Woehler, A., Wlodarczyk, J., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal/noise+analysis+of+FRET-based+sensors.">Signal/noise analysis of FRET-based sensors.</a> Biophysical Journal. 99 (7), 2344-2354 (2010).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+in+vitro+and+in+vivo+oligomeric+states+of+a+wild+type+and+mutant+trimeric+inner+membrane+multidrug+transporter.">Comparison of in vitro and in vivo oligomeric states of a wild type and mutant trimeric inner membrane multidrug transporter.</a> Biochemical and Biophysical Reports. 16, 122-129 (2018).</li><li>Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+on+Negative+Stain+Electron+Microscopy+Methods:+Tools+for+Tackling+Challenging+Systems.">Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).</li><li>Lu, W., Zhong, M., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+AcrB+Subunit+Precedes+Trimerization.">Folding of AcrB Subunit Precedes Trimerization.</a> Journal of Molecular Biology. 411 (1), 264-274 (2011).</li><li>Lebon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structure and Function of GPCRs. , 229-230 (2019).</li><li>Rames, M., Yu, Y., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+negative+staining:+a+high-throughput+protocol+for+examining+small+and+asymmetric+protein+structure+by+electron+microscopy.">Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).</li><li>Lee, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+detergent-free+isolation+of+membrane+proteins+in+their+local+lipid+environment.">A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).</li><li>Hall, S. C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acid-compatible+co-polymer+for+the+solubilization+of+membranes+and+proteins+into+lipid+bilayer-containing+nanoparticles.">An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles.</a> Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).</li><li>Oluwole, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+of+Membrane+Proteins+into+Functional+Lipid-Bilayer+Nanodiscs+Using+a+Diisobutylene/Maleic+Acid+Copolymer.">Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer.</a> Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).</li></ol>

Y.Gは、膜活性ポリマーNCMNP5-2およびNCMN系の発明者としてリストされている。

タンパク質とタンパク質の相互作用は、膜タンパク質の構造と機能の完全性にとって重要です。タンパク質とタンパク質の相互作用を調べるアプローチが数多く開発されています。可溶性タンパク質と比較すると、膜タンパク質およびそのPPIは、膜タンパク質の固有の本質的な特性のために研究することがより困難です。この難しさは、主に構造安定性と機能性のためのネイティブ脂質二重?...

タンパク質相互作用(PPI)は、タンパク質の構造と機能の維持からシステム全体の調節に至る生物学全体で重要な役割を果たします。PPI はさまざまな形式で提供され、どのような種類の相互作用を形成するかに基づいて分類できます。そのような分類の1つは、同一のサブユニットまたはサブユニットとして作用する異なるタンパク質間の相互作用であるかどうかに基づくホモオリゴメリックまたはヘテロオリゴメリックである。別の分類は、相互作用が安定した複合体または過渡的な複雑な状態の形成につながる場合の相互作用の強さに基づいています。タンパク質間のPPIに関する構造情報は、タンパク質が機能するメカニズムを理解する上で非常に重要です。タンパク質の80%以上が、その機能的役割を果たすために複雑な形成に依存していると推定されている。生物学におけるその重要性を適切に機能させるためにPPIに依存することが観察されたタンパク質の割合を考えると、容易に明らかであるが、タンパク質がPPIを形成しているときに実験的に観察できる技術の限界のために、これらの相互作用に関与するタンパク質を適切に調査できることは依然として困難である。
ノイズ、偽陽性、および偽陰性の高い量が現在利用可能なPPI決定技術の多くから導き出されるため、多くの実験的に決定されたPPIの結果の間には、高い意見の相違があります。これは特に酵母ツーハイブリッド(Y2H)系では、タンデムアフィニティー精製質量分析(TAP-MS)、蛍光共鳴エネルギー伝達(FRET)、PPI測定2、3、4、5、6、7に最も一般的に使用される方法の3つを表す。それに比べて、核磁気共鳴(NMR)、X線結晶学、電子顕微鏡(EM)などのタンパク質構造生物学技術を用いて、タンパク質とタンパク質の相互作用に関する高解像構造情報を原子レベルまで得ることができ、目的のタンパク質に対して発生する相互作用の直接的な視覚的確認を可能にする。現在利用可能な非構造ベースPPI決定研究技術(例えば、Y2H、TAP-MS、およびFRET)の全てがこの能力を欠き、さらにタンパク質間の弱い相互作用および一過性相互作用を同定するのが困難に苦しむ5。これらの欠点は、適切な第四級構造およびヘテロマー錯体集合体の形成に影響を与える脂質環境の追加変数によってもたらされる複雑性の増大に起因する膜タンパク質を研究する際にさらに強化される。
膜タンパク質はプロテオームの大部分を占めており、すべての生物の中で適切な細胞機能において多くの重要な役割を果たすことが知られています。膜タンパク質はヒトゲノムの27%を占め、現在の薬物標的の60%程度を占めると推定されているにもかかわらず、全ての公表タンパク質構造の約2.2%を占める膜タンパク質の解剖モデルの数に大きな異常がある。構造情報の入手可能性の不一致の主な原因は、膜タンパク質自体の本質的な特性にあります。溶解性が悪く、天然の構造や機能を維持するための脂質環境との相互作用に依存し、脂質膜自体の様々な物理化学的特性を研究する際に、膜タンパク質は大きな問題を引き続き表しています。これらの固有特性の中で、正確な構造情報を得るために最も重要なのは、天然の脂質環境との相互作用を持つことで、天然の構造と機能を維持する必要があります。脂質環境は膜蛋白質の構造や機能の一部としてこのような不可欠な部分であり、膜蛋白質の構造と機能11の基本単位としてメムテイン(膜とタンパク質との組み合わせ)の概念が提案されている。脂質とタンパク質の相互作用の重要性にもかかわらず、現在利用可能な構造ベースのPPI決定技術は、多くの場合、研究されているタンパク質が溶解しているか、洗剤で可溶化されている必要があります。過酷な洗剤への暴露は、タンパク質を変性させたり、脂質異常による偽陽性および陰性を引き起こし、凝集、タンパク質の変性、非共有結合相互作用の解離、人工オリゴマー状態の形成を誘発する可能性があります。膜蛋白質のネイティブオリゴマー状態を正確に決定するために自然な脂質環境を維持する必要性のために、我々は、以前に報告されたスチレンマレイン酸脂質粒子(SMALP)13法に基づいてネイティブ細胞膜ナノ粒子システム(NCMNs)12を開発した。 
SMALPは、膜活性ポリマーとしてスチレンマレイン酸共重合体を使用して、膜タンパク質を抽出し、可溶化します。ポリ(スチレン-コマレイン酸)(SMA)は、その疎水性スチレン部分と正反対の親水性マレイン酸部分に起因するユニークな両親媒性ポリマーです。pH依存機構14に吸着し、不安定化し、細胞膜を破壊することによってナノ粒子を形成する。SMAのこの機能活性は、膜タンパク質抽出および可溶化のための洗浄剤フリーシステムとして利用することを可能にするものである。NCMNシステムは、いくつかの側面でSMALPシステムとは異なります。NCMNシステムの最もユニークな特徴は、安定性とネイティブ機能のために異なる条件を必要とする多くの異なる膜タンパク質の単離に適したユニークな特性を有する多数のポリマーを有する膜活性ポリマーライブラリーを有することである。NCMNシステムは、ナノ粒子の調製に関しては、SMALP法と比較して異なるプロトコルを有する。そのような例の1つは、NCMNsが高分解能構造の決定のために単一ステップニッケル親和性カラム精製を使用することです。これらの異なるプロトコルの効果は、3.2および3.0 Å cryo-EM AcrB構造を生成したNCMNsプロトコルを比較する際に、SMALP法を用いた同様の研究を行い、8.8Å解像度12,15でクライオEMAcrB構造を生じさせた。NCMNシステムのこれらのユニークな特徴は、以前に確立されたSMALP法で行われた改善であり、PPIの研究のための理想的な候補になります。
多剤流出トランスポーターAcrBは、大腸菌12において機能的なホモトリマーとして存在する。変異原性分析は、AcrBトリマーの安定性を担うループ上に位置する単一のP223G点突然変異が、三量体状態を不安定化させ、天然の青いゲル電気泳動16で検出できる洗剤DDMで調製するとAcrBモノマーを生じさせることを示唆した。しかし、AcrB-P223G変異体のFRET分析は、天然細胞膜脂質二重層環境において、変異型AcrB-P223Gの大部分が依然として三量体として存在し、野生型AcrBおよびAcrB-P223Gの両方の発現レベルが類似していることを示唆した。しかしFRET分析結果にもかかわらず、変異型トランスポーターの活性アッセイは、野生型16と比較すると活性が劇的に低下することを示した。FRET技術はタンパク質とタンパク質相互作用の分析に広く使用されてきたが、研究は、しばしば偽陽性17、18、19、20を与えることができることを示している。
最近、AcrBトリマーの高解像度クライオEM構造は、NCMNs12の使用を通じてAcrBと関連する天然細胞膜脂質二重層との相互作用を示す決定された。原則として、NCMNsは、天然細胞膜に見られるタンパク質とタンパク質の相互作用の分析に容易に利用することができます。本システムの試験では、天然細胞膜ナノ粒子と陰性染色電子顕微鏡を用いてAcrB-P223Gのオリゴマー状態を直接観察する実験を行った。野生型AcrBナノ粒子と比較するために、NCMNライブラリー12に見られるAcrBおよび代替ポリマーの高解像度クライオEM構造決定に用いられている同じ膜活性ポリマー(NCMNライブラリでNCMNP1-1としてインデックス化された研究室製のSMA2000)を用いた。先に報告された結果に基づいて、AcrB-P223G変異体の大部分が三量体天然細胞膜ナノ粒子21の形で存在することが期待された。しかし、野生型AcrBで観察されたものなど、サンプルにはAcrB三分子は見つからなかった。これは、AcrB-P223Gの大部分が、以前に示唆されたように、ネイティブ細胞膜に三量子を形成しないことを示唆している。
ここでは、NCMを用いた野生型 大腸菌 AcrBとの比較における変異型 大腸 菌AcrB-P223Gの詳細な分析を報告する。AcrBのこのケーススタディは、NCMNがタンパク質とタンパク質相互作用分析に適したシステムであることを示唆しています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A38S-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>C-105-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (Dithiothreitol) (&#62; 99% pure) Protease free</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>DTT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>17525 1 KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>K-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AA3622636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-dimethylethylenediamine (EDTA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.03779.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCMNS-P5-2</td>
			<td>Not commercially available yet</td>
			<td>Submit request for obtaining to corresponding author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Dual Color Standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA2000</td>
			<td>Cray Valley</td>
			<td>Submit request for obtaining to corresponding author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>TCEP25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth Media</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75856 1 KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Ambinter</td>
			<td>Amb22348393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-26S XPI</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B14538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti JXN-30</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B34193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Electron Microscope Grids (10 nm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF300-Cu-TH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Con-Torque Tissue Homogenizer</td>
			<td>Eberbach</td>
			<td>E7265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning LSE Mini Microcentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>07-203-954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Avestin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction Collector F9-R</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29003875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-8004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000 Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>PN LL-IM-12AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000S-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>358013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump</td>
			<td>Razel Scientific Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai F20 200kV</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA pure 25 L1 FPLC</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)pLysS Cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C606003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP 5 ml Column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17524802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-24a</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>69749-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

native cell membrane nanoparticles system for membrane protein-protein interaction analysis

細胞膜系におけるタンパク質間相互作用は、細胞間相互作用からシグナル伝達まで、幅広い生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たします。環境信号のセンシングから生物学的応答まで代謝調節から発達制御へ。タンパク質相互作用の正確な構造情報は、膜タンパク質複合体の分子機構を理解し、これらのタンパク質を調節する非常に特異的な分子の設計に不可欠です。インビボおよびインビトロアプローチの多くは、タンパク質とタンパク質相互作用の検出と分析のために開発されています。その中でも構造生物学のアプローチは、原子レベルでタンパク質とタンパク質相互作用の直接的な構造情報を提供できる点でユニークです。しかし、現在の膜タンパク質構造生物学は、依然として洗剤ベースの方法に限られています。洗剤ベースの方法の主な欠点は、彼らのネイティブ脂質二重層環境が洗剤分子によって除去されると、しばしば膜タンパク質複合体を解別または変性させることです。膜蛋白質構造生物学のネイティブ細胞膜ナノ粒子系を開発しています。ここでは、AcrBのオリゴマー状態のケーススタディを用いて細胞膜上でのタンパク質相互作用の解析におけるこのシステムの使用を実証する。

ここで提示した手順を用いて、 大腸菌 AcrB野生型および 大腸菌 変異体AcrB-P223Gのサンプルを精製した。次いで、試料を、カーボンネガティブ染色電子顕微鏡グリッドに吸着し、ウラニル酢酸を使用して、サイドブロッティング法22で染色した。負の染色画像は透過型電子顕微鏡を用いて収集した。DDMで精製されたAcrB野生型試料の陰性染色像は、明確に定義され?...

Watch this Scientific Journal Video about Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis at JoVE.com

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

ここで提示される電子顕微鏡法と組み合わせてネイティブ細胞膜ナノ粒子系を利用する膜蛋白質のオリゴマー状態の決定のためのプロトコルです。

膜蛋白質相互作用解析用のネイティブ細胞膜ナノ粒子システム

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

native-cell-membrane-nanoparticles-system-for-membrane-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

5.9K ビュー.  Virginia Commonwealth University. ここで提示される電子顕微鏡法と組み合わせてネイティブ細胞膜ナノ粒子系を利用する膜蛋白質のオリゴマー状態の決定のためのプロトコルです。

ビデオ: Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

HCN1とTRIP8bの間のタンパク質 - タンパク質相互作用の小分子阻害剤を同定するための方法

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

生化学

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します<em&gt;インビトロ</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

生体分子構造決定のための単分子レベルでの高精度FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between proteins such as transcription factors (TFs) and their DNA target. The method presented here utilizes the underlying concept of the Y1H but is modified further to study and validate protein complexes binding to their target DNA. Hence, it is referred to as the modified yeast one-hybrid (Y1.5H) assay. This assay is cost effective and can be easily performed in a regular laboratory setting. Albeit using a heterologous system, the described method could be a valuable tool to test and validate the heteromeric protein complex binding to their DNA target(s) for functional genomics in any system of study, especially plant genomics.

The modified yeast one-hybrid assay described here is an extension of the classical yeast one-hybrid (Y1H) assay to study and validate the heteromeric protein complex-DNA interaction in a heterologous system for any functional genomics study.

異種タンパク質複合体-DNA相互作用研究のための改変酵母1ハイブリッドシステム

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

細胞内タンパク質間相互作用を研究するビオチン化セル透過ペプチド

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

ブルー ネイティブ電気泳動によってチラコイド膜タンパク質複合体の解析

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

細胞間の接触でタンパク質間相互作用の分析計蛍光の変動

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions largely depend on intracellular protein&#8211;protein interactions. Therefore, research regarding these interactions is indispensable to facilitating the understanding of physiologic processes. Co-precipitation of associated proteins, followed by mass spectrometry (MS) analysis, enables the identification of novel protein interactions. In this study, we have provided details of the novel technique of immunoprecipitation-liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis combined with on-membrane digestion for the analysis of protein&#8211;protein interactions. This technique is suitable for crude immunoprecipitants and can improve the throughput of proteomic analyses. Tagged recombinant proteins were precipitated using specific antibodies; next, immunoprecipitants blotted onto polyvinylidene difluoride membrane pieces were subjected to reductive alkylation. Following trypsinization, the digested protein residues were analyzed using LC-MS/MS. Using this technique, we were able to identify several candidate associated proteins. Thus, this method is convenient and useful for the characterization of novel protein&#8211;protein interactions.

Here, we present a protocol for an on-membrane digestion technique for the preparation of samples for mass spectrometry. This technique facilitates the convenient analysis of protein&#8211;protein interactions.

膜上消化技術を用いてのタンパク質・タンパク質相互作用の評価

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

大腸菌における異種発現による膜トランスポーターの特性評価と膜小胞の産生

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial membrane is a challenging environment to distinguish regulatory factors. Experimental control of protein and lipid components can help answer specific questions of regulation. Yet, quantitative manipulation of these factors is challenging in cellular assays. To investigate the molecular mechanism of mitochondria inner-membrane fusion, we introduced an in vitro reconstitution platform that mimics the lipid environment of the mitochondrial inner-membrane. Here we describe detailed steps for preparing lipid bilayers and reconstituting mitochondrial membrane proteins. The platform allowed analysis of intermediates in mitochondrial inner-membrane fusion, and the kinetics for individual transitions, in a quantitative manner. This protocol describes the fabrication of bilayers with asymmetric lipid composition and describes general considerations for reconstituting transmembrane proteins into a cushioned bilayer. The method may be applied to study other membrane systems.

Mitochondrial fusion is an important homeostatic reaction underlying mitochondrial dynamics. Described here is an in vitro reconstitution system to study mitochondrial inner-membrane fusion that can resolve membrane tethering, docking, hemifusion, and pore opening. The versatility of this approach in exploring cell membrane systems is discussed.

ミトコンドリア膜動態を再構成するためのモデル膜プラットフォーム

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...