Ce travail a été soutenu en partie par des fonds de démarrage de l’UCSD dirigés vers O.S.A.

1. Élevage de colonies de C. quinquefasciatus
<ol><li>Installez plusieurs colonies d’adultes de C. quinquefasciatus dans des cages à insectes. NOTE: Les colonies ont été fournies par la Dre Laura Harrington à l’Université Cornell20. Des protocoles détaillés pour l’élevage des moustiques Culex peuvent être trouvés dans d’autrespublications 21.<ol>
<li>Maintenez les moustiques à 25 ± 1 °C à 30% d’humidité avec un cycle jour/nuit de 12:12 h.</li>
		<li>Fournissez une solution de sucre à 20% ad libitum en introduisant un récipient de solution de sucre avec une mèche dans la cage ou en saturant des boules de coton avec la solution de sucre et en la plaçant dans la cage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laissez les moustiques s’accoupler pendant au moins 3 jours avant l’alimentation sanguine (Figure 2A).</li>
</ol>2. Collection d’embryons de C. quinquefasciatus au stade pré-blastodermique
<ol><li>Après 3 à 6 jours après l’eclosion, fournir aux femelles 1 à 2 mL d’une farine de sang bovine citrée à travers une membrane synthétique et chauffée à environ 40 °C dans un système d’alimentation sanguine (Figure 2B). Il existe également d’autres protocoles d’alimentation sanguine qui peuvent être utilisés pour les moustiques Culex (par exemple, voir ref21). REMARQUE: C. quinquefasciatus est connu pour une préférence pour le sang aviaire. Certains laboratoires utilisent des oiseaux vivants anesthésiés ou du sang aviaire pour leur source de farine de sang21,22,23. Cependant, les colonies peuvent être entraînées/sélectionnées pour se nourrir de sang bovin ou de petits rongeurs si cette caractéristique est sélectionnée pour plusieurs générations.<ol>
<li>Laissez les femelles se reposer pendant au moins 3 jours après l’alimentation sanguine pour subir une oogenèse et une maturation des œufs avant d’induire une ponte pour des expériences de micro-injection.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Le jour des microinjections embryonnaires, créez une tasse de ponte avec de l’eau de ponte infusée organiquement. L’eau de ponte doit être faite en fermentant les excréments de lapin (50 g / L), en décomposant l’herbe (4,5 g / L) ou la nourriture pour poissons (25 g / L) dans l’eau au cours de 5 jours ou plus24,25.</li>
	<li>Placez la coupe de ponte dans la cage et placez la cage entière dans un endroit sombre (Figure 2C).</li>
	<li>Après toutes les 30 minutes, vérifiez la tasse pour les radeaux d’œufs.<ol>
<li>Si des radeaux d’œufs sont présents, ramassez les radeaux en les ramassant avec un pinceau et placez-les sur un papier filtre humide (Figure 2D,E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Alignement des embryons au stade pré-blastodermique de C. quinquefasciatus
<ol><li>Séparez les œufs des radeaux en appuyant sur le radeau et en les séparant individuellement à l’aide d’un pinceau à pointe fine et d’une pince (Figure 2E).</li>
	<li>Aligner les œufs individuels sur une fine bande de ruban adhésif double face placée sur le dessus d’une glissière de verre (Figure 2F).</li>
	<li>Tout en alignant, essayez de pointer le côté antérieur de chaque œuf dans la même direction pour une accessibilité plus facile. REMARQUE: Une méthode alternative d’alignement des ovules sans ruban adhésif double face peut être trouvée dans un protocole de micro-injection embryonnaire de Nasonia vitripennis précédemment publié26.</li>
	<li>Couvrir les œufs avec le mélange d’huile d’halocarbure. REMARQUE: Le mélange d’halocarbures peut être préparé à l’avance en mélangeant doucement deux réactifs halocarbonés et de l’eau (9:1:20, halocarbure 700: halocarbone 27: eau ultrapure), puis en incubant le mélange pendant la nuit à25°Cpour faciliter la saturation en eau de l’huile d’halocarbure.</li>
</ol>4. Préparation à l’aiguille pour les microinjections
<ol><li>Générez les aiguilles de verre capillaire aluminosilicate à l’aide d’un arracheur de micropipette en verre.<ol>
<li>Placez un verre capillaire aluminosilicate dans un arracheur d’aiguilles, conformément aux instructions du manuel d’utilisation de l’arracheur d’aiguilles. REMARQUE: Des aiguilles capillaires en quartz et en borosilicate peuvent également être utilisées, mais pour cette expérience, l’aluminosilicate est préféré en raison de son prix relativement abordable et de sa durabilité.</li>
		<li>Réglez la chaleur sur 516, la vitesse sur 100, le retard sur 70, la traction sur 97 et la pression sur 500 sur l’arracheur d’aiguilles.</li>
		<li>Activez l’arracheur d’aiguilles, conformément aux instructions de l’arracheur et répétez au besoin pour des aiguilles supplémentaires. REMARQUE: Pendant le processus d’injection, les aiguilles se bouchent souvent ou se cassent accidentellement, par conséquent, il est fortement recommandé de tirer des aiguilles supplémentaires pour une seule expérience.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Biseautez la pointe de l’aiguille en touchant doucement la pointe de l’aiguille tirée sur la plaque abrasive diamantée rotative pendant environ 10 s à un angle de 50°. REMARQUE: Le biseautage de l’aiguille l’ouvre pour permettre au liquide de circuler tout en créant une pointe plus nette pour une pénétration plus facile dans l’embryon. Un exemple d’aiguille appropriée peut être vu dans un article précédent26.</li>
	<li>Rangez les aiguilles tirées et biseautées en les incorporant dans des lignes d’argile de modéliste dans une boîte de Pétri. REMARQUE: Pour assurer la meilleure qualité pour les pointes d’aiguilles, les aiguilles doivent être fraîchement tirées et biseautées aussi près que possible du moment de l’injection.</li>
</ol>5. Chargement du mélange d’injection
<ol><li>Préparer le mélange injectable composé de réactifs de modification du génome (p. ex., 200 ng/μL d’ARNs sg et 200 ng/μL de mélange Cas9), ou de solutions d’injection préférées et le conserver sur la glace. REMARQUE: Ce mélange peut être préparé en attendant que les œufs soient pondus. Plus de détails sur la production de Cas9 et d’ARNg et la préparation à la microinjection peuvent être trouvés dans les publications précédentes27,28,29,30.</li>
	<li>Chargez 2 μL de mélange d’injection dans l’aiguille d’injection à l’aide d’une pointe de microchargeur.</li>
</ol>6. Mise en place de la micro-injection
<ol><li>Placez l’aiguille d’injection remplie dans un micromanipulateur mis en place relié à un micro-injecteur électronique.</li>
	<li>Placez la lame de verre contenant les œufs alignés sur la scène d’un microscope composé.</li>
	<li>À l’aide du micromanipulateur et du microscope composé, alignez l’aiguille pour viser l’extrémité postérieure de l’embryon à un angle de 25 à 35 °.</li>
</ol>7. Microinjection embryonnaire (Figure 2G)
<ol><li>Insérez soigneusement l’aiguille dans l’embryon et injectez le mélange à une quantité d’environ 10% du volume de l’embryon (700-800 pL selon la taille des ovules). REMARQUE: Lors de l’injection, l’œuf devrait légèrement gonfler, cependant, si trop de liquide est injecté, les œufs peuvent éclater ou le liquide cytoplasmique peut s’échapper.</li>
	<li>Injectez environ 20 ovules à la fois, puis arrêtez et effectuez des procédures de récupération d’embryons. REMARQUE: Lors de l’injection, il y a un risque élevé que les aiguilles se bouchent ou se cassent. Si un bouchon se produit, ce qui peut être déterminé par un manque de liquide d’injection circulant à travers l’aiguille, essayez soit de nettoyer l’aiguille avec la fonction de nettoyage sur le micro-injecteur électronique, soit d’essayer de re-biseauter l’aiguille. Si aucune des deux étapes ne fonctionne, changez rapidement pour une nouvelle aiguille tout en vous assurant que les œufs préparés restent humidifiés.</li>
</ol>8. Récupération et éclosion des embryons
<ol><li>Laissez les œufs intacts pendant au moins 5 min. Dans les 20 minutes suivant l’injection, retirez soigneusement l’huile d’halocarbure en brossant légèrement avec un pinceau propre(Figure 2H).</li>
	<li>Soulevez doucement les œufs à l’aide d’un pinceau et placez-les dans une tasse d’eau double distillée(Figure 2I). Prenez soin de garder les œufs à la surface de l’eau.</li>
	<li>Vérifiez les œufs tous les jours pendant 7 jours pour l’éclosion (Figure 2J).</li>
	<li>Suivre les procédures normales d’élevagelarvaire 21.</li>
</ol>9. Dépistage de la modification du génome
<ol><li>Dépister les moustiques injectés pour les phénotypes mutants à l’aide d’un stéréoscope (Figure 2K).<ol>
<li>Vérifier les mutations qui n’ont pas un phénotype facilement reconnaissable, par amplification PCR, dosage de l’endonucléase I T7 et séquençage par sous-clonage de la région cible31.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mettre en place des croisements supplémentaires entre les individus injectés pour détecter les mutations héréditaires dans la lignée germinale.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Final Cumulative Maps and Data | West Nile Virus. CDC Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight">https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight</a> (2019)</li><li>APHIS | West Nile Virus (WNV). USDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv">https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv</a> (2020)</li><li>Luke George, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+impacts+of+West+Nile+virus+on+North+American+bird+populations.">Persistent impacts of West Nile virus on North American bird populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), 14290-14294 (2015).</li><li>van Riper, C., van Riper, S. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+insecticide+resistance+in+the+lymphatic+filariasis+vector+Culex+quinquefasciatus.">Transcriptomic analysis of insecticide resistance in the lymphatic filariasis vector Culex quinquefasciatus.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11406 (2019).</li><li>Norris, L. C., Norris, D. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia-based+population+control+strategy+targeting+Culex+quinquefasciatus+mosquitoes+proves+efficient+under+semi-field+conditions.">Wolbachia-based population control strategy targeting Culex quinquefasciatus mosquitoes proves efficient under semi-field conditions.</a> PloS One. 10 (3), 0119288 (2015).</li><li>Atyame, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+incompatibility+as+a+means+of+controlling+Culex+pipiens+quinquefasciatus+mosquito+in+the+islands+of+the+south-western+Indian+Ocean.">Cytoplasmic incompatibility as a means of controlling Culex pipiens quinquefasciatus mosquito in the islands of the south-western Indian Ocean.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (12), 1440 (2011).</li><li>Almeida, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Wolbachia+on+fitness+of+Culex+quinquefasciatus+(Diptera;+Culicidae).">Effects of Wolbachia on fitness of Culex quinquefasciatus (Diptera; Culicidae).</a> Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 11 (8), 2138-2143 (2011).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+confinable+gene+drive+system+in+the+human+disease+vector+Aedes+aegypti.">Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti.</a> eLife. 9, 51701 (2020).</li><li>Phuc, H. 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NEB Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i">https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i</a> (2020)</li></ol>

Avec les efforts récents pour générer des outils génétiquement modifiés pour la lutte contre les moustiques vecteurs, il est nécessaire de développer et d’optimiser les protocoles de micro-injection embryonnaires pour les vecteurs communs de la maladie des moustiques. Bien que des méthodes aient été développées pour les moustiques Aedes et Anophèles, un protocole conçu spécifiquement pour Culex a été peu exploré. En général, les protocoles d’injection d’embryons de moustiques peuvent être divisés en 3 étapes générales: 1) la collecte et la préparation d’embryons, 2) l’injection d’embryons et 3) la récupération post-injection. Afin de générer avec succès des mutants, les trois étapes doivent être optimisées pour l’espèce cible. Ce protocole modifié pour la microinjection embryonnaire est spécifique à la réussite de l’ingénierie du génome des moustiques Culex.
La maximisation de la collecte d’embryons est un goulot d’étranglement courant dans les protocoles de micro-injection d’embryons. Afin d’augmenter le nombre d’œufs collectés en peu de temps, les moustiques ont été limités à partir d’un substrat de ponte pendant 2-3 jours après le repas de sang. Il est important de noter que C. quinquefasciatus a tendance à préférer les sources de sang aviaire aux sources de mammifères ou à l’alimentation membranaire avec du sang de mammifères. Cependant, de nombreux chercheurs ont du mal à acquérir une source fiable d’oiseaux vivants ou de sang aviaire pour l’alimentation sanguine, de sorte que les stocks de laboratoire peuvent être adaptés pour se nourrir de sources de sang plus accessibles. Il est également crucial d’utiliser de l’eau riche en nutriments pour le substrat de ponte, car elle fournit des signaux de ponte pour C. quinquefasciatus et la plupart des autres vecteurs Culex. Il existe de nombreuses méthodes pour générer de l’eau riche en nutriments, qui peuvent devoir être optimisées entre les laboratoires pour s’assurer qu’un nombre approprié d’œufs sont disponibles pour la micro-injection. Par exemple, alors que cette méthode a été la plus efficace avec des excréments de lapin fermentés dans de l’eau désionisée pendant 5 jours ou plus, d’autres chercheurs ont plus de succès avec l’herbe ou la nourriture pour poissons comme source de nutriments et certains même avec de l’eau distillée21.
Étant donné que les moustiques Culex pondent des groupes d’œufs dans des radeaux, la collecte des œufs est assez simple. Les œufs peuvent simplement être ramassés en ramassant tout le radeau avec un pinceau. La séparation des ovules est plus compliquée, mais essentielle pour une injection réussie. Les œufs peuvent être soigneusement séparés du radeau en appliquant une légère pression vers le bas entre les œufs avec un pinceau ou une pince. Avec un peu de pratique, plusieurs utilisateurs ont pu séparer de manière fiable des œufs uniques des radeaux d’œufs. Après avoir séparé chaque œuf, les œufs sont alignés dans la même orientation sur du ruban adhésif double face, ce qui stabilise les œufs pendant la microinjection. Les œufs sont injectés dans l’extrémité postérieure effilée et l’ajout d’huile d’halocarbure maintient les œufs humides pendant la manipulation.
Pour limiter les dommages embryonnaires pendant la microinjection, les aiguilles d’injection doivent être d’une force appropriée et biseautées à un angle approprié. Les aiguilles en aluminosilicate biseautées pendant 10 secondes à un angle de 50° ont eu les meilleurs résultats, mais les aiguilles en borosilicate et en quartz peuvent également fonctionner, même si elles peuvent être moins durables et plus chères. De plus, un biseautage approprié de l’aiguille facilite une meilleure circulation des mélanges Cas9 et sgRNA et crée un point plus net pour une pénétration plus facile dans l’embryon. Dans de nombreux cas, le biseautage est également un moyen efficace de réparer rapidement les aiguilles obstruées au lieu de passer du temps et des efforts à remplacer les aiguilles obstruées.
Après l’injection, les œufs doivent rester intacts pendant au moins 5 minutes, l’huile d’halocarbure étant retirée immédiatement après en la brossant doucement avec un pinceau propre. Après le retrait de l’huile d’halocarbure, les œufs injectés peuvent être placés dans l’eau pour éclore, ce qui se produit généralement dans les 3 jours suivant l’injection. Avec de la pratique et un nombre suffisant d’œufs, ce protocole peut obtenir des mutations somatiques et germinales cohérentes chez C. quinquefasciatus et est suffisamment polyvalent pour être facilement adaptable aux autres moustiques Culex.

C. quinquefasciatus, communément appelé le moustique domestique du sud, est un vecteur compétent de nombreux agents pathogènes, y compris le virus du Nil occidental (VNO), l’encéphalite japonaise, l’encéphalite de Saint-Louis et l’encéphalite équine de l’Est. En particulier, depuis qu’il a été détecté pour la première fois à New York en 1999, le VNO est devenu une maladie à transmission vectorielle majeure dans l’ensemble de la partie continentale des États-Unis (US) avec plus de 50 000 cas humains signalés entraînant environ 2 300 décès entre 1999 et 20181 ainsi que plus de 4 500 cas équins signalés entre 2008 et 20192. De plus, au moins 23 espèces d’oiseaux trouvées en Amérique du Nord ont été touchées par des infections par le VNO, avec au moins 12 espèces classées comme irrécupérables à la suite du VNO3. L’impact du VNO sur les populations humaines, équines et aviaires est dû au comportement alimentaire opportuniste de ses vecteurs. En règle générale, les oiseaux sont les principaux hôtes du VNO, et les humains et les chevaux sont des hôtes accidentels ou sans issue. Certains agents pathogènes vecteurs par C. quinquefasciatus n’infectent que les oiseaux tels que le parasite du paludisme aviaire, Plasmodium relictum. À Hawaï, C. quinquefasciatus est un vecteur principal du paludisme aviaire et a provoqué l’extinction de nombreuses espèces d’oiseaux indigènes4,5.
Pour lutter contre les maladies transmises par C. quinquefasciatus,les chercheurs et les organismes de lutte antivectorielle ont utilisé des outils de lutte contre la population de moustiques couramment établis tels que l’application d’insecticides6,cependant, ces méthodes sont coûteuses, non spécifiques à l’espèce, et ont une efficacité limitée car la résistance aux insecticides est élevée dans de nombreuses populations de C. quinquefasciatus 6,7,8,9. D’autres techniques de contrôle, telles que les stratégies de contrôle de la population basées sur Wolbachiaont été développées ces dernières années10,11, mais les coûts de condition physique associés à l’infection à Wolbachia limitent la faisabilité de cette approche pour ce vecteur12. Il existe également des méthodes de contrôle génétiques qui ont été développées chez d’autres espèces de moustiques telles que Aedes aegypti13,14, Anopheles gambiae15 et Anopheles stephensi16, y compris le développement de moustiques résistants aux agents pathogènes17,18,19, qui pourraient également être développés pour C. quinquefasciatus si les outils d’ingénierie du génome requis sont développé pour cette espèce. Cependant, la biologie de C. quinquefasciatus diffère considérablement des autres moustiques vecteurs Aedes et Anophèles, ce qui a rendu difficile le développement de technologies génétiques similaires dans ce vecteur. Avec l’avènement des technologies d’ingénierie du génome basées sur CRISPR, l’ingénierie du génome de précision est devenue de plus en plus triviale, abordable et adaptable et a par conséquent conduit au développement de nouveaux outils génétiques dans une grande variété d’espèces.
Pour générer des mutations avec les technologies basées sur CRISPR, un mélange de protéine Cas9 et d’ARN guide synthétique (SGRNA), complémentaire aux loci souhaités, est microinjecté dans des embryons au stade pré-blastoderme. Étant donné que les femelles de C. quinquefasciatus pondent leurs œufs en groupes attachés dans une structure de radeau flottant (Figure 1), par opposition à l’ovoïposion d’œufs individuels, un trait des moustiques Aedes et Anophèles, les microinjections embryonnaires sont de plus en plus compliquées chez cette espèce. Les larves de Culex émergent également de la face antérieure de chaque œuf, qui est en contact avec la surface de l’eau (Figure 1), de sorte que l’orientation de l’œuf après manipulation est importante chez cette espèce. Nous décrivons ici un protocole détaillé conçu pour la microinjection de la protéine Cas9 et de l’ARNg dans des embryons de C. quinquefasciatus. Ce protocole a été conçu pour s’adapter aux caractéristiques propres à la biologie Culex afin d’améliorer la survie des embryons et les taux de mutation du génome à travers certaines étapes qui sont essentielles pour la collecte et la survie des ovules en temps opportun.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>9 oz clear plastic pet cup</td>
			<td>Karat</td>
			<td>C-KC9</td>
			<td>Insect Rearing and Egg Collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>Microinjection, borosilicate and quartz needles could also be used but we prefered aluminosilicate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood</td>
			<td>Colorado Serum Company</td>
			<td>31025</td>
			<td>The colony took multiple generations to adapt to this blood source. Other blood sources are likely just as appropriate. See protocol notes on blood source selection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bugdorm</td>
			<td>Bugdorm</td>
			<td>4F2222</td>
			<td>Insect Rearing Cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 Protein with NLS</td>
			<td>PNABio</td>
			<td>CP01</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound Microscope</td>
			<td>Olympus BX41</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection, for embryo injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>104E</td>
			<td>Microinjection, to be used with beveler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase/RNase-Free distilled Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>B084NVQGXD</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet 4x or 4i programmable microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotips Microloader tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Microinjection, embryo collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tip paintbrush</td>
			<td>ZEM</td>
			<td>2595</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8773</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemotek</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>PS5</td>
			<td>Line Maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Beveler</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BV10</td>
			<td>Microinjection, needle beveling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000 or P-2000</td>
			<td>Microinjection, needle pulling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Drying Modeling Clay</td>
			<td>Jovi</td>
			<td>B0025Z71IM</td>
			<td>Microinjection, needle storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td>Microinjection, for embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugar</td>
			<td>Domino</td>
			<td></td>
			<td>20% sugar solution for adult sugar source.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0302</td>
			<td>Preparation of microinjection materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>K451020</td>
			<td>Preparation of microinjection materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-fine tip forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-121</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embryo microinjection techniques for efficient site-specific mutagenesis in culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus est vecteur d’un large éventail de maladies à transmission vectorielle telles que le paludisme aviaire, le virus du Nil occidental (VNO), l’encéphalite japonaise, l’encéphalite équine de l’Est, la filariose lymphatique et l’encéphalite de Saint-Louis. Notamment, le paludisme aviaire a joué un rôle majeur dans l’extinction de nombreuses espèces endémiques d’oiseaux insulaires, tandis que le VNO est devenu une maladie à transmission vectorielle importante aux États-Unis. Pour mieux comprendre la biologie de C. quinquefasciatus et élargir sa boîte à outils de contrôle génétique, nous devons développer des méthodes plus efficaces et abordables pour l’ingénierie du génome chez cette espèce. Cependant, certains traits biologiques uniques aux moustiques Culex, en particulier leurs radeaux d’œufs, ont rendu difficile l’exécution des procédures de micro-injection requises pour l’ingénierie du génome. Pour relever ces défis, nous avons développé un protocole de micro-injection embryonnaire optimisé qui se concentre sur l’atténuation des obstacles techniques associés aux caractéristiques uniques des moustiques Culex. Ces procédures démontrent des méthodes optimisées pour la collecte des ovules, la séparation des radeaux d’œufs et d’autres procédures de manipulation essentielles à la réussite de la microinjection chez C. quinquefasciatus. Lorsqu’elles sont associées à la technologie d’édition du génome CRISPR/Cas9, ces procédures nous permettent d’obtenir des mutations germinales spécifiques au site, efficaces et héréditaires, qui sont nécessaires pour effectuer une ingénierie génomique avancée et développer des technologies de contrôle génétique dans ce vecteur de maladie important, mais actuellement sous-étudié.

Dans des expériences publiées précédemment, cette méthode a été utilisée pour générer avec succès des mutations somatiques et germinales d’un gène essentiel au développement de la pigmentation des yeux foncés, le blanc (CPIJ005542)30 (tableau 1). Les mutations somatiques générées par CRISPR/Cas9 ont été notées par dépistage de la perte de pigmentation dans les yeux nymphaux des individus injectés (G0). Les mutations somatiques étaient généralement présentes sous forme de phénotypes en mosaïque où certaines cellules, mais pas toutes, ont le phénotype mutant. Par exemple, des mutations somatiques du gène blanc ont abouti à un mélange d’ommatidies avec des phénotypes dépourvus de pigmentation et de ceux avec un phénotype pigmenté de type sauvage30. Cependant, lorsqu’il y a eu une mutation germinale du gène blanc, la génération suivante (G1)a hérité du phénotype complet des yeux blancs. Les taux de mutation germinale ont été déterminés en croisant les individus de la mosaïque G0 et en marquant pour une progéniture aux yeux complètement blancs (G1). Ces expériences ont abouti à un taux de survie embryonnaire de 64% à 82%, ainsi qu’à un taux de mutagénèse somatique de 37% à 57% et à un taux de mutagénèse germinale de >61% (Tableau 1). En multiplexant les sgRNA pour cibler plusieurs loci dans le même gène, les taux de mutagénèse somatique et germinale ont augmenté jusqu’à 86% (Tableau 1). En outre, pendant de nombreuses générations, des stocks homozygotes viables de mutants blancs ont été conservés avec succès en laboratoire.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig01.jpg"> Figure 1 : Radeau d’œufs de C. quinquefasciatus et morphologie d’un seul œuf. Vues dorsales (A), latérales (B) et ventrales (C) des radeaux d’œufs C quinquefasciatus. Les femelles de C. quinquefasciatus pondent leurs œufs, la face antérieure la plus bulbeuse touchant la surface de l’eau tandis que la face postérieure la plus pointue loin de la surface de l’eau (D). A- antérieur; P- postérieur <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61375/61375fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2.jpg"> Figure 2 : Chronologie de création des mutants de C. quinquefasciatus par microinjection. Chronologie de la préparation de la colonie de C. quinquefasciatus et de la collecte d’embryons pour la microinjection (A-D). Les œufs collectés sont ensuite séparés (E) alignés dans la même orientation et recouverts d’huile halocarbonée (F). Les œufs sont ensuite injectés (G) et laissés au repos pendant au moins 5 min avant de retirer l’huile d’halocarbure (H). Les œufs sont ensuite transférés dans une source d’eau propre (I) pour l’éclosion (J) et examinés pour les phénotypes mutants (K). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">Survie</td>
			<td colspan="3">Mosaïcisme somatique (G0)</td>
			<td>Mutagénèse germinale (G1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>ARNg</td>
			<td>#injected</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>Total (%)</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>Total (%)</td>
			<td>G1 mutants (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1</td>
			<td>50</td>
			<td>15</td>
			<td>20</td>
			<td>35(70)</td>
			<td>7(47)</td>
			<td>13(65)</td>
			<td>20(57)</td>
			<td>128(69)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-2</td>
			<td>50</td>
			<td>9</td>
			<td>32</td>
			<td>41(82)</td>
			<td>3(33)</td>
			<td>12(38)</td>
			<td>15(37)</td>
			<td>51(61)</td>
		</tr>
<tr>
<td>arNNc-3</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>15</td>
			<td>32(64)</td>
			<td>7(41)</td>
			<td>8(53)</td>
			<td>15(47)</td>
			<td>157(72)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2</td>
			<td>50</td>
			<td>7</td>
			<td>16</td>
			<td>23(46)</td>
			<td>5(71)</td>
			<td>12(75)</td>
			<td>17(74)</td>
			<td>123(79)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>13</td>
			<td>9</td>
			<td>22(44)</td>
			<td>10(77)</td>
			<td>6(67)</td>
			<td>16(73)</td>
			<td>72(81)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>10</td>
			<td>27(54)</td>
			<td>13(76)</td>
			<td>8(80)</td>
			<td>21(78)</td>
			<td>101(85)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>11</td>
			<td>10</td>
			<td>21(42)</td>
			<td>9(82)</td>
			<td>9(90)</td>
			<td>18(86)</td>
			<td>149(86)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Taux de survie et de mutation des embryons injectés avec des ARNg simples et multiplexés ciblant le blanc. Le tableau est réimprimé avec l’autorisation de30

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Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Ce protocole décrit les procédures de micro-injection pour les embryons de Culex quinquefasciatus qui sont optimisées pour fonctionner avec les outils d’édition de gènes CRISPR/Cas9. Cette technique peut générer efficacement des mutations germinales héréditaires spécifiques au site qui peuvent être utilisées pour construire des technologies génétiques dans ce vecteur de maladie peu étudié.

Techniques de microinjection embryonnaire pour une mutagénèse efficace spécifique au site chez Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

embryo-microinjection-techniques-for-efficient-site-specific

Research

JoVE Journal

Genetics

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

5.3K vues.  University of California, San Diego. Ce protocole décrit les procédures de micro-injection pour les embryons de Culex quinquefasciatus qui sont optimisées pour fonctionner avec les outils d’édition de gènes CRISPR/Cas9. Cette technique peut générer efficacement des mutations germinales héréditaires spécifiques au site qui peuvent être utilisées pour construire des technologies génétiques dans ce vecteur de maladie peu étudié.

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Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Cytoplasmique microinjection dans zygotes Bétail assistée par laser

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Recherche

Génétique

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Livraison de Nucleic Acids par Embryo microinjection dans le monde entier agricole contre les insectes ravageurs,<em&gt; Ceratitis capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, such as transcription, DNA replication, and DNA repair. HMGB1 binds to structurally distorted DNA with higher affinity than to canonical B-DNA. For example, we found that HMGB1 binds to DNA interstrand crosslinks (ICLs), which covalently link the two strands of the DNA, cause distortion of the helix, and if left unrepaired can cause cell death. Due to their cytotoxic potential, several ICL-inducing agents are currently used as chemotherapeutic agents in the clinic. While ICL-forming agents show preferences for certain base sequences (e.g., 5&#39;-TA-3&#39; is the preferred crosslinking site for psoralen), they largely induce DNA damage in an indiscriminate fashion. However, by covalently coupling the ICL-inducing agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO), which binds to DNA in a sequence-specific manner, targeted DNA damage can be achieved. Here, we use a TFO covalently conjugated on the 5&#39; end to a 4&#39;-hydroxymethyl-4,5&#39;,8-trimethylpsoralen (HMT) psoralen to generate a site-specific ICL on a mutation-reporter plasmid to use as a tool to study the architectural modification, processing, and repair of complex DNA lesions by HMGB1 in human cells. We describe experimental techniques to prepare TFO-directed ICLs on reporter plasmids, and to interrogate the association of HMGB1 with the TFO-directed ICLs in a cellular context using chromatin immunoprecipitation assays. In addition, we describe DNA supercoiling assays to assess specific architectural modification of the damaged DNA by measuring the amount of superhelical turns introduced on the psoralen-crosslinked plasmid by HMGB1. These techniques can be used to study the roles of other proteins involved in the processing and repair of TFO-directed ICLs or other targeted DNA damage in any cell line of interest.

Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.

Des outils pour étudier le rôle de l&#39;architecture Protein HMGB1 dans le traitement des Helix effets de distorsion, l&#39;ADN spécifique du site InterStrand Crosslinks

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Optogénétiques mutagenèse aléatoire Utilisation Histone-miniSOG dans<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

Targeted<em&gt; In Situ</em&gt; mutagenèse de Histone gènes dans la levure bourgeonnante

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Microinjection de l’embryon et de la Technique de Transplantation pour la Manipulation du génome Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve random mutagenesis, error-prone PCR is a convenient and efficient strategy for generating a diverse pool of mutants (i.e., a mutant library). Error-prone PCR is the method of choice when a researcher seeks to mutate a pre-defined region, such as the coding region of a gene while leaving other genomic regions unaffected. After the mutant library is amplified by error-prone PCR, it must be cloned into a suitable plasmid. The size of the library generated by error-prone PCR is constrained by the efficiency of the cloning step. However, in the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, the cloning step can be replaced by the use of a highly efficient one-step fusion PCR to generate constructs for transformation. Mutants of desired phenotypes may then be selected using appropriate reporters. Here, we describe this strategy in detail, taking as an example, a reporter inserted at centromeric heterochromatin.

This article describes a detailed methodology for random mutagenesis of a target gene in fission yeast. As an example, we target rpt4+, which encodes a subunit of the 19S proteasome, and screen for mutations that destabilize heterochromatin.

Gène-cible de la mutagénèse aléatoire pour sélectionner des Mutants de protéasome déstabilisant de l’hétérochromatine chez la levure

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to visceral pathology. Deciphering the nature of the vector/parasite interactions is of primary importance for better understanding of Leishmania transmission to their hosts. Among the parameters controlling the sand fly vector competence (i.e. their ability to carry and transmit pathogens), parameters intrinsic to these insects were shown to play a key role. Insect immune response, for example, impacts sand fly vector competence to Leishmania. The study of such parameters has been limited by the lack of methods of gene expression modification adapted for use in these non-model organisms. Gene downregulation by small interfering RNA (siRNA) is possible, but in addition to being technically challenging, the silencing leads to only a partial loss of function, which cannot be transmitted from generation to generation. Targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 technology was recently adapted to the Phlebotomus papatasi sand fly. This technique leads to the generation of transmissible mutations in a specifically chosen locus, allowing to study the genes of interest. The CRISPR/Cas9 system relies on the induction of targeted double-strand DNA breaks, later repaired by either Non-Homologous End Joining (NHEJ) or by Homology Driven Repair (HDR). NHEJ consists of a simple closure of the break and frequently leads to small insertion/deletion events. In contrast, HDR uses the presence of a donor DNA molecule sharing homology with the target DNA as a template for repair. Here, we present a sand fly embryo microinjection method for targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 using NHEJ, which is the only genome modification technique adapted to sand fly vectors to date.

Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

This protocol details the steps of CRISPR/Cas9 targeted mutagenesis in sand flies: embryo collection, injection, insect rearing, and identification as well as selection of mutations of interest.

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microinjection embryonnaire pour CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

Injections d’embryons pour la mutagenèse médiée par CRISPR dans le saltateur Harpegnathos de fourmi

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA fragments encoding genes of interest as well as favorable traits into the insect germline in a stable and heritable manner. The resulting transgenic strains can be studied for phenotypic changes resulting from the expression of the integrated DNA to answer basic questions or used in practical applications. Although the technology is straightforward, it requires of the investigator patience and practice to achieve a level of skill that maximizes efficiency. Shown here is a method for microinjection of embryos of the African malaria mosquito, Anopheles gambiae. The objective is to deliver by microinjection exogenous DNA to the embryo so that it can be taken up in the developing germline (pole) cells. Expression from the injected DNA of transposases, integrases, recombinases, or other nucleases (for example CRISPR-associated proteins, Cas) can trigger events that lead to its covalent insertion into chromosomes. Transgenic An. gambiae generated from these technologies have been used for basic studies of immune system components, genes involved in blood-feeding, and elements of the olfactory system. In addition, these techniques have been used to produce An. gambiae strains with traits that may help control the transmission of malaria parasites.

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Microinjection techniques are essential to introduce exogenous genes into the genomes of mosquitoes. This protocol explains a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles gambiae embryos to generate transformed mosquitoes.

Méthode de micro-injection pour les embryons d’anophèles gambiens

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA ...