この作業の一部は、O.S.Aに向けられたUCSDスタートアップファンドによってサポートされました。

1. C. クィケファシアトゥス コロニー飼育
<ol><li>バグ寮ケージに C.キンケファシアトゥス 大人の複数のコロニーを設定します。 注:コロニーはコーネル大学20でローラ・ハリントン博士によって提供されました。 Culex 蚊を飼育するための詳細なプロトコルは、他の文献21で見つけることができます。<ol>
<li>12:12時間の昼/夜サイクルで湿度30%で25±1 °Cで蚊を維持します。</li>
		<li>20%の砂糖溶液のアドリビタムを提供し、芯を入れた砂糖溶液容器をケージに入れるか、または綿ボールを砂糖溶液で飽和させ、ケージ内に入れます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>蚊が血液を摂食する前に少なくとも3日間交尾することを許可する(図2A)。</li>
</ol>2. C.キンケファシアトゥス プレブラコデドム期胚の収集
<ol><li>3〜6日後のエローションの後、女性に、合成膜を通して1〜2mLのクビシ血液食を与え、血液供給システムで約40°Cに加熱した(図2B)。また、Culex蚊に使用できる代替の血液供給プロトコルもあります(例えば、ref21を参照してください)。 注:C.キンケファシアトゥスは、鳥の血液の好みで知られています。いくつかの研究室は、血液の食事源21、22、23のために麻酔を受けた生きた鳥や鳥の血液を使用しています。しかし、この機能が複数の世代にわたって選択されている場合、コロニーはウシの血液または小さなげっ歯類を食べるように訓練/選択することができます。<ol>
<li>女性は、マイクロインジェクション実験のための卵子を誘発する前に、卵の発生と卵の成熟を受けるために、血液の供給後に最低3日間休むことを可能にします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>胚性マイクロインジェクションの日に、有機的に注入された卵子水で卵子カップを作成します。卵子水は、ウサギの便(50 g/L)、草(4.5 g/L)、または魚の食べ物(25g/L)を5日以上の間に水に分解することによって作られるべきです。</li>
	<li>オビポジションカップをケージに入れ、ケージ全体を暗い場所に置きます(図2C)。</li>
	<li>30分ごとに、カップに卵のいかだがないか確認してください。<ol>
<li>卵のいかだが存在する場合は、ペイントブラシでそれらをすくっていかだを収集し、ウェットフィルター紙の上に置きます(図2D,E)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. C.クムケファシアトゥスプレブラスターデドム期胚のアライメント
<ol><li>いかだを押し下げて、細かい先端のペイントブラシと鉗子を使って卵を個別に引き離して、いかだから卵を分離します(図2E)。</li>
	<li>ガラススライドの上部に置かれた両面付箋テープの薄いストリップに個々の卵を揃える(図2F)。</li>
	<li>整列しながら、アクセシビリティを容易にするために、各卵の前側を同じ方向に向けてみてください。 注:両面付き粘着テープを使用しない代替卵アライメント方法は、以前に公開された ナソニアビトリペニス 胚マイクロインジェクションプロトコル26で見つけることができます。</li>
	<li>ハロカーボンオイルミックスで卵を覆います。 注:ハロカーボンミックスは、2つのハロカーボン試薬と水(9:1:20、ハロカーボン700:ハロカーボン27:超純水)を穏やかに混合し、25°Cで一晩インキュベートしてハロカーボンオイルの水飽和を容易にすることによって、事前に調製することができます。</li>
</ol>4. マイクロインジェクション用の針の準備
<ol><li>ガラスマイクロピペットプーラーを使用して、アルミノケイ酸キャピラリーガラス針を生成します。<ol>
<li>針の引き手のユーザーマニュアルからの指示に従って、アルミノケイ酸キャピラリーガラスを針の引き手に入れます。 注:石英およびホウケイ酸毛細血管針も使用できますが、この実験では、アルミノケイ酸塩は相対的な手頃な価格と耐久性のために好まれます。</li>
		<li>[熱]を 516、速度を 100 に、[遅延] を 70 に、[97 にプル]、および [圧力] をニードル プーラーで 500 に設定します。</li>
		<li>引き手の指示に従って針の引き手を作動させ、追加の針のために必要に応じて繰り返します。 注: 注射プロセス中に針が詰まったり、誤って壊れたりすることが多いため、1 回の実験で追加の針を引っ張ることを強くお勧めします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>回転するダイヤモンドの研磨板の上で、50°の角度で約10sのプル針の先端にそっと触れることで、針先をベベルします。 注:針をベベルすると、液体が流れるように開き、胚への浸透を容易にするためにより鋭い先端を作成します。適切な針の例は、前の記事26で見ることができます。</li>
	<li>ペトリ皿のモデラーの粘土のラインに埋め込むことによって、針を引っ張ってベベリングした針を保管してください。 注:針の先端のための最高の品質を確保するために、針は、注射の時間にできるだけ近い、新鮮に引っ張られ、ベベにする必要があります。</li>
</ol>5. 注入混合物のロード
<ol><li>ゲノム修飾試薬(例えば、200 ng/μL sgRNAおよび200 ng/μL Cas9混合物)からなる注入混合物を準備するか、または好ましい注入溶液を氷の上に保つ。 注:このミックスは、卵が産まれるのを待っている間に準備することができます。Cas9 および sgRNA の生産とマイクロインジェクションの準備の詳細については、前の出版物27,28,29,30を参照してください。</li>
	<li>マイクロローダーチップを使用して注射針に2μLの注入混合物をロードします。</li>
</ol>6. マイクロインジェクションのセットアップ
<ol><li>充填された注射針を、電子マイクロインジェクターにリンクされたマイクロマニピュレータセットに入れる。</li>
	<li>コンパウンド顕微鏡のステージ上に、整列した卵を含むガラススライドを置きます。</li>
	<li>マイクロマニピュレーターと複合顕微鏡を使用して、針を合わせて、25~35°の角度で胚の後端を目指します。</li>
</ol>7. 胚マイクロインジェクション(図2G)
<ol><li>慎重に針を胚に挿入し、胚の体積の約10%の量(卵の大きさに応じて700〜800 pL)の混合物を注入する。 注:注入すると、卵はわずかに膨らむはずですが、あまりにも多くの液体を注入すると、卵が破裂したり、細胞質流体が漏れたりすることがあります。</li>
	<li>一度に約20個の卵を注入し、停止して胚の回復手順を実行します。 注:注射中に、針が詰まったり壊れたりする可能性が高くなります。詰まりが発生した場合は、注射液が針を流れる不足によって判断される可能性があり、電子マイクロインジェクターのクリーン機能で針を掃除するか、針を再びベベリングしてみてください。どちらのステップもうまくいかない場合は、準備された卵が湿ったままであることを確認しながら、すぐに新しい針に変更します。</li>
</ol>8. 胚の回復と孵化
<ol><li>卵を少なくとも5分間邪魔しません。20分以内に、きれいなペイントブラシで軽くブラッシングしてハロカーボンオイルを慎重に取り除きます(図2H)。</li>
	<li>卵をペイントブラシでやさしく持ち上げ、二重蒸留水のカップに入れます(図2I)。水面に卵を保管するように注意してください。</li>
	<li>卵が孵化するために毎日7日間チェックしてください(図2J)。</li>
	<li>通常の幼虫飼育手順21に従ってください。</li>
</ol>9. ゲノム改変のスクリーニング
<ol><li>ステレオスコープを使用して、突然変異型のフェノタイプのために注入された蚊をスクリーニングする(図2K)。<ol>
<li>容易に認識可能な表現型を有しない突然変異を検証し、PCR増幅により、T7エンドヌクレアーゼIアッセイ、および標的領域31のサブクローニングによるシーケンシングを行う。</li>
	</ol>
</li>
	<li>生殖細胞系列内の遺伝性突然変異を検出するために注入された個人間の追加の十字架を設定します。.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Final Cumulative Maps and Data | West Nile Virus. CDC Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight">https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight</a> (2019)</li><li>APHIS | West Nile Virus (WNV). USDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv">https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv</a> (2020)</li><li>Luke George, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+impacts+of+West+Nile+virus+on+North+American+bird+populations.">Persistent impacts of West Nile virus on North American bird populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), 14290-14294 (2015).</li><li>van Riper, C., van Riper, S. G., Lee Goff, M., Laird, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Epizootiology+and+Ecological+Significance+of+Malaria+in+Hawaiian+Land+Birds.">The Epizootiology and Ecological Significance of Malaria in Hawaiian Land Birds.</a> Ecological Monographs. 56 (4), 327-344 (1986).</li><li>Liao, W., Atkinson, C. T., LaPointe, D. A., Samuel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitigating+Future+Avian+Malaria+Threats+to+Hawaiian+Forest+Birds+from+Climate+Change.">Mitigating Future Avian Malaria Threats to Hawaiian Forest Birds from Climate Change.</a> PloS One. 12 (1), 0168880 (2017).</li><li>Martins, W. F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+insecticide+resistance+in+the+lymphatic+filariasis+vector+Culex+quinquefasciatus.">Transcriptomic analysis of insecticide resistance in the lymphatic filariasis vector Culex quinquefasciatus.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11406 (2019).</li><li>Norris, L. C., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insecticide+resistance+in+Culex+quinquefasciatus+mosquitoes+after+the+introduction+of+insecticide-treated+bed+nets+in+Macha,+Zambia.">Insecticide resistance in Culex quinquefasciatus mosquitoes after the introduction of insecticide-treated bed nets in Macha, Zambia.</a> Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 36 (2), 411-420 (2011).</li><li>Corbel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+insecticide+resistance+mechanisms+in+Anopheles+gambiae+and+Culex+quinquefasciatus+from+Benin,+West+Africa.">Multiple insecticide resistance mechanisms in Anopheles gambiae and Culex quinquefasciatus from Benin, West Africa.</a> Acta tropica. 101 (3), 207-216 (2007).</li><li>Yadoul&#233;ton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insecticide+resistance+status+in+Culex+quinquefasciatus+in+Benin.">Insecticide resistance status in Culex quinquefasciatus in Benin.</a> Parasites &amp; Vectors. 8, 17 (2015).</li><li>Atyame, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia-based+population+control+strategy+targeting+Culex+quinquefasciatus+mosquitoes+proves+efficient+under+semi-field+conditions.">Wolbachia-based population control strategy targeting Culex quinquefasciatus mosquitoes proves efficient under semi-field conditions.</a> PloS One. 10 (3), 0119288 (2015).</li><li>Atyame, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+incompatibility+as+a+means+of+controlling+Culex+pipiens+quinquefasciatus+mosquito+in+the+islands+of+the+south-western+Indian+Ocean.">Cytoplasmic incompatibility as a means of controlling Culex pipiens quinquefasciatus mosquito in the islands of the south-western Indian Ocean.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (12), 1440 (2011).</li><li>Almeida, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Wolbachia+on+fitness+of+Culex+quinquefasciatus+(Diptera;+Culicidae).">Effects of Wolbachia on fitness of Culex quinquefasciatus (Diptera; Culicidae).</a> Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 11 (8), 2138-2143 (2011).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+confinable+gene+drive+system+in+the+human+disease+vector+Aedes+aegypti.">Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti.</a> eLife. 9, 51701 (2020).</li><li>Phuc, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late-acting+dominant+lethal+genetic+systems+and+mosquito+control.">Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control.</a> BMC Biology. 5, 11 (2007).</li><li>Kyrou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas9+gene+drive+targeting+doublesex+causes+complete+population+suppression+in+caged+Anopheles+gambiae+mosquitoes.">A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).</li><li>Gantz, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+Cas9-mediated+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito+Anopheles+stephensi.">Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).</li><li>Buchman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+resistance+to+Zika+virus+in+transgenic+expressing+a+polycistronic+cluster+of+synthetic+small+RNAs.">Engineered resistance to Zika virus in transgenic expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).</li><li>Buchman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+dengue+neutralization+in+mosquitoes+expressing+an+engineered+antibody.">Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody.</a> PLoS Pathogens. 16 (1), 1008103 (2020).</li><li>Isaacs, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+resistance+to+Plasmodium+falciparum+development+in+transgenic+Anopheles+stephensi.">Engineered resistance to Plasmodium falciparum development in transgenic Anopheles stephensi.</a> PLoS Pathogens. 7 (4), 1002017 (2011).</li><li>Liu, N., Li, T., Reid, W. R., Yang, T., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Cytochrome+P450+genes:+their+constitutive+overexpression+and+permethrin+induction+in+insecticide+resistant+mosquitoes,+Culex+quinquefasciatus.">Multiple Cytochrome P450 genes: their constitutive overexpression and permethrin induction in insecticide resistant mosquitoes, Culex quinquefasciatus.</a> PloS One. 6 (8), 23403 (2011).</li><li>Kauffman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearing+of+Culex+spp.+and+Aedes+spp.+Mosquitoes.">Rearing of Culex spp. and Aedes spp. Mosquitoes.</a> Bio Protocols. 7 (17), 2542 (2017).</li><li>Richards, S. L., Anderson, S. L., Yost, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+blood+meal+source+on+the+reproduction+of+Culex+pipiens+quinquefasciatus+(Diptera:+Culicidae).">Effects of blood meal source on the reproduction of Culex pipiens quinquefasciatus (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 37 (1), 1 (2012).</li><li>Kitzmiller, J. B., Micks, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+Rearing+Culex+Mosquitoes.">Techniques for Rearing Culex Mosquitoes.</a> American Midland Naturalist. 52 (1), 253 (1954).</li><li>Mordue, A. J., Blackwell, A., Hansson, B. S., Wadhams, L. J., Pickett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+and+electrophysiological+evaluation+of+oviposition+attractants+for+Culex+quinquefasciatus+say+(Diptera:+Culicidae).">Behavioural and electrophysiological evaluation of oviposition attractants for Culex quinquefasciatus say (Diptera: Culicidae).</a> Experientia. 48 (11-12), 1109-1111 (1992).</li><li>Allgood, D. W., Yee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oviposition+preference+and+offspring+performance+in+container+breeding+mosquitoes:+evaluating+the+effects+of+organic+compounds+and+laboratory+colonisation.">Oviposition preference and offspring performance in container breeding mosquitoes: evaluating the effects of organic compounds and laboratory colonisation.</a> Ecological Entomology. 42 (4), 506-516 (2017).</li><li>Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+Microinjection+and+Transplantation+Technique+for+Nasonia+vitripennis+Genome+Manipulation.">Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56990 (2017).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+jewel+wasp+Nasonia+vitripennis+using+CRISPR/Cas9.">Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-7 (2017).</li><li>Li, M., Akbari, O. S., White, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient+Site-Specific+Mutagenesis+in+Malaria+Mosquitoes+Using+CRISPR.">Highly Efficient Site-Specific Mutagenesis in Malaria Mosquitoes Using CRISPR.</a> Genes, Genomes, Genetics. 8 (2), 653-658 (2018).</li><li>Li, M., Bui, M., Yang, T., White, B. J., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+Cas9+Expression+Yields+Highly+Efficient+Genome+Engineering+in+a+Major+Worldwide+Disease+Vector,+Aedes+aegypti.">Germline Cas9 Expression Yields Highly Efficient Genome Engineering in a Major Worldwide Disease Vector, Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (49), 10540-10549 (2017).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+disease+vector+Culex+quinquefasciatus+using+clustered+regularly+interspaced+short+palindrome+repeats-associated+protein+9.">Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9.</a> Insect Molecular Biology. 29 (2), 214-220 (2020).</li><li>New England Biolabs Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclease I. NEB Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i">https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i</a> (2020)</li></ol>

最近、蚊ベクター制御のための遺伝子操作ツールを生成する取り組みでは、一般的な蚊病ベクターの胚マイクロインジェクションプロトコルを開発し、最適化する必要があります。 Aedes と Anopheles 蚊のための方法が開発されていますが 、Culex のために特別に設計されたプロトコルは最小限に探索されています。一般に、蚊の胚の注入プロトコルは、3つの一般的なステップに分けることができます:1)胚の採取と準備、2)胚注射、および3)注射後の回復。突然変異体を正常に生成するには、3つのステップすべてをターゲット種に最適化する必要があります。胚マイクロインジェクションのためのこの改変されたプロトコルは 、Culex 蚊のゲノム工学に成功した場合に特異的である。
胚の採取を最大化することは、胚微小注入プロトコルにおける一般的なボトルネックである。短時間で採取される卵の数を増やすために、蚊は血液食後2〜3日間、卵子基質から制限された。 C.キンケファシアトゥス は、哺乳類の源や哺乳類の血液を供給する膜とは対照的に、鳥類の血液源を好む傾向があることに注意することが重要です。しかし、多くの研究者は、血液供給のための生きている鳥類や鳥類の血液の信頼性の高い供給源を取得することが困難であるため、実験室の在庫は、よりアクセスしやすい血液源を供給するために適応することができます。また 、C.キンケファシアトゥス および他のほとんどの Culex ベクターにオビポジションキューを提供するため、オビポジション基質に栄養豊富な水を使用することも重要です。栄養豊富な水を生成する多くの方法があり、マイクロインジェクションに適切な数の卵が利用可能であることを確認するために、ラボ間で最適化する必要があります。例えば、この方法は5日以上の脱イオン水で発酵したウサギの便で最も成功したが、他の研究者は、栄養源として草や魚の食物でより多くの成功を収めているが、蒸留水21でもいくつかある。
Culex蚊はいかだに卵のグループを産むので、卵を集めるのはかなり簡単です。卵は、ペイントブラシでいかだ全体をすくうことによって単に収集することができます。卵の分離はより複雑ですが、正常な注射には不可欠です。卵は、ペイントブラシや鉗子で卵の間に穏やかな下降圧力をかけることで、いかだから慎重に分離することができます。いくつかの練習では、複数のユーザーが確実に卵のいかだから単一卵を分離することができました。各卵を分離した後、卵は両面付き粘着テープ上で同じ向きに整列し、マイクロインジェクション中に卵を安定させる。卵は先細りの後端に注入され、ハロカーボンオイルの添加は、操作中に卵を湿らせた保ちます。
マイクロインジェクション中の胚の損傷を制限するには、注射針が適切な強度を持ち、適切な角度でベベブする必要があります。50°の角度で10秒間ベベにされたアルミノケイ酸針は最良の結果を得ましたが、ボロシリケート針とクォーツ針も機能しますが、耐久性が低く、より高価である可能性があります。さらに、適切な針のベベルはCas9およびsgRNA混合物のよりよい流れを促進し、胚へのより容易な浸透のためのより鋭いポイントを作成する。多くの場合、ベベルは詰まった針を交換するのに時間と労力を費やすのではなく、詰まった針を素早く固定する効率的な方法でもあります。
注射後、卵は少なくとも5分間邪魔されず、ハロカーボンオイルはきれいな絵筆で軽くブラッシングしてすぐに取り除かれます。ハロカーボン油の除去後、注入された卵は、通常、注射後3日以内に発生する孵化するために水に入れることができます。練習と卵の十分な数で、このプロトコルは 、C.キンケファシアトゥス で一貫した体細胞および生殖細胞系列突然変異を達成することができ、他の Culex 蚊に容易に適応可能であるべきであるほど汎用性があります。

C.キンケファシアトゥスは、一般に南部の家の蚊として知られており、西ナイルウイルス(WNV)、日本脳炎、セントルイス脳炎、および東方脳炎を含む多数の病原体の有能なベクターです。特に、1999年にニューヨークで初めて検出されて以来、WNVは米国大陸全体で主要なベクター媒介性疾患となり、1999年から2018年の間に約2,300人が死亡し、2008-201920092年の間に報告された馬の症例は4,500人を超えています。さらに、北米で見つかった少なくとも23種の鳥類は、WNV3の結果として回復不可能と分類される少なくとも12種のWNV感染の影響を受けている。WNVがヒト、馬、鳥類集団に及ぼす影響は、そのベクターの日和食摂食行動によるものです。通常、鳥はWNVの主要なホストであり、人間と馬は偶発的または行き止まりのホストです。C.キンケファシアトゥスによってベクター化されたいくつかの病原体は、鳥類マラリア原虫、マラリア原虫などの鳥類にのみ感染する。ハワイでは、C.キンケファシアトゥスは鳥類マラリアの主要なベクターであり、多くの在来鳥種4、5の絶滅を引き起こしている。
C.キンケファシアトゥスによって伝染する疾患を制御するために、研究者およびベクターコントロール機関は、殺虫剤用途6のような一般的に確立された蚊集団制御ツールを使用してきたが、これらの方法は、種特異的ではなく、高価であり、殺虫剤に対する耐性が多くのC.キンケファシアトの集団6、7、8、9で高いため、限られた有効性を有する。ウォルバキア系集団制御戦略などの他の制御技術は近年10,11に開発されているが、ウォルバキア感染に伴うフィットネスコストは、このベクター12に対するこのアプローチの実現可能性を制限している。また、Aedes aegypti13、14、アノフェレスガンビア15、アノフェレス・ステファシ16などの他の蚊種で開発された遺伝子ベースの制御方法もあり、病原性蚊17、18、19の開発を含む、 C.quinquefaiatusのために開発される可能性があります。 この種のために開発されました。しかし、C.キンケファシアトゥス生物学は、このベクターで同様の遺伝技術の開発を困難にしている他のAedesおよびアノフェレス蚊ベクターとは大きく異なります。CRISPRベースのゲノム工学技術の出現により、精密なゲノム工学はますます些細で手頃な価格で適応可能になり、その結果、多種多様な種で新しい遺伝子ツールの開発につながっています。
CRISPRベースの技術で変異を生成するために、Cas9タンパク質と合成ガイドRNA(sgRNA)の混合物を、所望の遺伝子座と相補し、プレブラスタードドミルム期胚にマイクロインジェクションする。C.キンケファシアトゥスメスは、個々の卵子をオビジケートするのとは対照的に、浮遊いかだ構造(図1)に付着したグループで卵を産むので、この種では胚の微小注射がますます複雑になっている。カレックス幼虫は、水面に接触している各卵の前側からも出てくる(図1)ので、卵の向き後操作がこの種では重要である。ここでは、C.キンケファシアトゥス胚へのCas9タンパク質およびsgRNAのマイクロインジェクション用に設計された詳細なプロトコルについて説明する。このプロトコルは、タイムリーな卵の収集と卵の生存のための重要な特定のステップを通じて胚の生存率とゲノム突然変異率を改善するために、Culex生物学に特有の形質を収容するように設計されています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>9 oz clear plastic pet cup</td>
			<td>Karat</td>
			<td>C-KC9</td>
			<td>Insect Rearing and Egg Collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>Microinjection, borosilicate and quartz needles could also be used but we prefered aluminosilicate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood</td>
			<td>Colorado Serum Company</td>
			<td>31025</td>
			<td>The colony took multiple generations to adapt to this blood source. Other blood sources are likely just as appropriate. See protocol notes on blood source selection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bugdorm</td>
			<td>Bugdorm</td>
			<td>4F2222</td>
			<td>Insect Rearing Cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 Protein with NLS</td>
			<td>PNABio</td>
			<td>CP01</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound Microscope</td>
			<td>Olympus BX41</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection, for embryo injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>104E</td>
			<td>Microinjection, to be used with beveler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase/RNase-Free distilled Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>B084NVQGXD</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet 4x or 4i programmable microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotips Microloader tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Microinjection, embryo collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tip paintbrush</td>
			<td>ZEM</td>
			<td>2595</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8773</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemotek</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>PS5</td>
			<td>Line Maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Beveler</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BV10</td>
			<td>Microinjection, needle beveling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000 or P-2000</td>
			<td>Microinjection, needle pulling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Drying Modeling Clay</td>
			<td>Jovi</td>
			<td>B0025Z71IM</td>
			<td>Microinjection, needle storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td>Microinjection, for embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugar</td>
			<td>Domino</td>
			<td></td>
			<td>20% sugar solution for adult sugar source.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0302</td>
			<td>Preparation of microinjection materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>K451020</td>
			<td>Preparation of microinjection materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-fine tip forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-121</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embryo microinjection techniques for efficient site-specific mutagenesis in culex quinquefasciatus

キュレックス・キンケファシアトゥス は、鳥インフルエンザ、西ナイルウイルス(WNV)、日本脳炎、東方脳炎、リンパ系フィラリア症、セントルイス脳炎など、多様なベクター媒介性疾患のベクターです。特に、鳥類マラリアは多数の固有の島鳥類種の絶滅に大きな役割を果たし、WNVは米国で重要なベクター媒介性疾患となっています。 C.キンケファシアトゥス 生物学に関するさらなる洞察を得て、その遺伝的制御ツールボックスを拡大するためには、この種のゲノム工学のためのより効率的で手頃な価格の方法を開発する必要があります。しかし 、Culex 蚊、特に卵のいかだに特有の生物学的形質の中には、ゲノム工学に必要なマイクロインジェクション手順を実行することが困難になっています。これらの課題に対処するために 、Culex 蚊のユニークな特性に関連する技術的障害を軽減することに焦点を当てた最適化された胚マイクロインジェクションプロトコルを開発しました。これらの手順は 、C.quinquefasciatus でのマイクロインジェクションを成功させるために不可欠な卵の収集、卵いかだの分離、その他の取り扱い手順に最適化された方法を示しています。CRISPR/Cas9ゲノム編集技術と組み合わせることで、高度なゲノム工学を行い、現在研究されていない疾患ベクターで遺伝子制御技術を開発するために必要な、部位特異的で効率的で遺伝性の生殖細胞系列突然変異を達成することができます。

以前に公開された実験では、この方法は、暗い目の色素沈着の発達に重要な遺伝子の体細胞性および生殖細胞系列突然変異を正常に生成するために使用された、白色(CPIJ005542)30(表1)。CRISPR/Cas9は、注入された個体のプパルステージ目における色素沈着の喪失をスクリーニングすることによって採点した(G0)。体細胞変異は一般に、一部の細胞が変異表現型を有するが、その一部が変異型であるモザイク表現型として存在していた。例えば、白色遺伝子の体細胞変異は、色素沈着を欠く表現型を有するオマチディアと、野生型色素性表現型30との混合物をもたらした。しかし、白い遺伝子の生殖系列変異があった場合、次の世代(G1)は完全な白目表現型を受け継いだ。生殖細胞系列突然変異率は、モザイクG0個体を交交し、完全に白い目の子孫に対して得点することによって決定した(G1)。これらの実験結果は、胚生存率が64%から82%、ならびに37%〜57%の体細胞性突然変異誘発率および>61%の生殖細胞系変異生成率をもたらした(表1)。同じ遺伝子内の複数の遺伝子を標的とするsgRNAを多重化することにより、体細胞および生殖細胞系列突然変異誘発率は86%まで上方に増加した(表1)。さらに、多くの世代のために、白い突然変異体の実行可能なホモ接合株は、実験室で正常に保持されています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig01.jpg"> 図 1:C.キンケファシアトゥス 卵いかだと単一卵形態 D.D.Cキンケファシアトゥス卵いかだのドーサル(A)、横(B)、腹側(C)の眺め。C.キンケファシアトゥスメスは、より球根の前側が水面から離れて指差された後方に水面に触れて卵を産む(D)。A-前者;P-後部<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61375/61375fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2.jpg"> 図2:マイクロインジェクションによる C.クィクケファシアトゥス 変異体の作成用のタイムライン C.キンケファシアトゥスコロニー調製と微小注射のための胚コレクションの年表(A-D)。次いで、採取した卵が分離され(E)同じ向きに整列し、ハロカーボン油(F)で覆われる。卵を注入し(G)、ハロカーボンオイル(H)を除去する前に最低5分間休ませる。卵は、孵化のためにきれいな水源(I)に移され、突然変異型(K)のスクリーニングを受ける。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">生存</td>
			<td colspan="3">体的モザイク (G0)</td>
			<td>生殖細胞系突然変異誘発(G1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>スグRNA</td>
			<td>#injected</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>合計 (%)</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>合計 (%)</td>
			<td>G1 変異体 (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1</td>
			<td>50</td>
			<td>15</td>
			<td>20</td>
			<td>35(70)</td>
			<td>7(47)</td>
			<td>13(65)</td>
			<td>20(57)</td>
			<td>128(69)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-2</td>
			<td>50</td>
			<td>9</td>
			<td>32</td>
			<td>41(82)</td>
			<td>3(33)</td>
			<td>12(38)</td>
			<td>15(37)</td>
			<td>51(61)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>15</td>
			<td>32(64)</td>
			<td>7(41)</td>
			<td>8(53)</td>
			<td>15(47)</td>
			<td>157(72)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2</td>
			<td>50</td>
			<td>7</td>
			<td>16</td>
			<td>23(46)</td>
			<td>5(71)</td>
			<td>12(75)</td>
			<td>17(74)</td>
			<td>123(79)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>13</td>
			<td>9</td>
			<td>22(44)</td>
			<td>10(77)</td>
			<td>6(67)</td>
			<td>16(73)</td>
			<td>72(81)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>10</td>
			<td>27(54)</td>
			<td>13(76)</td>
			<td>8(80)</td>
			<td>21(78)</td>
			<td>101(85)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>11</td>
			<td>10</td>
			<td>21(42)</td>
			<td>9(82)</td>
			<td>9(90)</td>
			<td>18(86)</td>
			<td>149(86)</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:白を標的とする単一および多重化gRNAを注射した胚の生存率および突然変異率。テーブルは30からの許可を得て再印刷されます。

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Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

このプロトコルは、CRISPR/Cas9遺伝子編集ツールで動作するように最適化された Culex quinquefasciatus 胚のマイクロインジェクション手順について説明します。この技術は、この研究対象疾患ベクターの遺伝的技術を構築するために使用できる部位特異的、遺伝性、生殖細胞系列突然変異を効率的に生成することができる。

キュレックス・キンケファシアトゥスにおける効率的な部位特異的変異誘発のための胚微小注入技術

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

embryo-microinjection-techniques-for-efficient-site-specific

Research

JoVE Journal

Genetics

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

5.3K ビュー.  University of California, San Diego. このプロトコルは、CRISPR/Cas9遺伝子編集ツールで動作するように最適化された Culex quinquefasciatus 胚のマイクロインジェクション手順について説明します。この技術は、この研究対象疾患ベクターの遺伝的技術を構築するために使用できる部位特異的、遺伝性、生殖細胞系列突然変異を効率的に生成することができる。

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Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

家畜接合体におけるレーザーアシスト細胞質マイクロインジェクション

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

遺伝学

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

世界的な農業害虫昆虫における胚のマイクロインジェクションを介して、核酸の送達、<em&gt;チチュウカイミバエ</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, such as transcription, DNA replication, and DNA repair. HMGB1 binds to structurally distorted DNA with higher affinity than to canonical B-DNA. For example, we found that HMGB1 binds to DNA interstrand crosslinks (ICLs), which covalently link the two strands of the DNA, cause distortion of the helix, and if left unrepaired can cause cell death. Due to their cytotoxic potential, several ICL-inducing agents are currently used as chemotherapeutic agents in the clinic. While ICL-forming agents show preferences for certain base sequences (e.g., 5&#39;-TA-3&#39; is the preferred crosslinking site for psoralen), they largely induce DNA damage in an indiscriminate fashion. However, by covalently coupling the ICL-inducing agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO), which binds to DNA in a sequence-specific manner, targeted DNA damage can be achieved. Here, we use a TFO covalently conjugated on the 5&#39; end to a 4&#39;-hydroxymethyl-4,5&#39;,8-trimethylpsoralen (HMT) psoralen to generate a site-specific ICL on a mutation-reporter plasmid to use as a tool to study the architectural modification, processing, and repair of complex DNA lesions by HMGB1 in human cells. We describe experimental techniques to prepare TFO-directed ICLs on reporter plasmids, and to interrogate the association of HMGB1 with the TFO-directed ICLs in a cellular context using chromatin immunoprecipitation assays. In addition, we describe DNA supercoiling assays to assess specific architectural modification of the damaged DNA by measuring the amount of superhelical turns introduced on the psoralen-crosslinked plasmid by HMGB1. These techniques can be used to study the roles of other proteins involved in the processing and repair of TFO-directed ICLs or other targeted DNA damage in any cell line of interest.

Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.

ツールは、Helix歪曲、部位特異的DNA鎖間架橋の処理に建築タンパク質HMGB1の役割を研究するために

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

でヒストンminiSOGを使用した光遺伝学ランダム突然変異誘発<em&gt; C。エレガンス</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

ターゲットを絞りました<em&gt;その場で</em出芽酵母におけるヒストン遺伝子の&gt;突然変異誘発

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve random mutagenesis, error-prone PCR is a convenient and efficient strategy for generating a diverse pool of mutants (i.e., a mutant library). Error-prone PCR is the method of choice when a researcher seeks to mutate a pre-defined region, such as the coding region of a gene while leaving other genomic regions unaffected. After the mutant library is amplified by error-prone PCR, it must be cloned into a suitable plasmid. The size of the library generated by error-prone PCR is constrained by the efficiency of the cloning step. However, in the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, the cloning step can be replaced by the use of a highly efficient one-step fusion PCR to generate constructs for transformation. Mutants of desired phenotypes may then be selected using appropriate reporters. Here, we describe this strategy in detail, taking as an example, a reporter inserted at centromeric heterochromatin.

This article describes a detailed methodology for random mutagenesis of a target gene in fission yeast. As an example, we target rpt4+, which encodes a subunit of the 19S proteasome, and screen for mutations that destabilize heterochromatin.

分裂酵母におけるプロテアソーム変異体のヘテロクロマチン不安定を選択するランダムな変異を遺伝子をターゲットとしました。

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to visceral pathology. Deciphering the nature of the vector/parasite interactions is of primary importance for better understanding of Leishmania transmission to their hosts. Among the parameters controlling the sand fly vector competence (i.e. their ability to carry and transmit pathogens), parameters intrinsic to these insects were shown to play a key role. Insect immune response, for example, impacts sand fly vector competence to Leishmania. The study of such parameters has been limited by the lack of methods of gene expression modification adapted for use in these non-model organisms. Gene downregulation by small interfering RNA (siRNA) is possible, but in addition to being technically challenging, the silencing leads to only a partial loss of function, which cannot be transmitted from generation to generation. Targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 technology was recently adapted to the Phlebotomus papatasi sand fly. This technique leads to the generation of transmissible mutations in a specifically chosen locus, allowing to study the genes of interest. The CRISPR/Cas9 system relies on the induction of targeted double-strand DNA breaks, later repaired by either Non-Homologous End Joining (NHEJ) or by Homology Driven Repair (HDR). NHEJ consists of a simple closure of the break and frequently leads to small insertion/deletion events. In contrast, HDR uses the presence of a donor DNA molecule sharing homology with the target DNA as a template for repair. Here, we present a sand fly embryo microinjection method for targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 using NHEJ, which is the only genome modification technique adapted to sand fly vectors to date.

Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

This protocol details the steps of CRISPR/Cas9 targeted mutagenesis in sand flies: embryo collection, injection, insect rearing, and identification as well as selection of mutations of interest.

CRISPR/Cas9突然変異誘発のためのサンドフライ(フレボトムスパパタシ)胚微小注射

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

アリハルペグナトス塩析装置におけるCRISPRを介した突然変異誘発のための胚注射

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA fragments encoding genes of interest as well as favorable traits into the insect germline in a stable and heritable manner. The resulting transgenic strains can be studied for phenotypic changes resulting from the expression of the integrated DNA to answer basic questions or used in practical applications. Although the technology is straightforward, it requires of the investigator patience and practice to achieve a level of skill that maximizes efficiency. Shown here is a method for microinjection of embryos of the African malaria mosquito, Anopheles gambiae. The objective is to deliver by microinjection exogenous DNA to the embryo so that it can be taken up in the developing germline (pole) cells. Expression from the injected DNA of transposases, integrases, recombinases, or other nucleases (for example CRISPR-associated proteins, Cas) can trigger events that lead to its covalent insertion into chromosomes. Transgenic An. gambiae generated from these technologies have been used for basic studies of immune system components, genes involved in blood-feeding, and elements of the olfactory system. In addition, these techniques have been used to produce An. gambiae strains with traits that may help control the transmission of malaria parasites.

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Microinjection techniques are essential to introduce exogenous genes into the genomes of mosquitoes. This protocol explains a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles gambiae embryos to generate transformed mosquitoes.

アノフェレスガンビア胚の微小注入法

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA ...