이 작품은 O.S.A.로 향하는 UCSD 스타트업 펀드에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

1. C. 퀸케파시아투스 식민지 사육
<ol><li>버그 기숙사 케이지에 C. 퀸케파시아투스 성인의 여러 식민지를 설정합니다. 참고 : 식민지는 코넬 대학에서 박사 로라 해링턴에 의해 제공되었다20. 컬렉스 모기를 사육하기 위한 상세한 프로토콜은 다른문헌(21)에서찾을 수 있다.<ol>
<li>12:12 시간 :야간 주기와 30 %의 습도에서 25 ± 1 °C에서 모기를 유지합니다.</li>
		<li>케이지에 심지와 설탕 용액 용기를 도입하거나 설탕 용액으로 면공을 포화시켜 20% 설탕 용액 광고 리비툼을 제공합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>모기가 혈액 공급 전에 적어도 3 일 동안 짝짓기를 허용(그림 2A).</li>
</ol>2. C. 퀸케파시아투스 전 분담 단계 배아의 수집
<ol><li>3-6일 후 백과사전 후, 합성 막을 통해 구형 소 혈액식의 1-2mL을 여성에게 제공하고 혈액 공급 시스템에서 약 40°C로 가열한다(도2B). 컬렉스 모기에 사용할 수 있는 대체 혈액 공급 프로토콜도 있습니다(예: 참조 참조21). 참고: C. 퀸케파시아투스는 조류 혈액을 선호하는 것으로 알려져 있습니다. 일부 실험실은 혈액 식사 소스21,22,23에대한 마취 라이브 조류 또는 조류혈액을사용합니다. 그러나 이 기능이 여러 세대에 걸쳐 선택되면 소 혈액이나 작은 설치류를 먹도록 식민지를 훈련/선택할 수 있습니다.<ol>
<li>여성이 혈액 공급 후 최소 3 일 동안 휴식을 허용하여 미세 주입 실험에 대한 oviposition을 유도하기 전에 oogenesis 및 계란 성숙을 겪게됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>배아 미세 주입의 날에, 유기적으로 주입 된 oviposition 물와 oviposition 컵을 만들. oviposition 물은 토끼 대변 (50 g/L), 분해 잔디 (4.5 g/L), 또는 물고기 음식 (25 g/L)을 5 일 이상 동안 물에서 발효하여 만들어야한다24,25.</li>
	<li>oviposition 컵을 케이지에 넣고 전체 케이지를 어두운 위치(그림 2C)에놓습니다.</li>
	<li>30분마다 달걀 뗏목을 마시러 컵을 확인하세요.<ol>
<li>달걀 뗏목이 있는 경우 페인트 브러시로 뗏목을 수거하여 젖은 필터 용지에 놓습니다(그림2D, E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. C. 퀸케파시아투스 전 분비전 배아의 정렬
<ol><li>뗏목을 누르고 잘게 다듬은 페인트 브러시와 집게(그림 2E)를사용하여 개별적으로 계란을 따로 뗏목에서 계란을 분리합니다.</li>
	<li>유리슬라이드(그림 2F)의상단에 배치된 양면 스티커 테이프의 얇은 스트립에 개별 계란을 정렬합니다.</li>
	<li>정렬하는 동안, 쉽게 접근성을 위해 동일한 방향으로 각 계란의 전방 측면을 가리킬 수 있습니다. 참고: 양면 스티커 테이프가 없는 대체 계란 정렬 방법은 이전에 발표된 나소니아 vitripennis 태아 미세 주입프로토콜(26)에서찾을 수 있다.</li>
	<li>할로카본 오일 믹스로 달걀을 덮습니다. 참고: 할로카본 믹스는 두 개의 할로카본 시약과 물(9:1:20, 할로카본 700 : 할로카본 27 : 초순수 수)를 부드럽게 혼합한 다음 할로카본 오일의 수포화를 용이하게 하기 위해 25°C에서 하룻밤 동안 혼합물을 배양함으로써 미리 준비할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 미세 주입을위한 바늘 준비
<ol><li>유리 마이크로피펫 풀러를 사용하여 알루미노실리케이트 모세관 유리 바늘을 생성합니다.<ol>
<li>바늘 풀러의 사용자 설명서의 지침에 따라 알루미노실리케이트 모세관 유리를 바늘 풀러에 넣습니다. 참고: 석영과 보로실리케이트 모세관 바늘도 사용할 수 있지만, 이 실험을 위해 알루미노실리케이트는 상대적인 경제성과 내구성 때문에 선호됩니다.</li>
		<li>열을 516으로 설정하고, 속도는 100으로, 70으로 지연하고, 97로 당기고, 바늘 풀러에 500으로 압력을 가합니다.</li>
		<li>풀러의 지시에 따라 바늘 풀러를 활성화하고 추가 바늘에 필요한 대로 반복합니다. 참고: 주입 과정에서 바늘이 막히거나 실수로 파손되기 때문에 단일 실험을 위해 추가 바늘을 당기는 것이 좋습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>50° 각도에서 회전 다이아몬드 연마판에 당겨진 바늘 끝을 부드럽게 터치하여 바늘 끝을 구부립니다. 참고: 바늘을 베벨링하면 유체가 흐를 수 있도록 하는 동시에 배아로 쉽게 침투할 수 있는 선명한 팁을 만듭니다. 적절한 바늘의 예는 이전 제에서 볼 수 있습니다26.</li>
	<li>페트리 접시에 모델러의 점토 라인에 담아 바늘을 뽑아 서 보관하십시오. 참고: 바늘 팁에 대 한 최고의 품질을 보장 하기 위해, 바늘 은 신선 하 게 당겨 하 고 가능한 한 주입의 시간에 가까운 beveled 해야 합니다.</li>
</ol>5. 사출 혼합물을 적재
<ol><li>게놈 변형 시약(예를 들어, 200 ng/μL sgRNA 및 200 ng/μL Cas9 혼합물)으로 구성된 사출 혼합물을 준비하거나 선호하는 사출 용액을 얼음위에 보관한다. 참고 : 이 믹스는 계란이 놓일 때까지 기다리는 동안 준비 될 수 있습니다. Cas9 및 sgRNA 생산 및 미세 주입에 대한 준비에 대한 자세한 내용은 이전 간행물27,28,29,30에서확인할 수 있다.</li>
	<li>마이크로 로더 팁을 사용하여 주입 바늘에 주입 혼합물 2 μL을 적재합니다.</li>
</ol>6. 미세 주입 설정
<ol><li>전자 마이크로 인젝터에 연결된 마이크로 조작기 설정에 채워진 주입 바늘을 놓습니다.</li>
	<li>복합 현미경의 단계에 정렬 된 계란을 포함하는 유리 슬라이드를 놓습니다.</li>
	<li>미세 조작기 및 복합 현미경을 사용하여 바늘을 정렬하여 25-35 ° 각도로 배아의 후방 끝을 목표로합니다.</li>
</ol>7. 배아 미세 주입(그림 2G)
<ol><li>조심스럽게 배아에 바늘을 삽입하고 배아의 부피의 약 10 %의 양으로 혼합물을 주입 (계란의 크기에 따라 700-800 pL). 참고: 주입 할 때, 계란은 약간 팽창해야하지만, 너무 많은 액체가 주입되는 경우, 계란이 파열 될 수 있습니다, 또는 세포질 액체가 누출 될 수 있습니다.</li>
	<li>한 번에 약 20개의 알을 주입한 다음 중단하고 배아 회복 절차를 수행합니다. 참고 : 주입하는 동안, 나막히거나 휴식 바늘의 높은 기회가있다. 바늘을 통해 흐르는 주입 유체의 부족에 의해 결정 될 수있는 나막이가 발생하는 경우, 전자 마이크로 인젝터에 깨끗한 기능으로 바늘을 청소하거나 바늘을 재veveling시도. 두 단계 모두 작동하지 않으면 준비된 계란이 촉촉하게 유지되도록하면서 새 바늘로 빠르게 변경하십시오.</li>
</ol>8. 배아 회복 및 부화
<ol><li>계란을 5분 이상 방해받지 않고 둡니다. 주입 후 20분 이내에 깨끗한 페인트브러시(그림 2H)로가볍게 칫솔질을 하여 할로카본 오일을 조심스럽게 제거합니다.</li>
	<li>페인트 브러시를 사용하여 계란을 부드럽게 들어 올려 두 번 증류된 물 한 잔에 넣습니다(그림2I). 수면에 알을 보관하십시오.</li>
	<li>부화(그림 2J)에대한 7 일 동안 매일 계란을 확인합니다.</li>
	<li>정상적인 애벌레 양육절차(21)를따르십시오.</li>
</ol>9. 게놈 수정을 위한 검열
<ol><li>스테레오스코프(도2K)를사용하여 돌연변이 표현형을 위해 주입된 모기를 선별한다.<ol>
<li>쉽게 인식할 수 있는 표현형이 없는 돌연변이를 검증하고, PCR 증폭, T7 엔도누클레스 I 분석, 및 표적영역(31)의서브클링에 의한 시퀀싱에 의해 서열된다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>발아성 내의 유전성 돌연변이를 검출하기 위하여 주입된 개별 사이 추가 십자가를 설치합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Final Cumulative Maps and Data | West Nile Virus. CDC Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight">https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight</a> (2019)</li><li>APHIS | West Nile Virus (WNV). USDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv">https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv</a> (2020)</li><li>Luke George, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+impacts+of+West+Nile+virus+on+North+American+bird+populations.">Persistent impacts of West Nile virus on North American bird populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), 14290-14294 (2015).</li><li>van Riper, C., van Riper, S. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+insecticide+resistance+in+the+lymphatic+filariasis+vector+Culex+quinquefasciatus.">Transcriptomic analysis of insecticide resistance in the lymphatic filariasis vector Culex quinquefasciatus.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11406 (2019).</li><li>Norris, L. C., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insecticide+resistance+in+Culex+quinquefasciatus+mosquitoes+after+the+introduction+of+insecticide-treated+bed+nets+in+Macha,+Zambia.">Insecticide resistance in Culex quinquefasciatus mosquitoes after the introduction of insecticide-treated bed nets in Macha, Zambia.</a> Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 36 (2), 411-420 (2011).</li><li>Corbel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+insecticide+resistance+mechanisms+in+Anopheles+gambiae+and+Culex+quinquefasciatus+from+Benin,+West+Africa.">Multiple insecticide resistance mechanisms in Anopheles gambiae and Culex quinquefasciatus from Benin, West Africa.</a> Acta tropica. 101 (3), 207-216 (2007).</li><li>Yadoul&#233;ton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insecticide+resistance+status+in+Culex+quinquefasciatus+in+Benin.">Insecticide resistance status in Culex quinquefasciatus in Benin.</a> Parasites &amp; Vectors. 8, 17 (2015).</li><li>Atyame, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia-based+population+control+strategy+targeting+Culex+quinquefasciatus+mosquitoes+proves+efficient+under+semi-field+conditions.">Wolbachia-based population control strategy targeting Culex quinquefasciatus mosquitoes proves efficient under semi-field conditions.</a> PloS One. 10 (3), 0119288 (2015).</li><li>Atyame, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+incompatibility+as+a+means+of+controlling+Culex+pipiens+quinquefasciatus+mosquito+in+the+islands+of+the+south-western+Indian+Ocean.">Cytoplasmic incompatibility as a means of controlling Culex pipiens quinquefasciatus mosquito in the islands of the south-western Indian Ocean.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (12), 1440 (2011).</li><li>Almeida, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Wolbachia+on+fitness+of+Culex+quinquefasciatus+(Diptera;+Culicidae).">Effects of Wolbachia on fitness of Culex quinquefasciatus (Diptera; Culicidae).</a> Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 11 (8), 2138-2143 (2011).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+confinable+gene+drive+system+in+the+human+disease+vector+Aedes+aegypti.">Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti.</a> eLife. 9, 51701 (2020).</li><li>Phuc, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late-acting+dominant+lethal+genetic+systems+and+mosquito+control.">Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control.</a> BMC Biology. 5, 11 (2007).</li><li>Kyrou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas9+gene+drive+targeting+doublesex+causes+complete+population+suppression+in+caged+Anopheles+gambiae+mosquitoes.">A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).</li><li>Gantz, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+Cas9-mediated+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito+Anopheles+stephensi.">Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).</li><li>Buchman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+resistance+to+Zika+virus+in+transgenic+expressing+a+polycistronic+cluster+of+synthetic+small+RNAs.">Engineered resistance to Zika virus in transgenic expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).</li><li>Buchman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+dengue+neutralization+in+mosquitoes+expressing+an+engineered+antibody.">Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody.</a> PLoS Pathogens. 16 (1), 1008103 (2020).</li><li>Isaacs, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+resistance+to+Plasmodium+falciparum+development+in+transgenic+Anopheles+stephensi.">Engineered resistance to Plasmodium falciparum development in transgenic Anopheles stephensi.</a> PLoS Pathogens. 7 (4), 1002017 (2011).</li><li>Liu, N., Li, T., Reid, W. R., Yang, T., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Cytochrome+P450+genes:+their+constitutive+overexpression+and+permethrin+induction+in+insecticide+resistant+mosquitoes,+Culex+quinquefasciatus.">Multiple Cytochrome P450 genes: their constitutive overexpression and permethrin induction in insecticide resistant mosquitoes, Culex quinquefasciatus.</a> PloS One. 6 (8), 23403 (2011).</li><li>Kauffman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearing+of+Culex+spp.+and+Aedes+spp.+Mosquitoes.">Rearing of Culex spp. and Aedes spp. Mosquitoes.</a> Bio Protocols. 7 (17), 2542 (2017).</li><li>Richards, S. L., Anderson, S. L., Yost, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+blood+meal+source+on+the+reproduction+of+Culex+pipiens+quinquefasciatus+(Diptera:+Culicidae).">Effects of blood meal source on the reproduction of Culex pipiens quinquefasciatus (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 37 (1), 1 (2012).</li><li>Kitzmiller, J. B., Micks, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+Rearing+Culex+Mosquitoes.">Techniques for Rearing Culex Mosquitoes.</a> American Midland Naturalist. 52 (1), 253 (1954).</li><li>Mordue, A. J., Blackwell, A., Hansson, B. S., Wadhams, L. J., Pickett, J. 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(130), e56990 (2017).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+jewel+wasp+Nasonia+vitripennis+using+CRISPR/Cas9.">Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-7 (2017).</li><li>Li, M., Akbari, O. S., White, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient+Site-Specific+Mutagenesis+in+Malaria+Mosquitoes+Using+CRISPR.">Highly Efficient Site-Specific Mutagenesis in Malaria Mosquitoes Using CRISPR.</a> Genes, Genomes, Genetics. 8 (2), 653-658 (2018).</li><li>Li, M., Bui, M., Yang, T., White, B. J., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+Cas9+Expression+Yields+Highly+Efficient+Genome+Engineering+in+a+Major+Worldwide+Disease+Vector,+Aedes+aegypti.">Germline Cas9 Expression Yields Highly Efficient Genome Engineering in a Major Worldwide Disease Vector, Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (49), 10540-10549 (2017).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+disease+vector+Culex+quinquefasciatus+using+clustered+regularly+interspaced+short+palindrome+repeats-associated+protein+9.">Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9.</a> Insect Molecular Biology. 29 (2), 214-220 (2020).</li><li>New England Biolabs Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclease I. NEB Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i">https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i</a> (2020)</li></ol>

모기 벡터 제어를 위한 유전자 조작된 공구를 생성하기 위한 최근 노력으로, 일반적인 모기 질병 벡터를 위한 배아 미세 주입 프로토콜을 개발하고 최적화할 필요가 있습니다. Aedes와 Anopheles 모기를 위해 방법이 개발되었지만 Culex를 위해 특별히 설계된 프로토콜은 최소한으로 탐구되었습니다. 일반적으로 모기 배아 주입 프로토콜은 3가지 일반적인 단계로 나눌 수 있다: 1) 배아 수집 및 준비, 2) 배아 주입, 및 3) 후 주사 회복. 돌연변이를 성공적으로 생성하려면 세 단계 모두 대상 종에 최적화되어야 합니다. 배아 미세 주입을 위한 이 수정된 프로토콜은 Culex 모기의 성공적인 게놈 공학을 위해 특정합니다.
배아 수집을 극대화하는 것은 배아 미세 주입 프로토콜에서 일반적인 병목 현상입니다. 단기간에 수집된 계란의 수를 늘리기 위해 모기는 혈액 식사 후 2-3일 동안 oviposition 기판에서 제한되었다. C. 퀸케파시아투스는 포유류 의 근원 또는 포유류 혈액으로 수유하는 막반대로 조류 혈액 원을 선호하는 경향이 있다는 것을 주의하는 것이 중요합니다. 그러나, 많은 연구원은 혈액 공급에 대 한 라이브 조류 또는 조류 혈액의 신뢰할 수 있는 소스를 취득 하는 어려움, 그래서 실험실 주식 더 접근 가능한 혈액 소스에 피드에 적응 될 수 있습니다. 또한 C. 퀸케파시아투스 및 대부분의 다른 컬렉스 벡터에 대한 oviposition 신호를 제공하기 때문에 배강기기류에 영양이 풍부한 물을 사용하는 것도 중요합니다. 영양이 풍부한 물을 생성하는 많은 방법이 있으며, 미세 주입을 위해 적절한 수의 계란을 보장하기 위해 실험실 간에 최적화해야 할 수도 있습니다. 예를 들어,이 방법은 5 일 이상 탈온 화 된 물에 발효 토끼 대변으로 가장 성공적이었지만, 다른 연구자들은 영양 공급원으로 잔디 또는 생선 음식과 더 많은 성공을 거두었으며 일부는증류수(21)로도더 많이 성공했습니다.
컬렉스 모기가 뗏목에 계란을 낳기 때문에 계란을 수집하는 것은 매우 간단합니다. 달걀은 페인트 브러시로 뗏목 전체를 스푸핑하여 수집할 수 있습니다. 계란 분리는 더 복잡하지만 성공적인 주입에 필수적입니다. 달걀은 페인트 브러시 또는 집게로 달걀 사이에 부드러운 하방 압력을 가하여 뗏목에서 조심스럽게 분리 할 수 있습니다. 몇 가지 연습으로, 여러 사용자가 안정적으로 계란 뗏목에서 단일 계란을 분리 할 수 있었다. 각 계란을 분리한 후, 계란은 양면 끈적끈적한 테이프에 동일한 방향으로 정렬되어 미세 주입 중에 계란을 안정시킵니다. 계란은 테이퍼 후방 끝에 주입되고 할로카본 오일을 첨가하면 조작 중에 계란을 촉촉하게 유지합니다.
미세 주입 중 배아 손상을 제한하려면 주사 바늘이 적절한 강도여야하며 적절한 각도로 베브해야합니다. 50° 각도에서 10초 동안 구겨진 알루미노실리케이트 바늘은 최상의 결과를 보였지만, 보로실리케이트와 석영 바늘은 내구성이 낮고 더 비싸더라도 효과가 있을 수 있습니다. 또한, 적절한 바늘 베벨링은 Cas9 및 sgRNA 혼합물의 더 나은 흐름을 용이하게하고 배아로 쉽게 침투할 수 있도록 선명한 지점을 만듭니다. 많은 경우에, beveling신속 하 게 막힌 된 바늘을 대체 하는 시간과 노력을 지출 하는 대신 막힌 된 바늘을 해결 하는 효율적인 방법.
주입 후, 계란은 깨끗한 페인트 브러시로 부드럽게 닦아 할로카본 오일이 즉시 제거되는 동안 적어도 5 분 동안 방해받지 않도록 유지해야합니다. 할로카본 오일을 제거한 후 주입된 계란을 물에 배치하여 부화할 수 있으며, 이는 일반적으로 주입 후 3일 이내에 발생합니다. 연습과 계란의 충분한 수로, 이 프로토콜은 C. quinquefasciatus에 있는 일관된 체세포 및 생식선 돌연변이를 달성할 수 있고 그밖 Culex 모기에 쉽게 적응할 수 있어야 할 충분히 다재다능합니다.

C. 퀸케파시아투스는일반적으로 남부 집 모기로 알려져 있으며, 웨스트 나일 바이러스 (WNV), 일본 뇌염, 세인트 루이스 뇌염 및 동부 말 뇌염을 포함한 수많은 병원균의 유능한 벡터입니다. 특히, 1999년 뉴욕에서 처음 발견된 이래, WNV는 미국 대륙 전역의 주요 벡터 매개 질병이 되었으며, 1999년과 2018년 사이에 약 2,300명의 사망자가 발생하고 2008-2019년 사이에 4,500건 이상의 말사례가보고되었습니다. 또한 북미에서 발견되는 최소 23종의 조류종은 WNV3의결과로 복구할 수 없는 것으로 분류된 최소 12종의 WNV 감염의 영향을 받았습니다. WNV가 인간, 말 및 조류 집단에 미치는 영향은 벡터의 기회적 공급 행동 때문입니다. 일반적으로 조류는 WNV의 주요 호스트이며 인간과 말은 부수적이거나 막다른 호스트입니다. C. quinquefasciatus에 의해 벡터된 몇몇 병원체는 조류 말라리아 기생충, Plasmodium 유물과같은 조류를 감염합니다. 하와이에서 C. 퀸케파시아투스는 조류 말라리아의 주요 벡터이며 많은 토착 조류 종4,5의멸종을 일으켰습니다.
C. quinquefasciatus에의해 전달되는 질병을 통제하기 위하여는, 연구원 및 벡터 통제 기관은 살충제 응용 프로그램 6과 같은 일반적으로 확립된 모기 인구 통제 공구를 이용했습니다6,그러나, 이러한 방법은 종 특정이 아닌 비용이 많이 들고, 많은 C. quinquefasciatus 인구6,7,8,9에서높은 살충제에 대한 저항이 높기 때문에 제한된 효과를 갖는다. Wolbachia-기반인구 통제 전략과 같은 다른 제어 기술은 최근10,11에서 개발되었지만, Wolbachia 감염과 관련된 피트니스 비용은 이벡터(12)에대한 이 접근법의 타당성을 제한한다. 또한 Aedes aegypti13, 14, 아노펠레스 감비아(15) 및 아노펠레스 스네이16과같은 다른 모기 종에서 개발된 유전자 기반 조절 방법이 있는데, 병원균 내성 모기17,18,19의개발을 포함하여, 재구성도구가 설계되는 경우 C. quinquefasciatus를 위해 개발될 수 있다. 이 종을 위해 개발. 그러나, C. quinquefasciatus 생물학은 이 벡터에서 유사한 유전 기술의 발달을 어렵게 만든 그밖 Aedes 및 Anopheles 모기 벡터와 크게 다릅니다. CRISPR 기반 게놈 엔지니어링 기술이 등장하면서 정밀 게놈 엔지니어링은 점점 더 사소하고 저렴하며 적응력이 뛰어나므로 다양한 종에서 새로운 유전 적 도구가 개발되었습니다.
CRISPR 기반 기술로 돌연변이를 생성하기 위해, 원하는 loci에 보완되는 Cas9 단백질 및 합성 가이드 RNA(sgRNA)의 혼합물은 전 blastoderm 단계 배아로 마이크로인주사된다. C. quinquefasciatus 암컷이 떠다니는 뗏목구조(그림 1)에부착된 그룹으로 알을 낳기 때문에 개별 계란, Aedes 및 Anopheles 모기의 특성, 배아 미세 주사는 이 종에서 점점 더 복잡해지고 있습니다. 컬렉스 애벌레는 또한수면(도 1)과접촉하는 각 계란의 전방 측에서 나타나므로 난자 방향 사후 조작이 이 종에서 중요하다. 여기에서 우리는 C. quinquefasciatus 태아로 Cas9 단백질 및 sgRNA의 미세 주입을 위해 디자인된 상세한 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜은 적시에 계란 수집 및 계란 생존을 위한 열쇠인 특정 단계를 통해 배아 생존 및 게놈 돌연변이 비율을 향상하기 위하여 Culex 생물학에 유일한 특성을 수용하기 위하여 디자인되었습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>9 oz clear plastic pet cup</td>
			<td>Karat</td>
			<td>C-KC9</td>
			<td>Insect Rearing and Egg Collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>Microinjection, borosilicate and quartz needles could also be used but we prefered aluminosilicate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood</td>
			<td>Colorado Serum Company</td>
			<td>31025</td>
			<td>The colony took multiple generations to adapt to this blood source. Other blood sources are likely just as appropriate. See protocol notes on blood source selection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bugdorm</td>
			<td>Bugdorm</td>
			<td>4F2222</td>
			<td>Insect Rearing Cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 Protein with NLS</td>
			<td>PNABio</td>
			<td>CP01</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound Microscope</td>
			<td>Olympus BX41</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection, for embryo injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>104E</td>
			<td>Microinjection, to be used with beveler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase/RNase-Free distilled Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>B084NVQGXD</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet 4x or 4i programmable microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotips Microloader tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Microinjection, embryo collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tip paintbrush</td>
			<td>ZEM</td>
			<td>2595</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8773</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemotek</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>PS5</td>
			<td>Line Maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Beveler</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BV10</td>
			<td>Microinjection, needle beveling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000 or P-2000</td>
			<td>Microinjection, needle pulling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Drying Modeling Clay</td>
			<td>Jovi</td>
			<td>B0025Z71IM</td>
			<td>Microinjection, needle storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td>Microinjection, for embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugar</td>
			<td>Domino</td>
			<td></td>
			<td>20% sugar solution for adult sugar source.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0302</td>
			<td>Preparation of microinjection materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>K451020</td>
			<td>Preparation of microinjection materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-fine tip forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-121</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embryo microinjection techniques for efficient site-specific mutagenesis in culex quinquefasciatus

컬렉스 퀸케파시아투스는 조류 말라리아, 웨스트 나일 바이러스(WNV), 일본 뇌염, 동부 말 뇌염, 림프성 필라리아증 및 세인트 루이스 뇌염과 같은 다양한 벡터 매개 질병의 벡터입니다. 특히, 조류 말라리아는 수많은 풍토성 섬 조류 종의 멸종에 중요한 역할을하고있다, WNV는 미국에서 중요한 벡터 매개 질병이되고있다 동안. C. quinquefasciatus 생물학에 대한 추가 통찰력을 얻고 그들의 유전 통제 공구 상자를 확장하기 위하여, 우리는 이 종에 있는 게놈 공학을 위한 더 효율적이고 적당한 방법을 개발해야 합니다. 그러나, Culex 모기, 특히 그들의 계란 뗏목에 특유의 몇몇 생물학 특성은, 게놈 공학에 필요한 미세 주입 절차를 능력을 발휘하기 어렵게 만들었습니다. 이러한 과제를 해결하기 위해, 우리는 Culex 모기의 독특한 특성과 관련된 기술적 장애물을 완화하는 데 초점을 맞춘 최적화 된 배아 미세 주입 프로토콜을 개발했습니다. 이러한 절차는 C. quinquefasciatus에서 성공적인 미세 주입에 필수적인 계란 수집, 달걀 뗏목 분리 및 기타 취급 절차에 최적화 된 방법을 보여줍니다. CRISPR/Cas9 게놈 편집 기술과 결합될 때, 이 절차는 우리가 고급 게놈 공학을 수행하고 이 중요하지만 현재 연구되지 않는 질병 벡터에서 유전 통제 기술을 개발하는 데 필요한 사이트 특정, 효율적이고 유전성 생식선 돌연변이를 달성할 수 있게 합니다.

이전에 발표된 실험에서 이 방법은 어두운 안료의 발달에 중요한 유전자의 체세포 및 생식선 돌연변이를 성공적으로 생성하기 위해 사용되었다, 흰색 (CPIJ005542)30 (표 1). CRISPR/Cas9 생성된 체세포 돌연변이는 주입된 개별의 pupal 단계 눈에서 착색의 손실을 위한 검열에 의해 득점되었다 (G0). 체세포 돌연변이는 일반적으로 모든 세포가 돌연변이 표현형을 가지고 있지만 일부하지만 모조 표현형으로 존재하였다. 예를 들어, 백색 유전자의 체세포 돌연변이는 색소 침착이 결여된 표현형과 야생형 색소형 표현형30을가진 옴마티디아의 혼합물을 초래하였다. 그러나 백색 유전자의 생식선 돌연변이가 있었을 때, 그러나, 차세대(G1)는전체 백색 눈 표현형을 승계하였다. 생식선 돌연변이 율은 모자이크 G0 개인을 교차하고 완전히 흰색 눈 자손에 대한 점수 (G1)에의해 결정되었다. 이러한 실험으로 인해 64%에서 82%의 배아 생존율뿐만 아니라 37%에서 57%의 체세포 돌연변이 발생율 및 >61% 생식선 돌연변이 발생률(표1)을초래하였다. 동일한 유전자에서 다중 로시를 표적으로 하는 sgRNAs를 멀티플렉스함으로써, 체세포 및 생식선 돌연변이 발생률은 86%(표1)만큼상향 증가했다. 또한, 여러 세대에 걸쳐 백색 돌연변이의 가능한 동질주들이 실험실에 성공적으로 보관되어 왔습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig01.jpg"> 그림 1: C. 퀸케파시아투스 달걀 뗏목과 단일 계란 형태. 도르살(A),측면(B),및 복부(C)C quinquefasciatus 계란 뗏목의 전망. C. 퀸케파시아투스 암컷은 수면을 더 구근 전방으로 만지는 구근 전방으로 알을 낳고,수면(D)에서더 뾰족한 후방을 가리킨다. A- 전방; P-후방이 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61375/61375fig01large.jpg" target="_blank">그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2.jpg"> 그림 2: 미세 주입에 의한 C. 퀸케파시아투스 돌연변이를 만들기 위한 타임라인입니다. C. 퀸케파시아투스 식민지 제제 및 미세 주입을 위한 배아 수집의 타임라인(A-D). 수집된 계란은 동일한방향으로 정렬되고 할로카본오일(F)으로덮여 있습니다. 계란은 그 때 주입(G)할로탄소 오일(H)를제거하기 전에 최소 5 분 동안 휴식을 허용한다. 그런 다음 계란은 부화(J)를위해 깨끗한 수원(I)으로옮겨지고 돌연변이 표현형(K)을검사합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">생존</td>
			<td colspan="3">체세포 모자이크 (G0)</td>
			<td>생식선 돌연변이 발생 (G1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>sgRNA</td>
			<td>#injected</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>합계(%)</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>합계(%)</td>
			<td>G1 돌연변이 (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1</td>
			<td>50</td>
			<td>15</td>
			<td>20</td>
			<td>35(70)</td>
			<td>7(47)</td>
			<td>13(65)</td>
			<td>20(57)</td>
			<td>128(69)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-2</td>
			<td>50</td>
			<td>9</td>
			<td>32</td>
			<td>41(82)</td>
			<td>3(33)</td>
			<td>12(38)</td>
			<td>15(37)</td>
			<td>51(61)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>15</td>
			<td>32(64)</td>
			<td>7(41)</td>
			<td>8(53)</td>
			<td>15(47)</td>
			<td>157(72)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2</td>
			<td>50</td>
			<td>7</td>
			<td>16</td>
			<td>23(46)</td>
			<td>5(71)</td>
			<td>12(75)</td>
			<td>17(74)</td>
			<td>123(79)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>13</td>
			<td>9</td>
			<td>22(44)</td>
			<td>10(77)</td>
			<td>6(67)</td>
			<td>16(73)</td>
			<td>72(81)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>10</td>
			<td>27(54)</td>
			<td>13(76)</td>
			<td>8(80)</td>
			<td>21(78)</td>
			<td>101(85)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>11</td>
			<td>10</td>
			<td>21(42)</td>
			<td>9(82)</td>
			<td>9(90)</td>
			<td>18(86)</td>
			<td>149(86)</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 백색을 표적으로 하는 단 하나 및 멀티플렉스 gRNA로 주입된 태아의 생존 그리고 돌연변이 비율. 테이블은30의 허가하에 다시 인쇄됩니다.

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Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 유전자 편집 도구와 함께 작동하도록 최적화된 Culex quinquefasciatus 태아를 위한 미세 주입 절차를 기술합니다. 이 기술은 이 저학질병 벡터에 있는 유전 기술을 구축하는 데 사용될 수 있는 사이트 특정, 유전성, 생식선 돌연변이를 효율적으로 생성할 수 있습니다.

컬렉스 퀸케파시아투스의 효율적인 부위 별 돌연변이 발생을 위한 배아 미세 주입 기술

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

embryo-microinjection-techniques-for-efficient-site-specific

Research

JoVE Journal

Genetics

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

5.3K 조회수.  University of California, San Diego. 이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 유전자 편집 도구와 함께 작동하도록 최적화된 Culex quinquefasciatus 태아를 위한 미세 주입 절차를 기술합니다. 이 기술은 이 저학질병 벡터에 있는 유전 기술을 구축하는 데 사용될 수 있는 사이트 특정, 유전성, 생식선 돌연변이를 효율적으로 생성할 수 있습니다.

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Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

레이저를 이용한 가축 접합체의 세포질 미세 주입을

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

연구

유전학

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

세계적인 농업 해충 곤충의 배아 미세 주입을 통해 핵산 배달,<em&gt; Ceratitis의 capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, such as transcription, DNA replication, and DNA repair. HMGB1 binds to structurally distorted DNA with higher affinity than to canonical B-DNA. For example, we found that HMGB1 binds to DNA interstrand crosslinks (ICLs), which covalently link the two strands of the DNA, cause distortion of the helix, and if left unrepaired can cause cell death. Due to their cytotoxic potential, several ICL-inducing agents are currently used as chemotherapeutic agents in the clinic. While ICL-forming agents show preferences for certain base sequences (e.g., 5&#39;-TA-3&#39; is the preferred crosslinking site for psoralen), they largely induce DNA damage in an indiscriminate fashion. However, by covalently coupling the ICL-inducing agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO), which binds to DNA in a sequence-specific manner, targeted DNA damage can be achieved. Here, we use a TFO covalently conjugated on the 5&#39; end to a 4&#39;-hydroxymethyl-4,5&#39;,8-trimethylpsoralen (HMT) psoralen to generate a site-specific ICL on a mutation-reporter plasmid to use as a tool to study the architectural modification, processing, and repair of complex DNA lesions by HMGB1 in human cells. We describe experimental techniques to prepare TFO-directed ICLs on reporter plasmids, and to interrogate the association of HMGB1 with the TFO-directed ICLs in a cellular context using chromatin immunoprecipitation assays. In addition, we describe DNA supercoiling assays to assess specific architectural modification of the damaged DNA by measuring the amount of superhelical turns introduced on the psoralen-crosslinked plasmid by HMGB1. These techniques can be used to study the roles of other proteins involved in the processing and repair of TFO-directed ICLs or other targeted DNA damage in any cell line of interest.

Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.

도구 나선 왜곡, 사이트 별 DNA Interstrand 가교의 처리에 건축 단백질 HMGB1의 역할을 연구하는

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

히스톤 - miniSOG에서 사용 Optogenetic 무작위 돌연변이 유발<em&gt; C. 엘레</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

대상<em&gt; 현장에서</em신진 효모에서&gt; 돌연변이 유발 히스톤의 유전자

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

태아 Microinjection 및 Nasonia vitripennis 게놈 조작을 위한 이식 기술

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve random mutagenesis, error-prone PCR is a convenient and efficient strategy for generating a diverse pool of mutants (i.e., a mutant library). Error-prone PCR is the method of choice when a researcher seeks to mutate a pre-defined region, such as the coding region of a gene while leaving other genomic regions unaffected. After the mutant library is amplified by error-prone PCR, it must be cloned into a suitable plasmid. The size of the library generated by error-prone PCR is constrained by the efficiency of the cloning step. However, in the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, the cloning step can be replaced by the use of a highly efficient one-step fusion PCR to generate constructs for transformation. Mutants of desired phenotypes may then be selected using appropriate reporters. Here, we describe this strategy in detail, taking as an example, a reporter inserted at centromeric heterochromatin.

This article describes a detailed methodology for random mutagenesis of a target gene in fission yeast. As an example, we target rpt4+, which encodes a subunit of the 19S proteasome, and screen for mutations that destabilize heterochromatin.

분열 효 모 섬으로 불안정 프로테아좀 돌연변이 선택할 임의의 Mutagenesis 유전자 타겟팅

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to visceral pathology. Deciphering the nature of the vector/parasite interactions is of primary importance for better understanding of Leishmania transmission to their hosts. Among the parameters controlling the sand fly vector competence (i.e. their ability to carry and transmit pathogens), parameters intrinsic to these insects were shown to play a key role. Insect immune response, for example, impacts sand fly vector competence to Leishmania. The study of such parameters has been limited by the lack of methods of gene expression modification adapted for use in these non-model organisms. Gene downregulation by small interfering RNA (siRNA) is possible, but in addition to being technically challenging, the silencing leads to only a partial loss of function, which cannot be transmitted from generation to generation. Targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 technology was recently adapted to the Phlebotomus papatasi sand fly. This technique leads to the generation of transmissible mutations in a specifically chosen locus, allowing to study the genes of interest. The CRISPR/Cas9 system relies on the induction of targeted double-strand DNA breaks, later repaired by either Non-Homologous End Joining (NHEJ) or by Homology Driven Repair (HDR). NHEJ consists of a simple closure of the break and frequently leads to small insertion/deletion events. In contrast, HDR uses the presence of a donor DNA molecule sharing homology with the target DNA as a template for repair. Here, we present a sand fly embryo microinjection method for targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 using NHEJ, which is the only genome modification technique adapted to sand fly vectors to date.

Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

This protocol details the steps of CRISPR/Cas9 targeted mutagenesis in sand flies: embryo collection, injection, insect rearing, and identification as well as selection of mutations of interest.

샌드 플라이 (플레보토무스 파파타시) CRISPR/Cas9 돌연변이 발생을 위한 배아 미세 주입

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

개미 하르페냐토스 염기 에서 CRISPR 매개 돌연변이 유발을 위한 배아 주사

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA fragments encoding genes of interest as well as favorable traits into the insect germline in a stable and heritable manner. The resulting transgenic strains can be studied for phenotypic changes resulting from the expression of the integrated DNA to answer basic questions or used in practical applications. Although the technology is straightforward, it requires of the investigator patience and practice to achieve a level of skill that maximizes efficiency. Shown here is a method for microinjection of embryos of the African malaria mosquito, Anopheles gambiae. The objective is to deliver by microinjection exogenous DNA to the embryo so that it can be taken up in the developing germline (pole) cells. Expression from the injected DNA of transposases, integrases, recombinases, or other nucleases (for example CRISPR-associated proteins, Cas) can trigger events that lead to its covalent insertion into chromosomes. Transgenic An. gambiae generated from these technologies have been used for basic studies of immune system components, genes involved in blood-feeding, and elements of the olfactory system. In addition, these techniques have been used to produce An. gambiae strains with traits that may help control the transmission of malaria parasites.

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Microinjection techniques are essential to introduce exogenous genes into the genomes of mosquitoes. This protocol explains a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles gambiae embryos to generate transformed mosquitoes.

아노펠레 감비아에 배아를 위한 미세 주입 방법

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA ...