עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי קרנות הפעלה UCSD המופנות ל- O.S.A.

1. ג. גידול מושבת קווינקפסיאטוס
<ol><li>הקימו מספר מושבות של בוגרי C. quinquefasciatus בכלובי מעונות באגים. הערה: המושבות סופקו על ידי ד"ר לורה הרינגטון באוניברסיטת קורנל20. פרוטוקולים מפורטים לגידול יתושי קולקס ניתן למצוא בספרות אחרת21.<ol>
<li>לשמור על היתושים ב 25 ± 1 °C (50 °F) ב 30% לחות עם מחזור 12:12 שעות היום:לילה.</li>
		<li>ספק 20% תמיסת סוכר ad libitum על ידי החדרת מיכל תמיסת סוכר עם פתיל לתוך הכלוב או על ידי רווי כדורי צמר גפן עם תמיסת הסוכר והנחתו בתוך הכלוב.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אפשרו ליתושים להזדווג לפחות 3 ימים לפני האכלת הדם(איור 2A).</li>
</ol>2. אוסף עוברי שלב טרום בלסטורם C. quinquefasciatus
<ol><li>לאחר 3-6 ימים לאחר ההסמכה, ספק לנקבות 1-2 מ"ל של ארוחת דם בקר ציטוט דרך קרום סינתטי מחומם לכ 40 °C (איור2B). ישנם גם פרוטוקולי האכלת דם חלופיים שניתן להשתמש בהם עבור יתושי קולקס (למשל, ראה ref21). הערה: C. quinquefasciatus ידוע בהעדפה לדם עופות. מעבדות מסוימות משתמשות בציפורים חיות או בדם עופות עבור מקור ארוחת הדם שלהם21,22,23. עם זאת, מושבות ניתן לאמן / נבחר להאכיל על דם בקר או מכרסמים קטנים אם תכונה זו נבחרה במשך דורות מרובים.<ol>
<li>אפשר לנקבות לנוח לפחות 3 ימים לאחר האכלת הדם כדי לעבור אוגנזה והבשלת ביצים לפני גרימת oviposition לניסויים מיקרו-אכילים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ביום של מיקרו-אנז'ים עובריים, צור oviposition עם מי oviposition חדורים אורגנית. מי Oviposition צריך להיעשות על ידי צואת ארנב מותססת (50 גרם / ליטר), דשא נרקב (4.5 גרם / ליטר), או מזון דגים (25 גרם / ליטר) במים במהלך 5 ימים או יותר24,25.</li>
	<li>הכניסו את ההויפוזפוזה לכלוב והכניסו את כל הכלוב למקום חשוך(איור 2C).</li>
	<li>לאחר כל 30 דקות, לבדוק את הכוס עבור רפסודות ביצים.<ol>
<li>אם יש רפסודות ביצים, אספו את הרפסודות על ידי כך שתגרפו אותן עם מברשת צבע והניחו אותן על נייר סינון רטוב(איור 2D,E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. יישור של C. quinquefasciatus לפני blastoderm עוברי שלב
<ol><li>הפרד את הביצים מהרפסודות על ידי לחיצה על הרפסודה והקנטות של הביצים בנפרד באמצעות מברשת צבע ומלקחיים עדינים(איור 2E).</li>
	<li>יישר ביצים בודדות על רצועה דקה של סרט דביק דו-צדדי המונח על החלק העליון של שקופית זכוכית(איור 2F).</li>
	<li>בעת יישור, נסה לכוון את הצד הצידה של כל ביצה לאותו כיוון לנגישות קלה יותר. הערה: ניתן למצוא שיטה חלופית ליישור ביצה ללא סרט דביק דו צדדי בפרוטוקול מיקרו-ייחוס של עוברי Nasonia vitripennis שפורסם בעבר26.</li>
	<li>מכסים ביצים בתערובת שמן הילוקרבון. הערה: תערובת Halocarbon ניתן להכין מראש על ידי ערבוב בעדינות שני ריאגנטים הילוקרבון ומים (9:1:20, halocarbon 700 : halocarbon 27 : מים אולטרה-פורים) ולאחר מכן דגירה תערובת לילה ב 25οC כדי להקל על רוויית מים של שמן halocarbon.</li>
</ol>4. הכנת מחט למיקרו-טג'קציה
<ol><li>צור את מחטי זכוכית נימיות אלומינסיליות באמצעות פולר מיקרופיפט זכוכית.<ol>
<li>מניחים זכוכית נימית בוגרת לתוך מושך מחטים, לפי הוראות מדריך המשתמש של מושך המחטים. הערה: קוורץ ומחטים נימיות borosilicate ניתן להשתמש גם, אבל לניסוי זה, aluminosilicate הוא המועדף בגלל סבירות יחסית ועמידות.</li>
		<li>הגדר חום ל 516, מהירות ל 100, עיכוב ל 70, למשוך ל 97, ולחץ ל 500 על מושך המחט.</li>
		<li>הפעל את מושך המחט, בהתאם להוראות של מושך ולחזור לפי הצורך עבור מחטים נוספות. הערה: במהלך תהליך ההזרקה, מחטים לעתים קרובות להיות סתום או נשבר בטעות, ולכן, משיכת מחטים נוספות לניסוי אחד מומלץ מאוד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שיפוע קצה המחט על ידי נגיעה עדינה בקצה המחט שנמשכה על צלחת שוחקת יהלום מסתובבת במשך סביב 10 s בזווית של 50°. הערה: שיפוע המחט פותח אותו כדי לאפשר לנוזל לזרום דרך תוך יצירת קצה חד יותר לחדירה קלה יותר לתוך העובר. דוגמה למחט נכונה ניתן לראות במאמר הקודם26.</li>
	<li>חנות משכה ומחטים משופעות על ידי הטמעת אותם לתוך קווים של חימר של מודל בצלחת פטרי. הערה: כדי להבטיח את האיכות הטובה ביותר עבור טיפים מחט, מחטים צריך להיות משך טרי משופע קרוב ככל האפשר לזמן ההזרקה.</li>
</ol>5. טעינת תערובת ההזרקה
<ol><li>הכן את תערובת ההזרקה המורכבת ריאגנטים שינוי גנום (למשל, 200 ng / μL sgRNA ותערובת 200 ng / μL Cas9), או פתרונות הזרקה מועדפים ולשמור אותו על קרח. הערה: תערובת זו יכולה להיות מוכנה בזמן ההמתנה ביצים להיות מוטל. פרטים נוספים על Cas9 וייצור sgRNA והכנה למיקרו-ינון ניתן למצוא בפרסומים קודמים27,28,29,30.</li>
	<li>לטעון 2 μL של תערובת הזרקה לתוך מחט הזרקה באמצעות קצה microloader.</li>
</ol>6. הגדרת מיקרו-ערך
<ol><li>מניחים את מחט ההזרקה המלאה לתוך מיקרו-מניפולטור שהוקם מקושר למיקרו-נג'ר אלקטרוני.</li>
	<li>מניחים את שקופית הזכוכית המכילה את הביצים המיושרות על הבמה של מיקרוסקופ מורכב.</li>
	<li>באמצעות מיקרומניפולטור ומיקרוסקופ מורכב, ליישר את המחט כדי לכוון בקצה האחורי של העובר בזווית של 25-35°.</li>
</ol>7. מיקרו-נסיגה עוברית (איור 2G)
<ol><li>בזהירות להכניס את המחט לתוך העובר ולהזריק את התערובת בכמות של כ -10% מנפח העובר (700-800 pL בהתאם לגודל הביצים). הערה: בעת הזרקה, הביצה צריכה להתנפח מעט, עם זאת, אם יותר מדי נוזל מוזרק, ביצים עלולות להתפוצץ, או נוזל ציטופלסמי עלול לדלוף החוצה.</li>
	<li>להזריק סביב 20 ביצים בכל פעם ולאחר מכן להפסיק ולבצע הליכי התאוששות העובר. הערה: בעת הזרקה, יש סיכוי גבוה של מחטים או לסתום או לשבור. אם מתרחשת סתימה, אשר ניתן לקבוע על ידי חוסר נוזל הזרקה זורם דרך המחט, נסה גם לנקות את המחט עם הפונקציה הנקייה על microinjector אלקטרוני או לנסות לשדרג מחדש את המחט. אם אף אחד מהצעדים לא עובד, החלף במהירות למחט חדשה תוך הקפדה על כך שהביצים המוכנות יישארו לחות.</li>
</ol>8. התאוששות העובר והבקוע
<ol><li>להשאיר את הביצים ללא הפרעה לפחות 5 דקות. תוך 20 דקות לאחר ההזרקה, הסירו בזהירות את שמן ההילה על ידי צחצוח קל עם מברשת צבע נקייה(איור 2H).</li>
	<li>הרימו את הביצים בעדינות בעזרת מברשת צבע והכניסו אותן לכוס מים מזוקקים כפולה(איור 2I). יש להקפיד לשמור את הביצים על פני המים.</li>
	<li>בדוק את הביצים מדי יום במשך 7 ימים לבקוע(איור 2J).</li>
	<li>בצע נהלי גידול זחלים רגילים21.</li>
</ol>9. הקרנה לשינוי גנום
<ol><li>מסך היתושים המוזרקים עבור פנוטיפים מוטנטיים באמצעות סטריאוטסקופ (איור 2K).<ol>
<li>אמת מוטציות שאין להן פנוטיפ שניתן לזהות בקלות, על ידי הגברת PCR, T7 Endonuclease I assay, ורצף על ידי תת-קלקולציה של אזור היעד31.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הגדר צלבים נוספים בין אנשים מוזרקים כדי לזהות מוטציות תורשתיות בתוך נבט.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Final Cumulative Maps and Data | West Nile Virus. CDC Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight">https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight</a> (2019)</li><li>APHIS | West Nile Virus (WNV). USDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv">https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv</a> (2020)</li><li>Luke George, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+impacts+of+West+Nile+virus+on+North+American+bird+populations.">Persistent impacts of West Nile virus on North American bird populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), 14290-14294 (2015).</li><li>van Riper, C., van Riper, S. G., Lee Goff, M., Laird, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Epizootiology+and+Ecological+Significance+of+Malaria+in+Hawaiian+Land+Birds.">The Epizootiology and Ecological Significance of Malaria in Hawaiian Land Birds.</a> Ecological Monographs. 56 (4), 327-344 (1986).</li><li>Liao, W., Atkinson, C. T., LaPointe, D. A., Samuel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitigating+Future+Avian+Malaria+Threats+to+Hawaiian+Forest+Birds+from+Climate+Change.">Mitigating Future Avian Malaria Threats to Hawaiian Forest Birds from Climate Change.</a> PloS One. 12 (1), 0168880 (2017).</li><li>Martins, W. F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+insecticide+resistance+in+the+lymphatic+filariasis+vector+Culex+quinquefasciatus.">Transcriptomic analysis of insecticide resistance in the lymphatic filariasis vector Culex quinquefasciatus.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11406 (2019).</li><li>Norris, L. C., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insecticide+resistance+in+Culex+quinquefasciatus+mosquitoes+after+the+introduction+of+insecticide-treated+bed+nets+in+Macha,+Zambia.">Insecticide resistance in Culex quinquefasciatus mosquitoes after the introduction of insecticide-treated bed nets in Macha, Zambia.</a> Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 36 (2), 411-420 (2011).</li><li>Corbel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+insecticide+resistance+mechanisms+in+Anopheles+gambiae+and+Culex+quinquefasciatus+from+Benin,+West+Africa.">Multiple insecticide resistance mechanisms in Anopheles gambiae and Culex quinquefasciatus from Benin, West Africa.</a> Acta tropica. 101 (3), 207-216 (2007).</li><li>Yadoul&#233;ton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insecticide+resistance+status+in+Culex+quinquefasciatus+in+Benin.">Insecticide resistance status in Culex quinquefasciatus in Benin.</a> Parasites &amp; Vectors. 8, 17 (2015).</li><li>Atyame, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia-based+population+control+strategy+targeting+Culex+quinquefasciatus+mosquitoes+proves+efficient+under+semi-field+conditions.">Wolbachia-based population control strategy targeting Culex quinquefasciatus mosquitoes proves efficient under semi-field conditions.</a> PloS One. 10 (3), 0119288 (2015).</li><li>Atyame, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+incompatibility+as+a+means+of+controlling+Culex+pipiens+quinquefasciatus+mosquito+in+the+islands+of+the+south-western+Indian+Ocean.">Cytoplasmic incompatibility as a means of controlling Culex pipiens quinquefasciatus mosquito in the islands of the south-western Indian Ocean.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (12), 1440 (2011).</li><li>Almeida, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Wolbachia+on+fitness+of+Culex+quinquefasciatus+(Diptera;+Culicidae).">Effects of Wolbachia on fitness of Culex quinquefasciatus (Diptera; Culicidae).</a> Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 11 (8), 2138-2143 (2011).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+confinable+gene+drive+system+in+the+human+disease+vector+Aedes+aegypti.">Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti.</a> eLife. 9, 51701 (2020).</li><li>Phuc, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late-acting+dominant+lethal+genetic+systems+and+mosquito+control.">Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control.</a> BMC Biology. 5, 11 (2007).</li><li>Kyrou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas9+gene+drive+targeting+doublesex+causes+complete+population+suppression+in+caged+Anopheles+gambiae+mosquitoes.">A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).</li><li>Gantz, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+Cas9-mediated+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito+Anopheles+stephensi.">Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).</li><li>Buchman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+resistance+to+Zika+virus+in+transgenic+expressing+a+polycistronic+cluster+of+synthetic+small+RNAs.">Engineered resistance to Zika virus in transgenic expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).</li><li>Buchman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+dengue+neutralization+in+mosquitoes+expressing+an+engineered+antibody.">Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody.</a> PLoS Pathogens. 16 (1), 1008103 (2020).</li><li>Isaacs, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+resistance+to+Plasmodium+falciparum+development+in+transgenic+Anopheles+stephensi.">Engineered resistance to Plasmodium falciparum development in transgenic Anopheles stephensi.</a> PLoS Pathogens. 7 (4), 1002017 (2011).</li><li>Liu, N., Li, T., Reid, W. R., Yang, T., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Cytochrome+P450+genes:+their+constitutive+overexpression+and+permethrin+induction+in+insecticide+resistant+mosquitoes,+Culex+quinquefasciatus.">Multiple Cytochrome P450 genes: their constitutive overexpression and permethrin induction in insecticide resistant mosquitoes, Culex quinquefasciatus.</a> PloS One. 6 (8), 23403 (2011).</li><li>Kauffman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearing+of+Culex+spp.+and+Aedes+spp.+Mosquitoes.">Rearing of Culex spp. and Aedes spp. Mosquitoes.</a> Bio Protocols. 7 (17), 2542 (2017).</li><li>Richards, S. L., Anderson, S. L., Yost, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+blood+meal+source+on+the+reproduction+of+Culex+pipiens+quinquefasciatus+(Diptera:+Culicidae).">Effects of blood meal source on the reproduction of Culex pipiens quinquefasciatus (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 37 (1), 1 (2012).</li><li>Kitzmiller, J. B., Micks, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+Rearing+Culex+Mosquitoes.">Techniques for Rearing Culex Mosquitoes.</a> American Midland Naturalist. 52 (1), 253 (1954).</li><li>Mordue, A. J., Blackwell, A., Hansson, B. S., Wadhams, L. J., Pickett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+and+electrophysiological+evaluation+of+oviposition+attractants+for+Culex+quinquefasciatus+say+(Diptera:+Culicidae).">Behavioural and electrophysiological evaluation of oviposition attractants for Culex quinquefasciatus say (Diptera: Culicidae).</a> Experientia. 48 (11-12), 1109-1111 (1992).</li><li>Allgood, D. W., Yee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oviposition+preference+and+offspring+performance+in+container+breeding+mosquitoes:+evaluating+the+effects+of+organic+compounds+and+laboratory+colonisation.">Oviposition preference and offspring performance in container breeding mosquitoes: evaluating the effects of organic compounds and laboratory colonisation.</a> Ecological Entomology. 42 (4), 506-516 (2017).</li><li>Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+Microinjection+and+Transplantation+Technique+for+Nasonia+vitripennis+Genome+Manipulation.">Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56990 (2017).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+jewel+wasp+Nasonia+vitripennis+using+CRISPR/Cas9.">Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-7 (2017).</li><li>Li, M., Akbari, O. S., White, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient+Site-Specific+Mutagenesis+in+Malaria+Mosquitoes+Using+CRISPR.">Highly Efficient Site-Specific Mutagenesis in Malaria Mosquitoes Using CRISPR.</a> Genes, Genomes, Genetics. 8 (2), 653-658 (2018).</li><li>Li, M., Bui, M., Yang, T., White, B. J., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+Cas9+Expression+Yields+Highly+Efficient+Genome+Engineering+in+a+Major+Worldwide+Disease+Vector,+Aedes+aegypti.">Germline Cas9 Expression Yields Highly Efficient Genome Engineering in a Major Worldwide Disease Vector, Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (49), 10540-10549 (2017).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+disease+vector+Culex+quinquefasciatus+using+clustered+regularly+interspaced+short+palindrome+repeats-associated+protein+9.">Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9.</a> Insect Molecular Biology. 29 (2), 214-220 (2020).</li><li>New England Biolabs Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclease I. NEB Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i">https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i</a> (2020)</li></ol>

עם המאמצים האחרונים לייצר כלים מהונדסים גנטית לשליטה וקטורית יתושים, יש צורך לפתח ולייעל פרוטוקולי microinjection העובר עבור וקטורים נפוצים מחלת יתושים. למרות ששיטות פותחו עבור יתושי Aedes ו Anopheles, פרוטוקול שתוכנן במיוחד עבור Culex נחקר באופן מינימלי. באופן כללי ניתן לחלק פרוטוקולי הזרקת עוברים יתושים לשלושה שלבים כלליים: 1) איסוף והכנה של עוברים, 2) הזרקת עוברים, ו -3) התאוששות לאחר הזרקה. על מנת ליצור מוטציות בהצלחה, כל שלושת השלבים חייבים להיות מותאמים למין היעד. פרוטוקול שונה זה עבור מיקרו-הנדסה עוברית הוא ספציפי להנדסת גנום מוצלחת של יתושי קולקס.
מקסום אוסף העוברים הוא צוואר בקבוק נפוץ בפרוטוקולי מיקרו-נג'ק של העובר. על מנת להגדיל את מספר הביצים שנאספו בפרק זמן קצר, היתושים הוגבלו ממצע oviposition במשך 2-3 ימים לאחר ארוחת הדם. חשוב לציין כי C. quinquefasciatus נוטים להעדיף מקורות דם עופות לעומת מקורות יונקים או ממברנה האכלה עם דם יונקים. עם זאת, חוקרים רבים מתקשים להשיג מקור אמין של עופות חיים או דם עופות להאכלת דם, כך שמלאי המעבדה יכול להיות מותאם כדי להאכיל מקורות דם נגישים יותר. זה גם חיוני כדי להשתמש במים עשירים בחומרים מזינים עבור מצע oviposition כפי שהוא מספק רמזים oviposition עבור C. quinquefasciatus ורוב וקטורים אחרים Culex. ישנן שיטות רבות כדי לייצר מים עשירים בחומרים מזינים, אשר ייתכן שיהיה צורך אופטימיזציה בין מעבדות כדי להבטיח מספר מתאים של ביצים זמינים עבור microinjection. לדוגמה, בעוד שיטה זו הייתה המוצלחת ביותר עם צואת ארנב מותסס במים deionized במשך 5 ימים או יותר, חוקרים אחרים יש הצלחה רבה יותר עם דשא או מזון דגים כמקור התזונתי וחלקם אפילו עם מים מזוקקים21.
מאז יתושי קולקס להטיל קבוצות של ביצים רפסודות, איסוף ביצים הוא פשוט למדי. ביצים ניתן פשוט לאסוף על ידי גרף את כל הרפסודה עם מברשת צבע. הפרדת ביצים היא מורכבת יותר, אבל חיוני להזרקה מוצלחת. ביצים ניתן להפריד בזהירות מן הרפסודה על ידי הפעלת לחץ עדין כלפי מטה בין ביצים עם מברשת צבע או מלקחיים. עם קצת תרגול, משתמשים מרובים היו מסוגלים באופן אמין להפריד ביצים בודדות רפסודות ביצים. לאחר הפרדת כל ביצה, הביצים מיושרות באותו כיוון על סרט דביק דו צדדי, אשר מייצב את הביצים במהלך microinjection. ביצים מוזרקות לקצה האחורי המחודד ותוספת שמן הילוקרבון שומרת על הביצים לחות במהלך מניפולציה.
כדי להגביל את נזק העובר במהלך microinjection, מחטי הזרקה צריך להיות של כוח מתאים משופע בזווית מתאימה. למחטים אלומינוסיליות משופעות במשך 10 שניות בזווית של 50 מעלות היו התוצאות הטובות ביותר, אבל מחטי בורוסיליקט וקוורץ עשויות גם הן לעבוד, למרות שהן עשויות להיות פחות עמידות ויקרות יותר. בנוסף, שיפוע מחט תקין מאפשר זרימה טובה יותר של תערובות Cas9 ו- sgRNA ויוצר נקודה חדה יותר לחדירה קלה יותר לעובר. במקרים רבים, שיפוע הוא גם דרך יעילה לתקן במהירות מחטים סתומות במקום לבזבז את הזמן והמאמץ להחליף מחטים סתומות.
לאחר ההזרקה, ביצים צריכות להישאר ללא הפרעה לפחות 5 דקות עם שמן halocarbon מוסר מיד לאחר מכן על ידי צחצוח בעדינות משם עם מברשת צבע נקייה. לאחר הסרת שמן halocarbon, ביצים מוזרקות ניתן להציב במים כדי לבקוע, אשר מתרחשת בדרך כלל בתוך 3 ימים לאחר הזרקה. עם תרגול ומספר מספיק של ביצים, פרוטוקול זה יכול להשיג מוטציות סומטיות ונבטים עקביים ב- C. quinquefasciatus והוא רב-תכליתי מספיק כדי שניתן יהיה להתאים אותו בקלות ליתושי קולקס אחרים.

C. quinquefasciatus, הידוע בכינויו יתוש הבית הדרומי, הוא וקטור מוסמך של פתוגנים רבים כולל וירוס הנילוס המערבי (WNV), דלקת המוח היפנית, דלקת המוח של סנט לואיס ודלקת המוח של הסוס המזרחי. בפרט, מאז זוהה לראשונה בניו יורק בשנת 1999, WNV הפך למחלה וקטורית מרכזית ברחבי ארצות הברית היבשתית (ארה"ב) עם מעל 50,000 מקרים אנושיים שדווחו וכתוצאה מכך כ -2,300 מקרי מוות בין 1999 ל -20181, כמו גם מעל 4,500 מקרי סוסים שדווחו בין השנים 2008-20192. בנוסף, לפחות 23 מיני ציפורים שנמצאו בצפון אמריקה הושפעו מזיהומים ב-WNV עם לפחות 12 מינים המסווגים כבלתי הפיכים כתוצאה מ-WNV3. ההשפעה של WNV על אוכלוסיות אנושיות, סוסים ועופות נובעת מהתנהגות האכלה אופורטוניסטית של הווקטורים שלה. בדרך כלל, ציפורים הן המארחות העיקריות של WNV, ובני אדם וסוסים הם מארחים מקריים או ללא מוצא. כמה פתוגנים וקטור על ידי C. quinquefasciatus רק להדביק ציפורים כגון טפיל מלריה עופות, שריד פלסמודיום. בהוואי, C. quinquefasciatus הוא וקטור עיקרי של מלריה עופות וגרם להכחדתם של מיני ציפורים מקומיים רבים4,5.
כדי לשלוט במחלות המועברות על ידי C. quinquefasciatus, חוקרים וסוכנויות בקרה וקטורים השתמשו בכלים נפוצים לבקרת אוכלוסיית יתושים כגון יישום קוטל חרקים6, עם זאת, שיטות אלה הן יקרות, לא ספציפיות למינים, ויש להם יעילות מוגבלת כמו עמידות לחומרי הדברה גבוהה באוכלוסיות C. quinquefasciatus רבים6,7,8,9. טכניקות בקרה אחרות, כגון אסטרטגיות בקרת אוכלוסין מבוססות וולבצ'יהפותחו בשנים האחרונות10,11, אבל עלויות הכושר הקשורות זיהום Wolbachia להגביל את ההיתכנות של גישה זו עבור וקטור זה12. ישנן גם שיטות בקרה מבוססות גנטית שפותחו במינים אחרים של יתושים כגון Aedes aegypti13,14, אנופלס גמביה15 ו אנופלס סטיבנסי16, כולל פיתוח יתושים עמידים לפתוגן17,18,19, זה יכול להיות מפותח גם עבור C. quinquefasciatus אם הכלים הנדסת הגנום הנדרשים הם פותח עבור מין זה. עם זאת, ביולוגיה C. quinquefasciatus שונה מאוד מווקטורים אחרים של יתושים Aedes ו Anopheles אשר עשה את הפיתוח של טכנולוגיות גנטיות דומות קשה בווקטור זה. עם הופעתן של טכנולוגיות הנדסת גנום מבוססות CRISPR, הנדסת גנום מדויקת הפכה לטריוויאלית יותר ויותר, משתלמת ומסתגלת וכתוצאה מכך הובילה לפיתוח כלים גנטיים חדשניים במגוון רחב של מינים.
כדי ליצור מוטציות עם טכנולוגיות מבוססות CRISPR, תערובת של חלבון Cas9 ו- RNA מדריך סינתטי (sgRNA), המשלים את הלוצי הרצוי, הוא microinjected לתוך עוברים שלב טרום blastoderm. מאחר שנקבות C. quinquefasciatus מטילות את ביציהן בקבוצות המחוברות במבנה רפסודה צף (איור 1),בניגוד לתפיסת ביצים בודדות, תכונה של יתושי Aedes ו- Anopheles, מיקרו-יינות עוברים מסובכים יותר ויותר במין זה. זחלי קולקס מגיחים גם מהצד הצידה הצידי של כל ביצה, שנמצא במגע עם פני המים(איור 1),כך שכיוון הביצה לאחר המניפולציה חשוב במין זה. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט המיועד למיקרו-הזרקה של חלבון Cas9 ו- sgRNA לעוברים C. quinquefasciatus. פרוטוקול זה תוכנן כדי להתאים תכונות ייחודיות לביולוגיה של Culex על מנת לשפר את הישרדות העובר ואת שיעורי מוטציית הגנום באמצעות שלבים מסוימים שהם המפתח לאיסוף ביצים בזמן והישרדות הביצים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>9 oz clear plastic pet cup</td>
			<td>Karat</td>
			<td>C-KC9</td>
			<td>Insect Rearing and Egg Collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>Microinjection, borosilicate and quartz needles could also be used but we prefered aluminosilicate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood</td>
			<td>Colorado Serum Company</td>
			<td>31025</td>
			<td>The colony took multiple generations to adapt to this blood source. Other blood sources are likely just as appropriate. See protocol notes on blood source selection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bugdorm</td>
			<td>Bugdorm</td>
			<td>4F2222</td>
			<td>Insect Rearing Cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 Protein with NLS</td>
			<td>PNABio</td>
			<td>CP01</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound Microscope</td>
			<td>Olympus BX41</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection, for embryo injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>104E</td>
			<td>Microinjection, to be used with beveler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase/RNase-Free distilled Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>B084NVQGXD</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet 4x or 4i programmable microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotips Microloader tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Microinjection, embryo collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tip paintbrush</td>
			<td>ZEM</td>
			<td>2595</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8773</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemotek</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>PS5</td>
			<td>Line Maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Beveler</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BV10</td>
			<td>Microinjection, needle beveling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000 or P-2000</td>
			<td>Microinjection, needle pulling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Drying Modeling Clay</td>
			<td>Jovi</td>
			<td>B0025Z71IM</td>
			<td>Microinjection, needle storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td>Microinjection, for embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugar</td>
			<td>Domino</td>
			<td></td>
			<td>20% sugar solution for adult sugar source.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0302</td>
			<td>Preparation of microinjection materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>K451020</td>
			<td>Preparation of microinjection materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-fine tip forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-121</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embryo microinjection techniques for efficient site-specific mutagenesis in culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus הוא וקטור של מגוון רחב של מחלות המועברות בווקטור כגון מלריה עופות, וירוס הנילוס המערבי (WNV), דלקת המוח היפנית, דלקת המוח של הסוס המזרחי, פילאריאזיס הלימפה ודלקת המוח של סנט לואיס. ראוי לציין כי מלריה עופות מילאה תפקיד מרכזי בהכחדתם של מיני ציפורים אנדמיים רבים באי, בעוד WNV הפך למחלה חשובה המועברת על ידי וקטור בארצות הברית. כדי לקבל תובנה נוספת על ביולוגיה C. quinquefasciatus ולהרחיב את ארגז הכלים שלהם שליטה גנטית, אנחנו צריכים לפתח שיטות יעילות ובמחיר סביר יותר להנדסת גנום במין זה. עם זאת, כמה תכונות ביולוגיות ייחודיות יתושי Culex, במיוחד רפסודות הביצים שלהם, הקשו על ביצוע הליכי microinjection הנדרשים להנדסת גנום. כדי להתמודד עם אתגרים אלה, פיתחנו פרוטוקול מיקרו-ייחוס עוברי ממוטב המתמקד בהפחתת המכשולים הטכניים הקשורים למאפיינים הייחודיים של יתושי Culex. נהלים אלה מדגימים שיטות אופטימליות לאיסוף ביצים, הפרדת רפסודות ביצים והליכי טיפול אחרים החיוניים למיקרו-לינג'ק מוצלח ב- C. quinquefasciatus. בשילוב עם טכנולוגיית עריכת הגנום CRISPR/Cas9, הליכים אלה מאפשרים לנו להשיג מוטציות נבטים ספציפיות לאתר, יעילות ותודישתיות, הנדרשות לבצע הנדסת גנום מתקדמת ולפתח טכנולוגיות בקרה גנטית בווקטור המחלה החשוב, אך כיום אינו אמין.

בניסויים שפורסמו בעבר שיטה זו שימשה ליצירת מוטציות סומטיות ונבטיות של גן קריטי להתפתחות פיגמנטציה בעיניים כהות, לבן (CPIJ005542)30 (טבלה 1). CRISPR/Cas9 שנוצר מוטציות סומטיות נוצרו ציון על ידי הקרנה לאובדן פיגמנטציה בעיניים שלב pupal של אנשים מוזרקים (G0). מוטציות סומטיות היו בדרך כלל נוכחים כמו פנוטיפים פסיפס שבו חלק אבל לא כל התאים יש פנוטיפ מוטציה. לדוגמה, מוטציות סומטיות של הגן הלבן הביאו לתערובת של ommatidia עם פנוטיפים חסרי פיגמנטציה ואלה עם פנוטיפ פיגמנטי wildtype30. עם זאת, כאשר הייתה מוטציה נבטית של הגן הלבן, הדור הבא (G1)ירש את הפנוטיפ המלא של העיניים הלבנות. שיעורי המוטציה של נבטים נקבעו על ידי פסיפס משולב G0 אנשים וניקוד עבור צאצאים עיניים לבנות לחלוטין (G1). ניסויים אלה הביאו לשיעור הישרדות של 64% עד 82%, כמו גם שיעור הישרדות מוטגנזה סומטית של 37% עד 57% ושיעור מוטגנסיס של >61% נבטים(טבלה 1). על ידי מולטיפלקסינג sgRNAs למקד loci מרובים באותו גן, שיעורי mutagenesis סומטית חיידקים גדל כלפי מעלה עד 86% (טבלה 1). בנוסף, במשך דורות רבים, מניות הומוזיגוס קיימא של המוטנטים הלבנים נשמרו בהצלחה במעבדה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig01.jpg"> איור 1: ג. רפסודת ביצים קווינקפסיאט ומורפולוגיה של ביצה אחת. נופים צדדיים(B),וגחון(C)של רפסודות ביצים C quinquefasciatus. ג. נקבות קווינקפסיאטו מטילות את ביציהן כשהצד הקדמי הנפוח יותר נוגע בפני המים בעוד שהאצבעות האחוריות המחודדיות יותר הרחק מפני המים(D). A- 10; P- אחורי <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61375/61375fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2.jpg"> איור 2: ציר הזמן ליצירת מוטציות C. quinquefasciatus על ידי מיקרו-נסיגה. ציר הזמן של הכנת מושבת C. quinquefasciatus ואיסוף עוברים למיקרו-ערך (A-D). ביצים שנאספו מופרדות לאחר מכן(E)מיושרות באותו כיוון ומכוסות בשמן הילוקרבון(F). הביצים מוזרקות לאחר מכן(G)ומותר להן לנוח לפחות 5 דקות לפני הסרת שמן ההילה(H). הביצים מועברות למקור מים נקי(I)לבקוע(J)ומוקרנות עבור פנוטיפים מוטנטיים (K). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">הישרדות</td>
			<td colspan="3">פסיפסיות סומטית (G0)</td>
			<td>מוטגניזיס נבטים (G1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>sgRNA</td>
			<td>#injected</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>סה"כ (%)</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>סה"כ (%)</td>
			<td>מוטציות G1 (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1</td>
			<td>50</td>
			<td>15</td>
			<td>20</td>
			<td>35(70)</td>
			<td>7(47)</td>
			<td>13(65)</td>
			<td>20(57)</td>
			<td>128(69)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-2</td>
			<td>50</td>
			<td>9</td>
			<td>32</td>
			<td>41(82)</td>
			<td>3(33)</td>
			<td>12(38)</td>
			<td>15(37)</td>
			<td>51(61)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>15</td>
			<td>32(64)</td>
			<td>7(41)</td>
			<td>8(53)</td>
			<td>15(47)</td>
			<td>157(72)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2</td>
			<td>50</td>
			<td>7</td>
			<td>16</td>
			<td>23(46)</td>
			<td>5(71)</td>
			<td>12(75)</td>
			<td>17(74)</td>
			<td>123(79)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>13</td>
			<td>9</td>
			<td>22(44)</td>
			<td>10(77)</td>
			<td>6(67)</td>
			<td>16(73)</td>
			<td>72(81)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>10</td>
			<td>27(54)</td>
			<td>13(76)</td>
			<td>8(80)</td>
			<td>21(78)</td>
			<td>101(85)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>11</td>
			<td>10</td>
			<td>21(42)</td>
			<td>9(82)</td>
			<td>9(90)</td>
			<td>18(86)</td>
			<td>149(86)</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: שיעורי הישרדות ומוטציה של עוברים מוזרקים עם gRNAs יחיד ומולטיפלקס מיקוד לבן. הטבלה מודפסת מחדש עם הרשאהמ- 30

Watch this Scientific Journal Video about Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus at JoVE.com

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

פרוטוקול זה מתאר הליכי מיקרו-אינצ'ק עבור עוברים Culex quinquefasciatus הממוטבים לעבודה עם כלי עריכת גנים CRISPR/Cas9. טכניקה זו יכולה ליצור ביעילות מוטציות ספציפיות לאתר, תורשתיות, נבטים שניתן להשתמש בהן לבניית טכנולוגיות גנטיות בווקטור המחלה המאופק הזה.

אמבריו מיקרו-סינתזה טכניקות עבור מוטגנזה יעילה ספציפית לאתר בקולקס quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

embryo-microinjection-techniques-for-efficient-site-specific

Research

JoVE Journal

Genetics

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

5.3K Views.  University of California, San Diego. פרוטוקול זה מתאר הליכי מיקרו-אינצ'ק עבור עוברים Culex quinquefasciatus הממוטבים לעבודה עם כלי עריכת גנים CRISPR/Cas9. טכניקה זו יכולה ליצור ביעילות מוטציות ספציפיות לאתר, תורשתיות, נבטים שניתן להשתמש בהן לבניית טכנולוגיות גנטיות בווקטור המחלה המאופק הזה.

Video: Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

לייזר בסיוע cytoplasmic Microinjection ב משק חי zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

משלוח חומצות גרעין דרך Microinjection העובר חרקי ההדברה החקלאיים ברחבי העולם,<em&gt; זבוב הפירות הים תיכוני</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, such as transcription, DNA replication, and DNA repair. HMGB1 binds to structurally distorted DNA with higher affinity than to canonical B-DNA. For example, we found that HMGB1 binds to DNA interstrand crosslinks (ICLs), which covalently link the two strands of the DNA, cause distortion of the helix, and if left unrepaired can cause cell death. Due to their cytotoxic potential, several ICL-inducing agents are currently used as chemotherapeutic agents in the clinic. While ICL-forming agents show preferences for certain base sequences (e.g., 5&#39;-TA-3&#39; is the preferred crosslinking site for psoralen), they largely induce DNA damage in an indiscriminate fashion. However, by covalently coupling the ICL-inducing agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO), which binds to DNA in a sequence-specific manner, targeted DNA damage can be achieved. Here, we use a TFO covalently conjugated on the 5&#39; end to a 4&#39;-hydroxymethyl-4,5&#39;,8-trimethylpsoralen (HMT) psoralen to generate a site-specific ICL on a mutation-reporter plasmid to use as a tool to study the architectural modification, processing, and repair of complex DNA lesions by HMGB1 in human cells. We describe experimental techniques to prepare TFO-directed ICLs on reporter plasmids, and to interrogate the association of HMGB1 with the TFO-directed ICLs in a cellular context using chromatin immunoprecipitation assays. In addition, we describe DNA supercoiling assays to assess specific architectural modification of the damaged DNA by measuring the amount of superhelical turns introduced on the psoralen-crosslinked plasmid by HMGB1. These techniques can be used to study the roles of other proteins involved in the processing and repair of TFO-directed ICLs or other targeted DNA damage in any cell line of interest.

Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.

כלים כדי ללמוד את התפקיד של HMGB1 חלבון אדריכלי בעיבוד בסילוף Helix, DNA ספציפיים באתר Interstrand Crosslinks

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

ממוקד<em&gt; באתרו</em&gt; גני mutagenesis של היסטון שמרים הנץ

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

העובר Microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve random mutagenesis, error-prone PCR is a convenient and efficient strategy for generating a diverse pool of mutants (i.e., a mutant library). Error-prone PCR is the method of choice when a researcher seeks to mutate a pre-defined region, such as the coding region of a gene while leaving other genomic regions unaffected. After the mutant library is amplified by error-prone PCR, it must be cloned into a suitable plasmid. The size of the library generated by error-prone PCR is constrained by the efficiency of the cloning step. However, in the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, the cloning step can be replaced by the use of a highly efficient one-step fusion PCR to generate constructs for transformation. Mutants of desired phenotypes may then be selected using appropriate reporters. Here, we describe this strategy in detail, taking as an example, a reporter inserted at centromeric heterochromatin.

This article describes a detailed methodology for random mutagenesis of a target gene in fission yeast. As an example, we target rpt4+, which encodes a subunit of the 19S proteasome, and screen for mutations that destabilize heterochromatin.

גן במיקוד אקראי מוטגנזה מכוונת לבחירת יציב הטרוכרומטין פרוטאוזום מוטציות שמרים ביקוע

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to visceral pathology. Deciphering the nature of the vector/parasite interactions is of primary importance for better understanding of Leishmania transmission to their hosts. Among the parameters controlling the sand fly vector competence (i.e. their ability to carry and transmit pathogens), parameters intrinsic to these insects were shown to play a key role. Insect immune response, for example, impacts sand fly vector competence to Leishmania. The study of such parameters has been limited by the lack of methods of gene expression modification adapted for use in these non-model organisms. Gene downregulation by small interfering RNA (siRNA) is possible, but in addition to being technically challenging, the silencing leads to only a partial loss of function, which cannot be transmitted from generation to generation. Targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 technology was recently adapted to the Phlebotomus papatasi sand fly. This technique leads to the generation of transmissible mutations in a specifically chosen locus, allowing to study the genes of interest. The CRISPR/Cas9 system relies on the induction of targeted double-strand DNA breaks, later repaired by either Non-Homologous End Joining (NHEJ) or by Homology Driven Repair (HDR). NHEJ consists of a simple closure of the break and frequently leads to small insertion/deletion events. In contrast, HDR uses the presence of a donor DNA molecule sharing homology with the target DNA as a template for repair. Here, we present a sand fly embryo microinjection method for targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 using NHEJ, which is the only genome modification technique adapted to sand fly vectors to date.

Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

This protocol details the steps of CRISPR/Cas9 targeted mutagenesis in sand flies: embryo collection, injection, insect rearing, and identification as well as selection of mutations of interest.

זבוב חול (פלבוטומוס פפטאסי) עובר מיקרו-אינג'קציה עבור CRISPR/Cas9 מוטגנזה

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

זריקות עובר למוטגנזה בתיווך קריספר במלח הנמלה הרפגנתוס

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA fragments encoding genes of interest as well as favorable traits into the insect germline in a stable and heritable manner. The resulting transgenic strains can be studied for phenotypic changes resulting from the expression of the integrated DNA to answer basic questions or used in practical applications. Although the technology is straightforward, it requires of the investigator patience and practice to achieve a level of skill that maximizes efficiency. Shown here is a method for microinjection of embryos of the African malaria mosquito, Anopheles gambiae. The objective is to deliver by microinjection exogenous DNA to the embryo so that it can be taken up in the developing germline (pole) cells. Expression from the injected DNA of transposases, integrases, recombinases, or other nucleases (for example CRISPR-associated proteins, Cas) can trigger events that lead to its covalent insertion into chromosomes. Transgenic An. gambiae generated from these technologies have been used for basic studies of immune system components, genes involved in blood-feeding, and elements of the olfactory system. In addition, these techniques have been used to produce An. gambiae strains with traits that may help control the transmission of malaria parasites.

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Microinjection techniques are essential to introduce exogenous genes into the genomes of mosquitoes. This protocol explains a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles gambiae embryos to generate transformed mosquitoes.

שיטת מיקרו-ג'ק-קציה לעוברי אנופלס גמביה

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA ...