Bu çalışma kısmen O.S.A.'ya yönlendirilen UCSD başlangıç fonları tarafından desteklenmiştir.

1. C. quinquefasciatus koloni yetiştirme
<ol><li>Böcek yurdu kafeslerinde C. quinquefasciatus yetişkinlerinin birden fazla kolonisi kurun. NOT: Koloniler Cornell Üniversitesi20'deDr. Laura Harrington tarafından sağlanmıştır. Culex sivrisineklerinin yetiştirilmesi için ayrıntılı protokoller diğer literatürde bulunabilir21.<ol>
<li>Sivrisinekleri 25 ± 1 °C'de% 30 nemde 12:12 saat gündüz:gece döngüsü ile koruyun.</li>
		<li>Kafese fitili olan bir şeker çözelti kabı sokarak veya pamuk toplarını şeker çözeltisi ile doyurarak ve kafesin içine yerleştirerek% 20 şeker çözeltisi reklam libitum sağlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sivrisineklerin kan beslemeden önce en az 3 gün çiftleşmelerine izin verin(Şekil 2A).</li>
</ol>2. C. quinquefasciatus blastoderm öncesi evre embriyoların toplanması
<ol><li>Eklozyondan 3-6 gün sonra, dişilere sentetik bir zardan 1-2 mL sitratlanmış sığır kan unu sağlayın ve bir kan besleme sisteminde yaklaşık 40 ° C'ye ısıtın (Şekil 2B). Culex sivrisinekleri için kullanılabilecek alternatif kan besleme protokolleri de vardır (örneğin, bkz.hakem 21). NOT: C. quinquefasciatus kuş kanı tercihi ile bilinir. Bazı laboratuvarlar kan yemek kaynakları21 , 22,23için uyuşturulmuş canlı kuşlar veya kuş kanı kullanır. Bununla birlikte, bu özellik birden fazla nesil için seçilirse, koloniler sığır kanı veya küçük kemirgenlerle beslenmek için eğitilebilir / seçilebilir.<ol>
<li>Kadınların kan beslemeden sonra en az 3 gün dinlenmesine izin verin, mikroenjeksiyon deneyleri için yumurtlamayı teşvik etmeden önce oogenez ve yumurta olgunlaşması geçirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Embriyonik mikroenjections gününde, organik olarak aşılanmış yumurtlama suyu ile bir yumurtlama kabı oluşturun. Yumurtlama suyu, tavşan dışkısı (50 g/L), ayrışan ot (4,5 g/L) veya balık yemi (25 g/L) fermente edilerek 5 veya daha fazla gün boyunca sudayapılmalıdır 24,25.</li>
	<li>Yumurtlama kabını kafese yerleştirin ve tüm kafesi karanlık bir yere yerleştirin (Şekil 2C).</li>
	<li>Her 30 dakikada bir, yumurta salları için fincanı kontrol edin.<ol>
<li>Yumurta salları varsa, salları bir boya fırçası ile kepçeleyarak toplayın ve ıslak bir filtre kağıdına yerleştirin (Şekil 2D,E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. C. quinquefasciatus blastoderm öncesi evre embriyolarının hizalanması
<ol><li>Yumurtaları salın üzerine bastırarak ve ince uçlu bir boya fırçası ve toskunluk kullanarak yumurtaları ayrı ayrı sataşarak sallardan ayırın (Şekil 2E).</li>
	<li>Tek tek yumurtaları, cam bir slaydın üstüne yerleştirilmiş ince bir çift taraflı yapışkan bant şeridine hizalayın (Şekil 2F).</li>
	<li>Hizalama yaparken, daha kolay erişilebilirlik için her yumurtanın ön tarafını aynı yöne yönlendirmeye çalışın. NOT: Çift taraflı yapışkan bant içermeyen alternatif bir yumurta hizalama yöntemi daha önce yayınlanan bir Nasonia vitripennis embriyo mikroenjeksiyonprotokolünde bulunabilir 26.</li>
	<li>Yumurtaları halokarbon yağ karışımı ile örtün. NOT: Halokarbon karışımı, iki halokarbon reaktifi ve suyu (9:1:20, halokarbon 700 : halokarbon 27 : Ultra saf su) hafifçe karıştırarak ve ardından halokarbon yağının su doygunluğunu kolaylaştırmak için karışımı gece boyunca 25οC'de inkübe ederek önceden hazırlanabilir.</li>
</ol>4. Mikroenjections için iğne hazırlama
<ol><li>Bir cam mikropipette puller kullanarak alümilikat kılcal cam iğneleri oluşturun.<ol>
<li>İğne çekmenin kullanım kılavuzundan alınan talimatlara göre, iğne çekme makinesine bir aluminosilikat kılcal cam yerleştirin. NOT: Kuvars ve borosilikat kılcal iğneler de kullanılabilir, ancak bu deney için alüminasilikat, nispeten uygun fiyatlılığı ve dayanıklılığı nedeniyle tercih edilir.</li>
		<li>Irdat'ı 516'ya, Hızı 100'e, Gecikmeyi 70'e, 97'ye ve Basıncı iğne çekeceğinde 500'e ayarlayın.</li>
		<li>Çekme talimatlarına göre iğne çekmeyi etkinleştirin ve ek iğneler için gerektiği gibi tekrarlayın. NOT: Enjeksiyon işlemi sırasında, iğneler genellikle tıkanır veya yanlışlıkla kırılır, bu nedenle tek bir deney için ek iğnelerin çekilmesi şiddetle tavsiye edilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dönen elmas aşındırıcı plaka üzerindeki çekilen iğnenin ucuna 50° açıyla yaklaşık 10 sn boyunca hafifçe dokunarak iğne ucunu eğimli yapın. NOT: İğneyi eğimli hale getirmek, sıvının akmasını sağlamak için açar ve aynı zamanda embriyoya daha kolay nüfuz etmek için daha keskin bir uç oluşturur. Uygun bir iğne örneği önceki bir makalede görülebilir26.</li>
	<li>Çekilen ve eğimli iğneleri petri kabına modelci kilinin çizgilerine gömerek saklayın. NOT: İğne uçları için en iyi kaliteyi sağlamak için iğneler enjeksiyon zamanına mümkün olduğunca yakın bir şekilde taze çekilmeli ve eğimlenmelidir.</li>
</ol>5. Enjeksiyon karışımının yüklenmesi
<ol><li>Genom modifikasyon reaktiflerinden (örneğin, 200 ng/μL sgRNA ve 200 ng/μL Cas9 karışımı) oluşan enjeksiyon karışımını veya tercih edilen enjeksiyon çözeltilerini hazırlayın ve buz üzerinde tutun. NOT: Bu karışım yumurtaların atılmasını beklerken hazırlanabilir. Cas9 ve sgRNA üretimi ve mikroenjeksiyon için hazırlık hakkında daha fazla ayrıntı önceki yayınlarda bulunabilir27,28,29,30.</li>
	<li>Bir mikro doldurucu ucu kullanarak enjeksiyon iğnesine 2 μL enjeksiyon karışımı yükleyin.</li>
</ol>6. Mikroenjeksiyon kurulumu
<ol><li>Doldurulmuş enjeksiyon iğnesini elektronik bir mikroenjektöre bağlı olarak kurulmuş bir mikromanipülatöre yerleştirin.</li>
	<li>Hizalanmış yumurtaları içeren cam slaydı bileşik bir mikroskop aşamasına yerleştirin.</li>
	<li>Mikromanipülatör ve bileşik mikroskobu kullanarak, iğneyi embriyonun arka ucuna 25-35 ° açıyla nişan almak için hizalayın.</li>
</ol>7. Embriyo mikroenjeksiyon (Şekil 2G)
<ol><li>İğneyi embriyoya dikkatlice yerleştirin ve karışımı embriyo hacminin yaklaşık% 10'u kadar bir miktara enjekte edin (yumurtaların büyüklüğüne bağlı olarak 700-800 pL). NOT: Enjekte ederken yumurta hafifçe şişmelidir, ancak çok fazla sıvı enjekte edilirse yumurta patlayabilir veya sitoplazmik sıvı dışarı sızabilir.</li>
	<li>Bir seferde yaklaşık 20 yumurta enjekte edin, ardından embriyo kurtarma prosedürlerini durdurun ve gerçekleştirin. NOT: Enjekte ederken, iğnelerin tıkanma veya kırılma olasılığı yüksektir. İğneden akan enjeksiyon sıvısı eksikliği ile belirlenebilecek bir tıkanıklık meydana gelirse, ya elektronik mikroenjektör üzerindeki temiz fonksiyonla iğneyi temizlemeyi deneyin ya da iğneyi yeniden beveling deneyin. Her iki adım da işe yaramazsa, hazırlanan yumurtaların nemlendirilmesini sağlarken hızla yeni bir iğneye geçin.</li>
</ol>8. Embriyo kurtarma ve kuluçkalama
<ol><li>Yumurtaları en az 5 dakika bozulmadan bırakın. Enjeksiyondan 20 dakika sonra, temiz bir boya fırçası ile hafifçe fırçalayarak halokarbon yağını dikkatlice çıkarın (Şekil 2H).</li>
	<li>Yumurtaları bir boya fırçası kullanarak hafifçe kaldırın ve bir fincan çift damıtılmış suya yerleştirin (Şekil 2I). Yumurtaları su yüzeyinde tutmaya özen edin.</li>
	<li>Yumurtaları kuluçka için günlük 7 gün boyunca kontrol edin (Şekil 2J).</li>
	<li>Normal larva yetiştirme prosedürlerini izleyin21.</li>
</ol>9. Genom modifikasyonu taraması
<ol><li>Enjekte edilen sivrisinekleri stereoskop kullanarak mutant fenotipler içintarayın ( Şekil 2K).<ol>
<li>Kolayca tanınabilir bir fenotipe sahip olmayan mutasyonları PCR amplifikasyonu, T7 Endonuclease I tahlil ve hedef bölgenin alt kavunlanmasıyla doğrulayın31.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikrop içindeki kalıtsal mutasyonları tespit etmek için enjekte edilen bireyler arasında ek haçlar kurun.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Final Cumulative Maps and Data | West Nile Virus. CDC Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight">https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight</a> (2019)</li><li>APHIS | West Nile Virus (WNV). USDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv">https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv</a> (2020)</li><li>Luke George, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+impacts+of+West+Nile+virus+on+North+American+bird+populations.">Persistent impacts of West Nile virus on North American bird populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), 14290-14294 (2015).</li><li>van Riper, C., van Riper, S. G., Lee Goff, M., Laird, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Epizootiology+and+Ecological+Significance+of+Malaria+in+Hawaiian+Land+Birds.">The Epizootiology and Ecological Significance of Malaria in Hawaiian Land Birds.</a> Ecological Monographs. 56 (4), 327-344 (1986).</li><li>Liao, W., Atkinson, C. T., LaPointe, D. A., Samuel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitigating+Future+Avian+Malaria+Threats+to+Hawaiian+Forest+Birds+from+Climate+Change.">Mitigating Future Avian Malaria Threats to Hawaiian Forest Birds from Climate Change.</a> PloS One. 12 (1), 0168880 (2017).</li><li>Martins, W. F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+insecticide+resistance+in+the+lymphatic+filariasis+vector+Culex+quinquefasciatus.">Transcriptomic analysis of insecticide resistance in the lymphatic filariasis vector Culex quinquefasciatus.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11406 (2019).</li><li>Norris, L. C., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insecticide+resistance+in+Culex+quinquefasciatus+mosquitoes+after+the+introduction+of+insecticide-treated+bed+nets+in+Macha,+Zambia.">Insecticide resistance in Culex quinquefasciatus mosquitoes after the introduction of insecticide-treated bed nets in Macha, Zambia.</a> Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 36 (2), 411-420 (2011).</li><li>Corbel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+insecticide+resistance+mechanisms+in+Anopheles+gambiae+and+Culex+quinquefasciatus+from+Benin,+West+Africa.">Multiple insecticide resistance mechanisms in Anopheles gambiae and Culex quinquefasciatus from Benin, West Africa.</a> Acta tropica. 101 (3), 207-216 (2007).</li><li>Yadoul&#233;ton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insecticide+resistance+status+in+Culex+quinquefasciatus+in+Benin.">Insecticide resistance status in Culex quinquefasciatus in Benin.</a> Parasites &amp; Vectors. 8, 17 (2015).</li><li>Atyame, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia-based+population+control+strategy+targeting+Culex+quinquefasciatus+mosquitoes+proves+efficient+under+semi-field+conditions.">Wolbachia-based population control strategy targeting Culex quinquefasciatus mosquitoes proves efficient under semi-field conditions.</a> PloS One. 10 (3), 0119288 (2015).</li><li>Atyame, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+incompatibility+as+a+means+of+controlling+Culex+pipiens+quinquefasciatus+mosquito+in+the+islands+of+the+south-western+Indian+Ocean.">Cytoplasmic incompatibility as a means of controlling Culex pipiens quinquefasciatus mosquito in the islands of the south-western Indian Ocean.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (12), 1440 (2011).</li><li>Almeida, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Wolbachia+on+fitness+of+Culex+quinquefasciatus+(Diptera;+Culicidae).">Effects of Wolbachia on fitness of Culex quinquefasciatus (Diptera; Culicidae).</a> Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 11 (8), 2138-2143 (2011).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+confinable+gene+drive+system+in+the+human+disease+vector+Aedes+aegypti.">Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti.</a> eLife. 9, 51701 (2020).</li><li>Phuc, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late-acting+dominant+lethal+genetic+systems+and+mosquito+control.">Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control.</a> BMC Biology. 5, 11 (2007).</li><li>Kyrou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas9+gene+drive+targeting+doublesex+causes+complete+population+suppression+in+caged+Anopheles+gambiae+mosquitoes.">A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).</li><li>Gantz, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+Cas9-mediated+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito+Anopheles+stephensi.">Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).</li><li>Buchman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+resistance+to+Zika+virus+in+transgenic+expressing+a+polycistronic+cluster+of+synthetic+small+RNAs.">Engineered resistance to Zika virus in transgenic expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).</li><li>Buchman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+dengue+neutralization+in+mosquitoes+expressing+an+engineered+antibody.">Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody.</a> PLoS Pathogens. 16 (1), 1008103 (2020).</li><li>Isaacs, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+resistance+to+Plasmodium+falciparum+development+in+transgenic+Anopheles+stephensi.">Engineered resistance to Plasmodium falciparum development in transgenic Anopheles stephensi.</a> PLoS Pathogens. 7 (4), 1002017 (2011).</li><li>Liu, N., Li, T., Reid, W. R., Yang, T., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Cytochrome+P450+genes:+their+constitutive+overexpression+and+permethrin+induction+in+insecticide+resistant+mosquitoes,+Culex+quinquefasciatus.">Multiple Cytochrome P450 genes: their constitutive overexpression and permethrin induction in insecticide resistant mosquitoes, Culex quinquefasciatus.</a> PloS One. 6 (8), 23403 (2011).</li><li>Kauffman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearing+of+Culex+spp.+and+Aedes+spp.+Mosquitoes.">Rearing of Culex spp. and Aedes spp. Mosquitoes.</a> Bio Protocols. 7 (17), 2542 (2017).</li><li>Richards, S. L., Anderson, S. L., Yost, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+blood+meal+source+on+the+reproduction+of+Culex+pipiens+quinquefasciatus+(Diptera:+Culicidae).">Effects of blood meal source on the reproduction of Culex pipiens quinquefasciatus (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 37 (1), 1 (2012).</li><li>Kitzmiller, J. B., Micks, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+Rearing+Culex+Mosquitoes.">Techniques for Rearing Culex Mosquitoes.</a> American Midland Naturalist. 52 (1), 253 (1954).</li><li>Mordue, A. J., Blackwell, A., Hansson, B. S., Wadhams, L. J., Pickett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+and+electrophysiological+evaluation+of+oviposition+attractants+for+Culex+quinquefasciatus+say+(Diptera:+Culicidae).">Behavioural and electrophysiological evaluation of oviposition attractants for Culex quinquefasciatus say (Diptera: Culicidae).</a> Experientia. 48 (11-12), 1109-1111 (1992).</li><li>Allgood, D. W., Yee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oviposition+preference+and+offspring+performance+in+container+breeding+mosquitoes:+evaluating+the+effects+of+organic+compounds+and+laboratory+colonisation.">Oviposition preference and offspring performance in container breeding mosquitoes: evaluating the effects of organic compounds and laboratory colonisation.</a> Ecological Entomology. 42 (4), 506-516 (2017).</li><li>Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+Microinjection+and+Transplantation+Technique+for+Nasonia+vitripennis+Genome+Manipulation.">Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56990 (2017).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+jewel+wasp+Nasonia+vitripennis+using+CRISPR/Cas9.">Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-7 (2017).</li><li>Li, M., Akbari, O. S., White, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient+Site-Specific+Mutagenesis+in+Malaria+Mosquitoes+Using+CRISPR.">Highly Efficient Site-Specific Mutagenesis in Malaria Mosquitoes Using CRISPR.</a> Genes, Genomes, Genetics. 8 (2), 653-658 (2018).</li><li>Li, M., Bui, M., Yang, T., White, B. J., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+Cas9+Expression+Yields+Highly+Efficient+Genome+Engineering+in+a+Major+Worldwide+Disease+Vector,+Aedes+aegypti.">Germline Cas9 Expression Yields Highly Efficient Genome Engineering in a Major Worldwide Disease Vector, Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (49), 10540-10549 (2017).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+disease+vector+Culex+quinquefasciatus+using+clustered+regularly+interspaced+short+palindrome+repeats-associated+protein+9.">Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9.</a> Insect Molecular Biology. 29 (2), 214-220 (2020).</li><li>New England Biolabs Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclease I. NEB Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i">https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i</a> (2020)</li></ol>

Sivrisinek vektör kontrolü için genetik olarak tasarlanmış araçlar üretme çabalarıyla, yaygın sivrisinek hastalığı vektörleri için embriyo mikroenjeksiyon protokolleri geliştirmeye ve optimize etmeye ihtiyaç vardır. Aedes ve Anopheles sivrisinekleri için yöntemler geliştirilmiş olsa da, Culex için özel olarak tasarlanmış bir protokol minimal olarak araştırıldı. Genel olarak sivrisinek embriyo enjeksiyon protokolleri 3 genel adıma ayrılabilir: 1) embriyo toplama ve hazırlama, 2) embriyo enjeksiyonu ve 3) enjeksiyon sonrası iyileşme. Mutantların başarılı bir şekilde üretilebilmesi için, üç adımın da hedef türler için optimize edilmesi gerekir. Embriyo mikroenjeksiyon için bu değiştirilmiş protokol, Culex sivrisineklerinin başarılı genom mühendisliği için özeldir.
Embriyo toplamayı en üst düzeye çıkarmak embriyo mikroenjeksiyon protokollerinde yaygın bir darboğazdır. Kısa sürede toplanan yumurta sayısını artırmak için, sivrisinekler kan unu sonrası 2-3 gün boyunca bir yumurtlama substratından kısıtlandı. C. quinquefasciatus'un memeli kaynaklarının veya memeli kanıyla beslenen membranların aksine kuş kan kaynaklarını tercih etme eğiliminde olduğunu belirtmek önemlidir. Bununla birlikte, birçok araştırmacı kan beslemek için güvenilir bir canlı kuş veya kuş kanı kaynağı elde etmekte zorlanabilir, bu nedenle laboratuvar stokları daha erişilebilir kan kaynaklarıyla beslenmek için uyarlanabilir. C. quinquefasciatus ve diğer çoğu Culex vektörü için yumurtlama ipuçları sağladığından, yumurtlama substratı için besin bakımından zengin su kullanmak da çok önemlidir. Mikroenjeksiyon için uygun sayıda yumurtanın mevcut olduğundan emin olmak için laboratuvarlar arasında optimize edilmesi gerekebilecek besin bakımından zengin su üretmek için birçok yöntem vardır. Örneğin, bu yöntem 5 veya daha fazla gün boyunca deiyonize suda fermente edilen tavşan dışkısı ile en başarılı olsa da, diğer araştırmacılar besin kaynağı olarak ot veya balık yemi ve hatta bazıları damıtılmış su ile daha fazla başarıya sahiptir21.
Culex sivrisinekleri sallara yumurta grupları bıraktığından, yumurta toplamak oldukça basittir. Yumurtalar, tüm salı bir boya fırçasıyla kepçeleyarak basitçe toplanabilir. Yumurta ayrımı daha karmaşıktır, ancak başarılı enjeksiyon için gereklidir. Yumurtalar, boya fırçası veya toskun ile yumurtalar arasında hafif aşağı doğru basınç uygulanarak saldan dikkatlice ayrılabilir. Bazı uygulamalarla, birden fazla kullanıcı tek yumurtaları yumurta sallarından güvenilir bir şekilde ayırabildi. Her yumurtayı ayırdıktan sonra, yumurtalar mikroenjeksiyon sırasında yumurtaları stabilize eden çift taraflı yapışkan bantta aynı yönde hizalanır. Yumurtalar konik arka uca enjekte edilir ve halokarbon yağının eklenmesi, manipülasyon sırasında yumurtaları nemli tutar.
Mikroenjeksiyon sırasında embriyo hasarını sınırlamak için enjeksiyon iğnelerinin uygun mukavemete sahip olması ve uygun bir açıyla eğimli olması gerekir. 50° açıyla 10 saniye boyunca eğimli alümilikat iğneler en iyi sonuçlara sahipti, ancak borosilikat ve kuvars iğneler daha az dayanıklı ve daha pahalı olsalar da da çalışabilir. Ek olarak, uygun iğne eğimi Cas9 ve sgRNA karışımlarının daha iyi akışını kolaylaştırır ve embriyoya daha kolay nüfuz etmek için daha keskin bir nokta oluşturur. Çoğu durumda, eğim, tıkanmış iğneleri değiştirmek için zaman ve çaba harcamak yerine tıkanmış iğneleri hızlı bir şekilde düzeltmenin etkili bir yoludur.
Enjeksiyondan sonra, yumurtalar en az 5 dakika bozulmadan kalmalı ve halokarbon yağı hemen ardından temiz bir boya fırçası ile hafifçe fırçalanarak çıkarılmalıdır. Halokarbon yağının çıkarılmasından sonra, enjekte edilen yumurtalar, tipik olarak enjeksiyondan sonraki 3 gün içinde meydana gelen yumurtadan çıkmak için suya yerlenebilir. Pratik ve yeterli sayıda yumurta ile, bu protokol C. quinquefasciatus'ta tutarlı somatik ve germline mutasyonları elde edebilir ve diğer Culex sivrisineklerine kolayca adapte olması gereken kadar çok yönlüdür.

C. quinquefasciatus, genellikle güney evi sivrisinek olarak bilinen, Batı Nil virüsü (WNV), Japon ensefalit, Saint Louis ensefaliti ve Doğu at ensefaliti dahil olmak üzere çok sayıda patojenin yetkin bir vektörüdür. Özellikle, 1999'da New York'ta ilk kez tespit edildiğinden beri, WNV, 1999 ve 2018 yılları arasında yaklaşık 2.300 ölümle sonuçlanan 50.000'den fazla insan vakası ve 2008-2019 yılları arasında bildirilen 4.500'den fazla at vakası ile kıta Amerika Birleşik Devletleri (ABD) genelinde önemli bir vektör kaynaklı hastalık halinegelmiştir. Buna ek olarak, Kuzey Amerika'da bulunan en az 23 kuş türü, WNV3'ünbir sonucu olarak kurtarılamaz olarak sınıflandırılan en az 12 tür ile WNV enfeksiyonlarından etkilenmiştir. WNV'nin insan, at ve kuş popülasyonları üzerindeki etkisi, vektörlerinin fırsatçı beslenme davranışından kaynaklanmaktadır. Tipik olarak, kuşlar WNV için birincil konaktır ve insanlar ve atlar tesadüfi veya çıkmaz konaklardır. C. quinquefasciatus tarafından vektörlenen bazı patojenler sadece kuş sıtma paraziti, Plasmodium relictumgibi kuşları enfekte eder. Hawaii'de, C. quinquefasciatus kuş sıtmasının ana vektörüdür ve birçok yerli kuş türünün neslinin tükenmesine neden olmuştur4,5.
C. quinquefasciatustarafından bulaşan hastalıkları kontrol etmek için, araştırmacılar ve vektör kontrol ajansları insektisit uygulaması6gibi yaygın olarak kurulmuş sivrisinek popülasyon kontrol araçlarını kullanmıştır , ancak, bu yöntemler türlere özgü değildir ve birçok C. quinquefasciatus popülasyonunda insektisitlere karşı direnç yüksek olduğu için sınırlıetkilidir. Wolbachiatabanlı nüfus kontrol stratejileri gibi diğer kontrol teknikleri son yıllardageliştirilmiştir 10,11, ancak Wolbachia enfeksiyonu ile ilişkili fitness maliyetleri bu vektör için bu yaklaşımın fizibilitesini sınırlamak12. Aedes aegypti13 , 14, Anopheles gambiae15 ve Anopheles stephensi16gibi diğer sivrisinek türlerinde geliştirilen genetik tabanlı kontrol yöntemleri de vardır , patojene dirençli sivrisineklerin geliştirilmesi de dahil olmak üzere17,18,19, gerekli genom mühendisliği araçları ise C. quinquefasciatus için de geliştirilebilir bu tür için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, C. quinquefasciatus biyolojisi, bu vektörde benzer genetik teknolojilerin geliştirilmesini zorlaştıran diğer Aedes ve Anopheles sivrisinek vektörlerinden büyük ölçüde farklıdır. CRISPR tabanlı genom mühendisliği teknolojilerinin ortaya çıkmasıyla, hassas genom mühendisliği giderek daha önemsiz, uygun fiyatlı ve uyarlanabilir hale geldi ve sonuç olarak çok çeşitli türlerde yeni genetik araçların geliştirilmesine yol açtı.
CRISPR tabanlı teknolojilerle mutasyonlar üretmek için, istenen lociyi tamamlayan Cas9 proteini ve sentetik kılavuz RNA (sgRNA) karışımı, blastoderm öncesi evre embriyolara mikroenjakt edilir. C. quinquefasciatus dişileri yumurtalarını yüzen bir sal yapısına bağlı gruplar halinde bıraktıklarından (Şekil 1), Aedes ve Anopheles sivrisineklerinin bir özelliği olan ovipositing bireysel yumurtaların aksine, embriyo mikroenjections bu türlerde giderek daha karmaşık hale gelir. Culex larvaları da su yüzeyi ile temas halinde olan her yumurtanın ön tarafından ortaya çıkar (Şekil 1), bu nedenle yumurta yönelim sonrası manipülasyon bu türlerde önemlidir. Burada Cas9 proteini ve sgRNA'nın C. quinquefasciatus embriyolarına mikroenjeksiyonu için tasarlanmış ayrıntılı bir protokolü açıklıyoruz. Bu protokol, zamanında yumurta toplama ve yumurta hayatta kalma için anahtar olan belirli adımlarla embriyo sağkalım ve genom mutasyon oranlarını iyileştirmek için Culex biyolojisine özgü özellikleri barındıracak şekilde tasarlanmıştır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>9 oz clear plastic pet cup</td>
			<td>Karat</td>
			<td>C-KC9</td>
			<td>Insect Rearing and Egg Collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>Microinjection, borosilicate and quartz needles could also be used but we prefered aluminosilicate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood</td>
			<td>Colorado Serum Company</td>
			<td>31025</td>
			<td>The colony took multiple generations to adapt to this blood source. Other blood sources are likely just as appropriate. See protocol notes on blood source selection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bugdorm</td>
			<td>Bugdorm</td>
			<td>4F2222</td>
			<td>Insect Rearing Cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 Protein with NLS</td>
			<td>PNABio</td>
			<td>CP01</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound Microscope</td>
			<td>Olympus BX41</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection, for embryo injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>104E</td>
			<td>Microinjection, to be used with beveler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase/RNase-Free distilled Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>B084NVQGXD</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet 4x or 4i programmable microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotips Microloader tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Microinjection, embryo collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tip paintbrush</td>
			<td>ZEM</td>
			<td>2595</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8773</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemotek</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>PS5</td>
			<td>Line Maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Beveler</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BV10</td>
			<td>Microinjection, needle beveling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000 or P-2000</td>
			<td>Microinjection, needle pulling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Drying Modeling Clay</td>
			<td>Jovi</td>
			<td>B0025Z71IM</td>
			<td>Microinjection, needle storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td>Microinjection, for embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugar</td>
			<td>Domino</td>
			<td></td>
			<td>20% sugar solution for adult sugar source.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0302</td>
			<td>Preparation of microinjection materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>K451020</td>
			<td>Preparation of microinjection materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-fine tip forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-121</td>
			<td>Microinjection, embryo alignment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embryo microinjection techniques for efficient site-specific mutagenesis in culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus, kuş sıtması, Batı Nil virüsü (WNV), Japon ensefalit, Doğu at ensefaliti, lenfatik filariasis ve Saint Louis ensefaliti gibi çeşitli vektör kaynaklı hastalıkların vektörüdür. Özellikle, kuş sıtması çok sayıda endemik ada kuşu türünün neslinin tükenmesinde önemli bir rol oynarken, WNV Amerika Birleşik Devletleri'nde önemli bir vektör kaynaklı hastalık haline gelmiştir. C. quinquefasciatus biyolojisi hakkında daha fazla bilgi edinmek ve genetik kontrol araç kutularını genişletmek için, bu türdeki genom mühendisliği için daha verimli ve uygun fiyatlı yöntemler geliştirmemiz gerekir. Bununla birlikte, Culex sivrisineklerine özgü bazı biyolojik özellikler, özellikle yumurta salları, genom mühendisliği için gerekli mikroenjeksiyon işlemlerinin yapılmasını zorlaştırmıştır. Bu zorlukları ele almak için, Culex sivrisineklerinin benzersiz özellikleriyle ilişkili teknik engelleri azaltmaya odaklanan optimize edilmiş bir embriyo mikroenjeksiyon protokolü geliştirdik. Bu prosedürler, C. quinquefasciatus'ta başarılı mikroenjeksiyon için gerekli olan yumurta toplama, yumurta salı ayırma ve diğer elleçleme prosedürleri için optimize edilmiş yöntemleri göstermektedir. CRISPR/Cas9 genom düzenleme teknolojisi ile birleştiğinde, bu prosedürler, bu önemli, ancak şu anda yetersiz olan hastalık vektöründe gelişmiş genom mühendisliği yapmak ve genetik kontrol teknolojileri geliştirmek için gerekli olan bölgeye özgü, verimli ve kalıtsal germline mutasyonları elde etmemizi sağlar.

Daha önce yayınlanan deneylerde bu yöntem, koyu göz pigmentasyonunun gelişimi için kritik olan bir genin somatik ve germline mutasyonlarını başarıyla üretmek için kullanılmıştır, beyaz (CPIJ005542)30 (Tablo 1). CRISPR/Cas9 tarafından üretilen somatik mutasyonlar, enjekte edilen bireylerin pupal evre gözlerinde pigmentasyon kaybı taraması ile puanlandı (G0). Somatik mutasyonlar genellikle bazı hücrelerin mutant fenotipe sahip olduğu mozaik fenotipler olarak mevcuttu. Örneğin, beyaz genin somatik mutasyonları, pigmentasyondan yoksun fenotipler ve vahşi tip pigmentli fenotip30ile ommatidia karışımı ile sonuçlandı. Bununla birlikte, beyaz genin germline mutasyonu olduğunda, yeni nesil (G1)tam beyaz gözlü fenotipi miras haline geldi. Germline mutasyon oranları mozaik G0 bireyleri arasında geçiş yaparak ve tamamen beyaz gözlü yavrular için puanlama ile belirlendi (G1). Bu deneyler% 64 ila% 82 embriyo sağkalım oranının yanı sıra% 37 ila% 57 somatik mutajensis oranı ve% > 61 germline mutajensis oranı (Tablo 1)ile sonuçlandı. Aynı gendeki birden fazla lociyi hedeflemek için sgRNA'ları çoklayıcı yaparak, somatik ve germline mutajensis oranları yukarı doğru% 86'ya kadar yükseldi(Tablo 1). Ek olarak, birçok nesil boyunca, beyaz mutantların canlı homozigöz stokları laboratuvarda başarıyla tutulmuştur.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig01.jpg"> Şekil 1: C. quinquefasciatus yumurta salı ve tek yumurta morfolojisi. Dorsal (A), lateral (B) ve ventral (C) C quinquefasciatus yumurta sallarının manzarası. C. quinquefasciatus dişileri yumurtalarını daha soğanlı ön tarafı su yüzeyine dokunurken, daha sivri arka su yüzeyinden(D)uzağa bırakırlar. A- ön; P- posterior <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61375/61375fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2.jpg"> Şekil 2: Mikroenjeksiyon ile C. quinquefasciatus mutantları oluşturmak için zaman çizelgesi. Mikroenjeksiyon için C. quinquefasciatus kolonisi hazırlama ve embriyo toplama zaman çizelgesi (A-D). Toplanan yumurtalar daha sonra aynı yönde hizalanır ve halokarbon yağı (F)ile kaplanır . Yumurtalar daha sonra enjekte edilir (G) ve halokarbon yağını(H)çıkarmadan önce en az 5 dakika dinlenmesine izin verilir. Yumurtalar daha sonra kuluçka (J) için temiz bir su kaynağına (I) aktarılır ve mutant fenotipler (K) için taranır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">Beka</td>
			<td colspan="3">Somatik mozaikçilik (G0)</td>
			<td>Germline mutajensis (G1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>sgRNA</td>
			<td>#injected</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>Toplam (%)</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>Toplam (%)</td>
			<td>G1 mutantlar (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1</td>
			<td>50</td>
			<td>15</td>
			<td>20</td>
			<td>35(70)</td>
			<td>7(47)</td>
			<td>13(65)</td>
			<td>20(57)</td>
			<td>128(69)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-2</td>
			<td>50</td>
			<td>9</td>
			<td>32</td>
			<td>41(82)</td>
			<td>3(33)</td>
			<td>12(38)</td>
			<td>15(37)</td>
			<td>51(61)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>15</td>
			<td>32(64)</td>
			<td>7(41)</td>
			<td>8(53)</td>
			<td>15(47)</td>
			<td>157(72)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2</td>
			<td>50</td>
			<td>7</td>
			<td>16</td>
			<td>23(46)</td>
			<td>5(71)</td>
			<td>12(75)</td>
			<td>17(74)</td>
			<td>123(79)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>13</td>
			<td>9</td>
			<td>22(44)</td>
			<td>10(77)</td>
			<td>6(67)</td>
			<td>16(73)</td>
			<td>72(81)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>10</td>
			<td>27(54)</td>
			<td>13(76)</td>
			<td>8(80)</td>
			<td>21(78)</td>
			<td>101(85)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>11</td>
			<td>10</td>
			<td>21(42)</td>
			<td>9(82)</td>
			<td>9(90)</td>
			<td>18(86)</td>
			<td>149(86)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Beyazı hedefleyen tek ve çoklamalı gRNA'larla enjekte edilen embriyoların sağkalım ve mutasyon oranları. Tablo30'dan izin atılmış olarak yeniden yazdırılır

Watch this Scientific Journal Video about Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus at JoVE.com

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Bu protokol, CRISPR/Cas9 gen düzenleme araçlarıyla çalışmak üzere optimize edilmiş Culex quinquefasciatus embriyoları için mikroenjeksiyon prosedürlerini açıklar. Bu teknik, bu yetersiz hastalık vektörde genetik teknolojiler oluşturmak için kullanılabilecek bölgeye özgü, kalıtsal, germline mutasyonlarını verimli bir şekilde üretebilir.

Culex quinquefasciatus'ta Verimli Bölgeye Özgü Mutagenezi için Embriyo Mikroenjeksiyon Teknikleri

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

embryo-microinjection-techniques-for-efficient-site-specific

Research

JoVE Journal

Genetics

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

5.3K Görüntüleme.  University of California, San Diego. Bu protokol, CRISPR/Cas9 gen düzenleme araçlarıyla çalışmak üzere optimize edilmiş Culex quinquefasciatus embriyoları için mikroenjeksiyon prosedürlerini açıklar. Bu teknik, bu yetersiz hastalık vektörde genetik teknolojiler oluşturmak için kullanılabilecek bölgeye özgü, kalıtsal, germline mutasyonlarını verimli bir şekilde üretebilir.

Video: Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Lazer destekli Hayvancılık Zigotlann Sitoplazmik Mikroenjeksiyon

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Genetik

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi,<em&gt; Ceratitis capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, such as transcription, DNA replication, and DNA repair. HMGB1 binds to structurally distorted DNA with higher affinity than to canonical B-DNA. For example, we found that HMGB1 binds to DNA interstrand crosslinks (ICLs), which covalently link the two strands of the DNA, cause distortion of the helix, and if left unrepaired can cause cell death. Due to their cytotoxic potential, several ICL-inducing agents are currently used as chemotherapeutic agents in the clinic. While ICL-forming agents show preferences for certain base sequences (e.g., 5&#39;-TA-3&#39; is the preferred crosslinking site for psoralen), they largely induce DNA damage in an indiscriminate fashion. However, by covalently coupling the ICL-inducing agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO), which binds to DNA in a sequence-specific manner, targeted DNA damage can be achieved. Here, we use a TFO covalently conjugated on the 5&#39; end to a 4&#39;-hydroxymethyl-4,5&#39;,8-trimethylpsoralen (HMT) psoralen to generate a site-specific ICL on a mutation-reporter plasmid to use as a tool to study the architectural modification, processing, and repair of complex DNA lesions by HMGB1 in human cells. We describe experimental techniques to prepare TFO-directed ICLs on reporter plasmids, and to interrogate the association of HMGB1 with the TFO-directed ICLs in a cellular context using chromatin immunoprecipitation assays. In addition, we describe DNA supercoiling assays to assess specific architectural modification of the damaged DNA by measuring the amount of superhelical turns introduced on the psoralen-crosslinked plasmid by HMGB1. These techniques can be used to study the roles of other proteins involved in the processing and repair of TFO-directed ICLs or other targeted DNA damage in any cell line of interest.

Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.

Araçlar Helix bozan, site-spesifik DNA içi çapraz bağlantılar işlenmesi Mimari Protein HMGB1 Rolü Eğitim için

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Histon-miniSOG Kullanılan optogenetic rastgele mutagenez<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

Hedeflenen<em&gt; In situ</emBudding Maya&gt; Mutajenezis Histon ve Genler

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Embriyo mikroenjeksiyon ve Nasonia vitripennis genom manipülasyon için transplantasyonu tekniği

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve random mutagenesis, error-prone PCR is a convenient and efficient strategy for generating a diverse pool of mutants (i.e., a mutant library). Error-prone PCR is the method of choice when a researcher seeks to mutate a pre-defined region, such as the coding region of a gene while leaving other genomic regions unaffected. After the mutant library is amplified by error-prone PCR, it must be cloned into a suitable plasmid. The size of the library generated by error-prone PCR is constrained by the efficiency of the cloning step. However, in the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, the cloning step can be replaced by the use of a highly efficient one-step fusion PCR to generate constructs for transformation. Mutants of desired phenotypes may then be selected using appropriate reporters. Here, we describe this strategy in detail, taking as an example, a reporter inserted at centromeric heterochromatin.

This article describes a detailed methodology for random mutagenesis of a target gene in fission yeast. As an example, we target rpt4+, which encodes a subunit of the 19S proteasome, and screen for mutations that destabilize heterochromatin.

Fisyon mayası Heterochromatin kararsız hale Proteasome mutantlar seçmek için rasgele Mutagenesis Gene hedefli

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to visceral pathology. Deciphering the nature of the vector/parasite interactions is of primary importance for better understanding of Leishmania transmission to their hosts. Among the parameters controlling the sand fly vector competence (i.e. their ability to carry and transmit pathogens), parameters intrinsic to these insects were shown to play a key role. Insect immune response, for example, impacts sand fly vector competence to Leishmania. The study of such parameters has been limited by the lack of methods of gene expression modification adapted for use in these non-model organisms. Gene downregulation by small interfering RNA (siRNA) is possible, but in addition to being technically challenging, the silencing leads to only a partial loss of function, which cannot be transmitted from generation to generation. Targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 technology was recently adapted to the Phlebotomus papatasi sand fly. This technique leads to the generation of transmissible mutations in a specifically chosen locus, allowing to study the genes of interest. The CRISPR/Cas9 system relies on the induction of targeted double-strand DNA breaks, later repaired by either Non-Homologous End Joining (NHEJ) or by Homology Driven Repair (HDR). NHEJ consists of a simple closure of the break and frequently leads to small insertion/deletion events. In contrast, HDR uses the presence of a donor DNA molecule sharing homology with the target DNA as a template for repair. Here, we present a sand fly embryo microinjection method for targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 using NHEJ, which is the only genome modification technique adapted to sand fly vectors to date.

Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

This protocol details the steps of CRISPR/Cas9 targeted mutagenesis in sand flies: embryo collection, injection, insect rearing, and identification as well as selection of mutations of interest.

CRISPR/Cas9 Mutagenesis için Kum Sineği (Phlebotomus papatasi) Embriyo Mikroenjeksiyonu

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

Karınca Harpegnathos tuzlayıcısında CRISPR Aracılı Mutagenez için Embriyo Enjeksiyonları

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA fragments encoding genes of interest as well as favorable traits into the insect germline in a stable and heritable manner. The resulting transgenic strains can be studied for phenotypic changes resulting from the expression of the integrated DNA to answer basic questions or used in practical applications. Although the technology is straightforward, it requires of the investigator patience and practice to achieve a level of skill that maximizes efficiency. Shown here is a method for microinjection of embryos of the African malaria mosquito, Anopheles gambiae. The objective is to deliver by microinjection exogenous DNA to the embryo so that it can be taken up in the developing germline (pole) cells. Expression from the injected DNA of transposases, integrases, recombinases, or other nucleases (for example CRISPR-associated proteins, Cas) can trigger events that lead to its covalent insertion into chromosomes. Transgenic An. gambiae generated from these technologies have been used for basic studies of immune system components, genes involved in blood-feeding, and elements of the olfactory system. In addition, these techniques have been used to produce An. gambiae strains with traits that may help control the transmission of malaria parasites.

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Microinjection techniques are essential to introduce exogenous genes into the genomes of mosquitoes. This protocol explains a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles gambiae embryos to generate transformed mosquitoes.

Anopheles gambiae Embriyoları için Mikroenjeksiyon Yöntemi

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA ...