L’étude a été financée par les numéros de subvention : NCI P30 CA023108 et NCI U54 CA151662.

Le programme de soin et d’utilisation des animaux du Collège Dartmouth est accrédité par l’American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care (iAAALAC) et adhère à toutes les lignes directrices et réglementations de l’UDSA et du NIH (Office of Laboratory Animal Welfare). Toutes les études in vivo ont été approuvées par le Dartmouth College Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). La procédure d’euthanasie est conforme aux directives 2020 de l’AVMA pour l’euthanasie des animaux.
1. Instrumentation/conception du système
<ol><li>Concevez une antenne AMF personnalisée (bobine) pour être une boucle fermée, en choisissant des formes pour créer le champ magnétique souhaité. Utilisez les formules d’inductance et les caractéristiques du choix du générateur de puissance pour concevoir des bobines compatibles afin de générer le champ souhaité. Utilisez différents modèles pour les expériences in vitro et in vivo.</li>
	<li>Assurez-vous que l’inductance de l’antenne AMF se situe dans la plage acceptable du groupe électrogène. Ajoutez ou soustrayez des condensateurs pour faire correspondre (accorder) l’antenne au générateur de puissance.</li>
	<li>Pour les expériences in vitro, concevoir une bobine hélicoïdale à 14 tours, diamètre intérieur 2 cm et longueur 14 cm, pouvant contenir des tubes de 1,5 mL, permettant le traitement simultané de plusieurs échantillons. Isolez la bobine avec un polymère vinylique et utilisez un espaceur en polystyrène pour séparer la bobine des tubes. Les détails des spécifications de conception et des considérations sont présents dans le dossier supplémentaire 1.</li>
	<li>Pour les expériences in vivo, acquérir une bobine hélicoïdale du corps entier construite sur mesure auprès d’un fabricant disposant d’informations de conception exclusives. Utilisez un tube carré de 8 mm (car il crée un champ plus uniforme dans l’alésage de la bobine) et un concentrateur dans la zone de traitement ciblée. Faites le concentrateur de 5,0 cm de long, avec un total de 5 tours résultant en un diamètre intérieur de 3,6 cm, 5,2 cm de diamètre extérieur, et ayez son emplacement dans la zone de traitement ciblée. Entourez la bobine d’une coque en polycarbonate.</li>
	<li>Utilisez une génératrice AMF avec puissance et fréquence réglables, évaluée à 10 kW ou plus comme source d’alimentation. L’inductance correspond à la source d’alimentation et aux antennes/bobines dans une plage de 0,62 à 1,18 μHenries (μH), ce qui permet des fréquences comprises entre 30 et 300 kHz. Refroidir le générateur en utilisant de l’eau recyclée grâce à une pompe de gavage centrifuge, pression régulée à 50 psi.</li>
	<li>Refroidissez les serpentins avec un refroidisseur de capacité de refroidissement de 5,6 tonnes qui pompe un fluide caloporteur à base d’éthylène glycol à 25 % dilué avec de l’eau à travers l’antenne AMF. Réglez la température du refroidisseur de manière à ce que l’antenne ne chauffe ni ne refroidisse l’échantillon.</li>
	<li>Pour le confinement des animaux, construire un support tubulaire qui peut être suspendu au centre de la bobine avec un espace d’air de 0,5 cm entre le support et la surface de la bobine. Connectez une pompe à air climatisée réglable qui fait circuler l’air à travers la coque autour de la bobine et réglez-la pour maintenir une température centrale normale chez l’animal. Connectez l’appareil d’anesthésie au porte-animal tubulaire près de la tête de l’animal pour assurer une bonne administration de l’anesthésie.</li>
	<li>Pour le confinement des cellules, créez un appareil qui fait circuler l’eau d’un bain-marie à travers l’espaceur où les tubes sont placés. Réglez la température de ce bain-marie de telle sorte que les tubes soient entourés d’eau à 37 °C.</li>
	<li>Utilisez des sondes à fibres optiques pour surveiller les températures dans la tumeur, le noyau de l’animal et l’environnement animal ou pour des études in vitro, la surveillance de la température de la pastille cellulaire et de l’eau entourant les tubes.</li>
	<li>Utilisez des nanoparticules magnétiques d’oxyde de fer d’une taille de 100 nm pour toutes les expériences. NOTE: La concentration et le débit d’absorption spécifique (DAS) sont deux caractéristiques qui doivent être prises en compte lors du choix des nanoparticules, car elles affectent directement la dose de chauffage et thermique possible18.</li>
</ol>2. Hyperthermie in vitro
<ol><li>Culture de cellules de mélanome murin B16F10 dans un milieu RPMI avec 10% FBS et 1% Pen/streptocoque. Plaque 150 000 cellules/puits dans des plaques à 6 puits, avec 2 mL de milieu complet.</li>
	<li>Déterminer le traitement approprié pour chaque puits, c.-à-d. cellules sans NP et sans CMA, cellules sans NPm et sans CMA, cellules sans NPm et CMA, cellules sans NPm et CMA. REMARQUE: De plus, assurez-vous qu’il existe des contrôles appropriés si vous combinez l’hyperthermie avec un autre traitement. L’AMF est réalisée dans un laboratoire de banc de recherche standard équipé des capacités d’alimentation et de refroidissement nécessaires.</li>
	<li>24 h après le placage, ajouter les NP aux puits appropriés, comme déterminé à l’étape précédente. Ajouter des mNPs à une concentration de 3 mg de fer/mL. S’assurer que les mNP sont répartis dans tout le puits, soit en créant une solution stock/mNP (retrait des anciens milieux, ajout de cette solution), soit en ajoutant les mNP directement et en faisant doucement tourbillonner les plaques pour une distribution homogène.</li>
	<li>Commencer le traitement, 48 h après l’ajout de mNPs, lorsque les puits sont ~80% confluents, en retirant le média et en lavant les puits avec du fluide frais. Retirez le support.</li>
	<li>Ajouter 0,5 mL de trypsine à chaque puits traité et agiter doucement. Utilisez un microscope pour vérifier que les cellules sont détachées.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de média à chaque puits pour recueillir les cellules dans des tubes de 1,5 mL. Recueillir toutes les cellules du puits (~1 x 106 cellules). Utilisez un tube séparé clairement étiqueté pour chaque puits.</li>
	<li>Faire tourner les tubes à 60 x g pendant 2-3 min pour permettre aux cellules de s’enrober. Conservez la pastille dans le média.</li>
	<li>Placez les tubes dans l’intercalaire remplis d’eau à l’intérieur de la bobine. Régler la température du bain-marie de telle sorte que le média et la pastille de la cellule soient maintenus à 37 °C. Surveillez la température dans le tube et le bain-marie à l’aide de sondes de température à fibre optique séparées.</li>
	<li>Allumez le refroidisseur, vérifiez que le liquide de refroidissement circule dans le serpentin. Allumez la source d’alimentation et réglez le pourcentage de maximum au champ souhaité. Faire fonctionner la bobine solénoïde à 14 tours, alimentée par un générateur de 10 kW, à 165 kHz et 23,87 kA/m (300 Oe).</li>
	<li>Placez une sonde de température à fibre optique séparée dans l’un des tubes. Traiter les cellules jusqu’à la dose thermique du protocole préalablement déterminée. Un exemple est 30 min à 43 °C (CEM43 sur 30).</li>
	<li>Resuspendre les cellules dans le milieu qui se trouve dans leurs tubes et re-plaquer dans de nouvelles plaques de 6 puits. Étiquetez clairement les nouvelles plaques. L’objectif est de re-plaquer toutes les cellules collectées (~1 x 106 cellules). REMARQUE : De nouvelles plaques à 6 puits doivent être utilisées pour s’assurer que les cellules cultivées reçoivent un traitement. Si les anciennes plaques sont utilisées, il pourrait encore y avoir des cellules restées sur les plaques qui n’ont pas été trypsinisées avec succès.</li>
	<li>Si nécessaire, pour la procédure expérimentale suivante, lyser les cellules pour l’analyse de l’expression de l’ARN ou des protéines.</li>
</ol>3. Hyperthermie in vivo
<ol><li>Culture cellulaire et inoculation<ol><li>Culture de cellules de mélanome murin B16F10 dans un milieu RPMI avec 10% FBS et 1% Pen/streptocoque. Utilisez des assiettes/plats qui fourniront suffisamment de cellules pour inoculer le nombre désiré d’animaux. Par exemple, des boîtes de 10, 100 mm, plaquées à 100 000 cellules seront confluentes avec suffisamment de cellules pour des injections de 20 souris en 48 heures.</li>
		<li>Trypsiniser les cellules et recueillir en utilisant des médias RPMI purs (pas de FBS ou stylo / streptocoque).</li>
		<li>Comptez les cellules et créez une solution pour la concentration souhaitée de cellules, en fonction du volume d’inoculation et du nombre de souris.</li>
		<li>Anesthésier les souris C57Bl/6 femelles âgées de 6 semaines à l’aide d’isoflurane vaporisé et d’oxygène. Placez les animaux dans une boîte en plexiglas contenant 5 % d’isoflurane et 95 % d’oxygène jusqu’à incitation. Une fois induit, enlever l’animal et utiliser un cône facial contenant 2 % d’isoflurane pour compléter les étapes 3.1.5-3.1.7 et 3.3.3-3.3.6. REMARQUE: Pour l’anesthésie pendant le traitement, utilisez un confinement d’anesthésie intégré. Suivez les protocoles institutionnels standard pour l’anesthésie de la souris. Avant l’expérimentation animale, assurez-vous de l’approbation appropriée de l’IACUC. Après l’anesthésie, remettez l’animal en cage et surveillez la récupération pour éviter toute complication.</li>
		<li>Vérifiez l’absence de réponse aux réflexes de redressement.</li>
		<li>Rasez le flanc droit à l’aide d’un rasoir électrique.</li>
		<li>Nettoyez la zone d’injection avec une lingette imbibée d’alcool. Injecter 1-2 x 106 cellules, à l’aide d’une seringue en verre de 100 μL avec une aiguille de 28 G, dispersées dans 50 μL de milieu par voie intradermique sur le flanc droit rasé de l’anesthésié.</li>
	</ol></li>
	<li>Croissance tumorale/injection de nanoparticules<ol><li>Mesurez les tumeurs en 3 dimensions à l’aide d’étriers (longueur, largeur et profondeur) et calculez les volumes par (longueur x largeur x profondeur x π) / 6.</li>
		<li>Lorsque les volumes tumoraux atteignent 120 mm 3 (+/- 20 mm3), placez les animaux à l’étude. Concevoir l’étude en veillant à ce qu’il y ait des groupes témoins et de traitement appropriés, y compris des cohortes de thérapie combinée (c.-à-d. témoin, mNPH, radiothérapie et combinaison).</li>
		<li>Anesthésier les souris qui recevront des NP de la manière décrite à la section 3.1.4.</li>
		<li>Nettoyez la zone avec une lingette imbibée d’alcool. Injecter des mNPs dans la tumeur 3 h avant le traitement par AMF. Injecter un volume tel que la dose soit de 7,5 mg de fer / cm3 de tumeur. REMARQUE : Des données non publiées du laboratoire suggèrent que l’absorption maximale du NPm se produit à 3-6 heures.</li>
	</ol></li>
	<li>Traitement AMF<ol><li>Anesthésiez la souris et placez-la sur un coussin chauffant pour maintenir la température centrale.</li>
		<li>Vérifiez l’absence de réponse aux réflexes de redressement. Retirez l’étiquette d’oreille ou tout autre objet métallique sur la souris.</li>
		<li>Placez doucement une sonde de température à fibre optique lubrifiée dans le rectum de la souris.</li>
		<li>Placez un cathéter dans la tumeur, en retirant l’aiguille. Coupez le cathéter de manière à ce qu’il ne dépasse pas trop de la tumeur. REMARQUE: Les cathéters de température à fibre optique sont placés et retirés pendant que les souris sont sous anesthésie générale, c’est-à-dire que les cathéters ne sont en place que pendant la procédure de chauffage de la tumeur. Les souris reçoivent une dose sous-cutanée unique d’un analgésique AINS, le kétoprofène (5 mg / kg), au moment de la procédure. Nous n’avons pas observé d’inconfort ou de morbidité à court ou à long terme associés à la mise en place des cathéters.</li>
		<li>Insérez une sonde de température à fibre optique à 3 capteurs dans le cathéter. Le cathéter protège les capteurs de sonde de température à fibre optique.</li>
		<li>Collez la sonde rectale et intratumorale à la queue de l’animal pour vous assurer qu’elle reste en place.</li>
		<li>Placez la souris dans un tube de 50 mL, dirigez-vous vers le bas. Le tube doit avoir un trou près de la tête où l’anesthésie sera connectée et administrée.</li>
		<li>Placez le tube dans la bobine installée et reconnectez l’anesthésie.</li>
		<li>Placez une sonde de température à fibre optique dans le tube pour mesurer la température ambiante.</li>
		<li>Allumez le refroidisseur et assurez-vous que le liquide de refroidissement circule.</li>
		<li>Vérifiez et assurez-vous que le logiciel de l’ordinateur affiche les différentes températures et commencez l’enregistrement pour permettre l’affichage d’un calcul CEM43 en temps réel. La CEM43 requise est la dose précédemment déterminée. REMARQUE: Avant d’allumer l’aimant, assurez-vous qu’aucun objet métallique n’est attaché à l’animal, car il chauffera rapidement. De plus, assurez-vous que tout le monde dans la pièce n’a pas de stimulateur cardiaque et qu’il est sécuritaire pour eux d’être là.</li>
		<li>Allumez l’aimant à un faible pourcentage de puissance.</li>
		<li>Assurez-vous que les sondes de température à fibre optique enregistrent les changements de température. Les températures augmenteront une fois que le CMA sera activé à mesure que le champ augmentera. S’assurer que la température à cœur de l’animal reste à 38 °C. Réglez la température à cœur à l’aide de la chemise d’air conditionnée.</li>
		<li>Ajustez la force du champ magnétique en changeant l’alimentation du générateur, à l’aide du cadran de contrôle intégré, qui à son tour contrôle le niveau de température dans la tumeur.</li>
		<li>Couper l’AMF une fois que la dose souhaitée, telle que précédemment déterminée par l’utilisateur (par exemple CEM43 40), est atteinte dans la tumeur.</li>
		<li>Une fois l’AMF arrêté, retirez le tube de la bobine.</li>
		<li>Retirez la souris du tube, en extrayant les différentes sondes et cathéter. Si nécessaire, marquez l’animal avec une nouvelle étiquette d’oreille en métal.</li>
		<li>Une fois les traitements terminés, arrêtez le refroidisseur.</li>
		<li>Récupérez les animaux de l’anesthésie en évitant les complications. Surveillez leur comportement pour assurer un retour à la normale.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La conception et la mise en œuvre de ce système permettent de mener des expériences précises et reproductibles in vitro et in vivo d’hyperthermie magnétique par nanoparticules. Il est essentiel que le système soit conçu de manière à ce que la fréquence et l’intensité du champ AMF correspondent adéquatement au type de nanoparticules magnétiques, à la concentration, ainsi qu’à l’emplacement et à la température des tissus souhaités. De plus, la surveillance précise de la température en temps rée...

L’hyperthermie a toujours été utilisée dans le traitement du cancer, seule ou en combinaison avec d’autres traitements. Bien qu’il ait une longue histoire d’utilisation, la méthode la plus avantageuse pour administrer ce traitement fait encore l’objet de débats et dépend du site et de l’emplacement de la maladie. Les méthodes d’administration hyperthermique comprennent les micro-ondes, la radiofréquence, les ultrasons focalisés, le laser et les nanoparticules métalliques (comme l’or ou l’oxyde de fer)1,2,3,4. Ces méthodes d’administration peuvent conduire à une gamme de températures de traitement allant du niveau de fièvre à des centaines de degrés C. L’effet biologique de l’hyperthermie dépend principalement des températures utilisées et de la durée du traitement5. Pour ce manuscrit et à cette fin, nous nous concentrons sur l’hyperthermie des nanoparticules magnétiques (mNPH). Cette méthode permet des changements de température ciblés, localisés, bien surveillés et contrôlés, en utilisant des nanoparticules d’oxyde de fer non toxiques et approuvées par la FDA.
L’un des pièges des autres modalités d’hyperthermie est le manque de ciblage cellulaire précis; L’hyperthermie n’a pas un rapport thérapeutique intrinsèquement élevé, par conséquent, une thermométrie et un ciblage minutieux sont nécessaires6. mNPH permet l’injection systémique ou intratumorale de mNPs, la chaleur n’étant générée que là où se trouvent les mNPs, ciblant ainsi le traitement directement sur la tumeur. mNPH peut être efficace lorsque les nanoparticules magnétiques sont situées à l’intérieur ou à l’extérieur de la cellule. Pour le traitement du cancer, l’aperçu général de mNPH est que les nanoparticules magnétiques sont injectées (intratumorales ou intraveineuses), puis un champ magnétique alternatif est appliqué, provoquant le réalignement constant des pôles magnétiques des nanoparticules, conduisant à un échauffement localisé des cellules et des tissus associés aux nanoparticules 7,8 . En ajustant le volume de nanoparticules et la fréquence/force du champ magnétique alternatif (CMA), il est possible de contrôler soigneusement la température générée dans le tissu.
Ce traitement fonctionne bien dans les tumeurs qui sont près de la surface du corps, car les tumeurs plus profondes nécessitent des CMA plus fortes, de sorte que le risque de chauffage par courants de Foucault augmente9. Il existe des preuves que l’hyperthermie est utilisée cliniquement en monothérapie, cependant, l’hyperthermie est souvent associée à la radiothérapie ou à la chimiothérapie, ce qui entraîne un effet anticancéreux plus ciblé10,11,12. Les preuves cliniques de l’hyperthermie en association avec la radiothérapie sont examinées dans une publication précédente13. Notre laboratoire a traité avec succès une variété d’animaux, des souris aux porcs et aux cancers canins spontanés, en utilisant la méthode mNPH12,14,15. Ce protocole est conçu pour ceux qui souhaitent étudier les effets du traitement de l’hyperthermie localisée, seul ou en combinaison avec d’autres thérapies.
L’un des facteurs les plus importants de l’hyperthermie est de pouvoir mesurer et comprendre, en temps réel, la dose thermique délivrée au tissu cible / tumoral. Une méthode standard de calcul et de comparaison de la dose consiste à démontrer les minutes équivalentes cumulées de chauffage à 43 °C; Cet algorithme permet de comparer les doses indépendamment du système d’administration, des températures maximales et minimales (dans une plage spécifique) et des paramètres de chauffage et de refroidissement 5,16. Le calcul CEM fonctionne mieux pour des températures comprises entre 39 et 57 °C5. Par exemple, dans certaines des études que nous avons réalisées, nous avons choisi une dose thermique de CEM43 30 (c.-à-d. 30 min à 43 °C). Le choix de cette dose nous a permis d’examiner un effet immunogénétique sûr et efficace in vitro, à la fois seul et en combinaison avec une dose unique de rayonnement17.
Avec l’hyperthermie magnétique par nanoparticules, plusieurs facteurs doivent être pris en compte dans la construction d’un système d’administration approprié. La conception de l’instrumentation comprend des facteurs de sécurité importants, tels que l’utilisation d’un refroidisseur pour s’assurer que l’équipement de distribution de champ magnétique reste froid même lorsqu’il fonctionne à haute puissance, et des procédures à sécurité intégrée qui empêchent le système d’être allumé si tous les systèmes de température, d’évaluation de la puissance et de contrôle n’ont pas été activés. En outre, il existe des facteurs biologiques importants qui doivent être pris en compte pour les situations in vivo et in vitro. Lors de l’utilisation de cellules en culture, il est nécessaire de traiter dans un milieu de croissance et de maintenir à une température viable constante pour éviter les changements physiologiques qui pourraient affecter les résultats. Pour les types de nanoparticules individuels, il est important de connaître le débit d’absorption spécifique (DAS) lors du calcul des paramètres de chauffage basés sur les CMA. De même, il est important de connaître la concentration de mNP/Fe, dans les cellules et les tissus, qui est nécessaire pour obtenir le chauffage souhaité. Les méthodes in vivo nécessitent encore plus d’attention aux détails puisque l’animal doit être maintenu sous anesthésie pendant le traitement et que la température corporelle centrale de l’animal doit être maintenue à un niveau normal tout au long du traitement. Laisser baisser la température corporelle de l’animal, comme c’est le cas sous anesthésie, peut affecter les résultats globaux, en ce qui concerne la dose thermique du tissu traité.
Dans ce manuscrit, nous discutons des méthodes utilisées pour concevoir et construire un système polyvalent d’hyperthermie par nanoparticules magnétiques, ainsi que des facteurs d’utilisation importants qui doivent être pris en compte. Le système décrit permet l’administration robuste, cohérente, biologiquement appropriée, sûre et bien contrôlée de l’hyperthermie par nanoparticules magnétiques. Enfin, il convient de noter que les études mNPH que nous menons impliquent souvent d’autres thérapies telles que la radiothérapie, la chimiothérapie et l’immunothérapie. Pour que ces résultats soient significatifs, il est important de déterminer comment la chaleur délivrée peut affecter l’efficacité et/ou la sécurité-toxicité d’autres modalités (ou vice versa) et le bien-être de l’animal. Pour cette raison et les situations de dosimétrie et thérapeutiques mentionnées précédemment, il est essentiel de porter une attention particulière à la précision du dosage de l’hyperthermie magnétique des nanoparticules et aux mesures continues de la température du cœur et de la cible. L’objectif de ce protocole est de fournir une méthode et une description simples et cohérentes pour l’administration d’une hyperthermie de nanoparticules magnétiques sûre et efficace.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>.25% Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-664</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf 22363204</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16F10 murine melanoma cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-6475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/Bl6 mice</td>
			<td>Charles river</td>
			<td>027C57BL/6</td>
			<td>6-week-old female mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chiller</td>
			<td>Thermal Care</td>
			<td>NQ 5 series</td>
			<td>chiller that cools the coil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coolant fluid</td>
			<td>Dow Chemical Company</td>
			<td>Dowtherm SR-1</td>
			<td>antenna cooling fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fiber optic probes, software and chassis</td>
			<td>FISO</td>
			<td></td>
			<td>FISO evolution software used to read the temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR camera</td>
			<td>Flir</td>
			<td></td>
			<td>infrared camera to monitor unintentional heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iron oxide nanoparticles</td>
			<td>micromod Partikeltechnologie GmbH</td>
			<td>Bionized NanoFerrite</td>
			<td>dextran coated iron oxide nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse coil, solenoid</td>
			<td>Fluxtrol</td>
			<td>custom built</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-652</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF generator</td>
			<td>Huttinger</td>
			<td>TIG 10/300</td>
			<td>power source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI media</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-396</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo delivery of magnetic nanoparticle hyperthermia using a custom-built delivery system

L’hyperthermie a longtemps été utilisée dans le traitement du cancer. Les techniques ont varié de l’insertion intratumorale de tiges de fer chaudes, aux nanoparticules magnétiques ciblées par anticorps tumoral administrés par voie systémique, à des températures de 39 ° C (niveau de fièvre) à 1 000 ° C (électrocautérisation) et des temps de traitement de quelques secondes à quelques heures. La relation température-temps (dose thermique) dicte l’effet avec des doses thermiques élevées entraînant l’ablation des tissus et des doses thermiques plus faibles entraînant des effets sublétaux tels que l’augmentation du flux sanguin, l’accumulation de médicaments et la stimulation immunitaire. L’une des thérapies médicales actuelles les plus prometteuses est l’hyperthermie magnétique par nanoparticules (mNPH). Cette technique consiste à activer des nanoparticules magnétiques, qui peuvent être délivrées par voie systémique ou intratumorale, avec un champ magnétique alternatif non invasif et non toxique. La taille, la construction et l’association des nanoparticules magnétiques ainsi que la fréquence et l’intensité du champ magnétique sont des déterminants majeurs de l’échauffement. Nous avons développé des instruments et des techniques sophistiqués pour fournir une hyperthermie de nanoparticules magnétiques reproductibles dans des modèles animaux de grande et de petite taille et des cellules en culture. Cette approche, utilisant une surveillance continue et en temps réel de la température à plusieurs endroits, permet d’administrer des doses thermiques bien définies au tissu cible (tumeur) ou aux cellules tout en limitant le chauffage des tissus non ciblés. Le contrôle et la surveillance précis de la température, sur plusieurs sites, et l’utilisation de l’algorithme standard de l’industrie (minutes équivalentes cumulées à 43 °C / CEM43), permettent une détermination et une quantification précises de la dose thermique. Notre système, qui permet une grande variété de températures, de doses thermiques et d’effets biologiques, a été développé grâce à une combinaison d’acquisitions commerciales et de développements internes en ingénierie et en biologie. Ce système a été optimisé de manière à permettre la conversion rapide entre les techniques ex vivo, in vitro et in vivo. L’objectif de ce protocole est de démontrer comment concevoir, développer et mettre en œuvre une technique et un système efficaces pour administrer une hyperthermie reproductible et précise de thérapie par nanoparticules magnétiques (NPm).

Études in vitro Les cellules n’atteindront et ne maintiendront la température et la dose thermique souhaitées que si la quantité et la concentration des nanoparticules magnétiques/fer et de l’AMF sont correctement appariées. Lors de l’utilisation de nanoparticules magnétiques pour chauffer des cellules in vitro (et in vivo), il convient de noter que pour atteindre l’hyperthermie dans des cellules avec des nanoparticules magnétiques internalisées, un niveau spécifique de mNP / Fe intr...

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In Vitro and In Vivo Delivery of Magnetic Nanoparticle Hyperthermia Using a Custom-Built Delivery System

Ce protocole présente les techniques et la méthodologie nécessaires à l’administration précise de l’hyperthermie des nanoparticules magnétiques à l’aide d’un système sophistiqué de livraison et de surveillance.

Administration in vitro et in vivo d’hyperthermie par nanoparticules magnétiques à l’aide d’un système d’administration sur mesure

Hyperthermia has long been used in the treatment of cancer. Techniques have varied from the intra-tumoral insertion of hot iron rods, to systemically ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

4.2K vues.  Dartmouth College. Ce protocole présente les techniques et la méthodologie nécessaires à l’administration précise de l’hyperthermie des nanoparticules magnétiques à l’aide d’un système sophistiqué de livraison et de surveillance.

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Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery. Fresh patient tissue obtained at the time of surgery is sliced and maintained in culture. The ex vivo model system allows for the physical delivery of genes into intact patient tissue and gene expression is analysed by bioluminescence imaging using the IVIS detection system. The bioluminescent detection system demonstrates rapid and accurate quantification of gene expression within individual slices without the need for tissue sacrifice. This slice tissue culture system may be used in a variety of tissue types including normal and malignant tissue and allows us to study the effects of the heterogeneous nature of intact tissue and the high degree of variability between individual patients. This model system could be used in certain situations as an alternative to animal models and as a complementary preclinical mode prior to entering clinical trial.

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This article describes the culture of patient tissue slices for gene delivery studies and subsequent analysis of gene expression using IVIS bioluminescence imaging.

Culture ex vivo des tissus du patient et l&#39;examen de la livraison de gènes

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Recherche

Médecine

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue revascularization and cell survival. In addition, further observations revealed that specific stem cells, such as cardiac stem cells, mesenchymal stem cells and cardiospheres have the ability to integrate within the surrounding myocardium by differentiating into cardiomyocytes, smooth muscle cells and endothelial cells.
Here, we present the materials and methods to reliably deliver noncontractile cells into the left ventricular wall of immunodepleted mice. The salient steps of this microsurgical procedure involve anesthesia and analgesia injection, intratracheal intubation, incision to open the chest and expose the heart and delivery of cells by a sterile 30-gauge needle and a precision microliter syringe.
Tissue processing consisting of heart harvesting, embedding, sectioning and histological staining showed that intramyocardial cell injection produced a small damage in the epicardial area, as well as in the ventricular wall. Noncontractile cells were retained into the myocardial wall of immunocompromised mice and were surrounded by a layer of fibrotic tissue, likely to protect from cardiac pressure and mechanical load.

Intramyocardial cell delivery in murine models of cardiovascular diseases, such as hypertension or myocardial infarction, is widely used to test the therapeutic potential of different cell types in regenerative studies. Therefore, a detailed description and a clear visualization of this surgical procedure will help to define the limits and advantages of cardiovascular cell therapeutic analyses in small rodents.

Intramyocardique cellulaire livraison: Observations aux coeurs murins

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these diseases. Chronic retinal diseases such as retinal oedema or neovascularization usually require multiple intraocular injections to effectively treat the condition. However, the risks associated with these injections increase with repeated delivery of the drug. Therefore, alternative delivery methods need to be established in order to minimize the risks of reinjection. Several other investigations have developed methods to deliver drugs over extended time, through materials capable of releasing chemicals slowly into the eye. In this investigation, we outline the use of Elvax 40W, a copolymer resin, to act as a vehicle for drug delivery to the adult rat retina. The resin is made and loaded with the drug. The drug-resin complex is then implanted into the vitreous cavity, where it will slowly release the drug over time. This method was tested using 2-amino-4-phosphonobutyrate (APB), a glutamate analogue that blocks the light response of the retina. It was demonstrated that the APB was slowly released from the resin, and was able to block the retinal response by 7 days after implantation. This indicates that slow-release drug delivery using this copolymer resin is effective for treating the retina, and could be used therapeutically with further testing.

This paper details how Elvax 40W can be used as a slow-release method for drug delivery to the adult rat retina. The protocol for preparing, loading, and delivering the drug-resin complex to the eye is described.

À libération lente Drug Delivery par Elvax 40W pour le Retina Rat: Implications pour le traitement des maladies chroniques

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences between the murine and human respiratory systems, especially in their upper respiratory tracts (URT). In some models, these differences in the murine nasal cavity can have a significant impact on disease progression and presentation in the lower respiratory tract (LRT) when using intranasal instillation techniques, potentially limiting the usefulness of the mouse model to study these diseases. For these reasons, it would be advantageous to develop a technique to instill bacteria directly into the mouse lungs in order to study LRT disease in the absence of involvement of the URT. We have termed this lung specific delivery technique intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation. This noninvasive technique minimizes the potential for instillation into the bloodstream, which can occur during more invasive traditional surgical intratracheal infection approaches, and limits the possibility of incidental digestive tract delivery. IMIT is a two-step process in which mice are first intubated, with an intermediate step to ensure correct catheter placement into the trachea, followed by insertion of a blunt needle into the catheter to mediate direct delivery of bacteria into the lung. This approach facilitates a &#62;98% efficacy of delivery into the lungs with excellent distribution of reagent throughout the lung. Thus, IMIT represents a novel approach to study LRT disease and therapeutic delivery directly into the lung, improving upon the ability to use mice as surrogates to study human respiratory disease. Furthermore, the accuracy and reproducibility of this delivery system also makes it amenable to Good Laboratory Practice Standards (GLPS), as well as delivery of a wide range of reagents which require high efficiency delivery to the lung.

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation of reagents is an excellent, noninvasive method for studying respiratory disease, as well as a method for instilling therapeutic reagents directly into the lung. It is a rapid and highly reproducible method which is suitable for preclinical testing.

Intubation médiation intratrachéale (GI-TI) instillation: un système de distribution non invasive, Lung-spécifique

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Appauvrissement des cellules de souris de xénogreffes de tumeurs humaines améliore de manière significative l&#39;analyse en aval des cellules cibles

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Intravascular Delivery of Biologics to the Rat Kidney

The renal microvascular compartment plays an important role in the progression of kidney disease and hypertension, leading to the development of End Stage Renal Disease with high risk of death for cardiovascular events. Moreover, recent clinical studies have shown that renovascular structure and function may have a great impact on functional renal recovery after surgery. Here, we describe a protocol for the delivery of drugs into the renal artery of rats. This procedure offers significant advantages over the frequently used systemic administration as it may allow a more localized therapeutic effect. In addition, the use of rodents in pharmacodynamic analysis of preclinical studies may be cost effective, paving the way for the design of translational experiments in larger animal models. Using this technique, infusion of rat recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) protein in rats has induced activation of VEGF signaling as shown by increased expression of FLK1, pAKT/AKT, pERK/ERK. In summary, we established a protocol for the intrarenal delivery of drugs in rats, which is simple and highly reproducible.

The administration of drugs for recovery of kidney function requires control of the localization and distribution of the therapeutic compound. Here, we describe in detail a simple technique for intrarenal delivery of drugs in rats. This procedure may be easily performed with no mortality and high reproducibility.

Livraison intravasculaire de produits biologiques du rein de rat

The renal microvascular compartment plays an important role in the progression of kidney disease and hypertension, leading to the development of End Stage ...

Using Multi-fluorinated Bile Acids and In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Measure Bile Acid Transport

Along with their traditional role as detergents that facilitate fat absorption, emerging literature indicates that bile acids are potent signaling molecules that affect multiple organs; they modulate gut motility and hormone production, and alter vascular tone, glucose metabolism, lipid metabolism, and energy utilization. Changes in fecal bile acids may alter the gut microbiome and promote colon pathology including cholerrheic diarrhea and colon cancer. Key regulators of fecal bile acid composition are the small intestinal Apical Sodium-dependent Bile Acid Transporter (ASBT) and fibroblast growth factor-19 (FGF19). Reduced expression and function of ASBT decreases intestinal bile acid up-take. Moreover, in vitro data suggest that some FDA-approved drugs inhibit ASBT function. Deficient FGF19 release increases hepatic bile acid synthesis and release into the intestines to levels that overwhelm ASBT. Either ASBT dysfunction or FGF19 deficiency increases fecal bile acids and may cause chronic diarrhea and promote colon neoplasia. Regrettably, tools to measure bile acid malabsorption and the actions of drugs on bile acid transport in vivo are limited. To understand the complex actions of bile acids, techniques are required that permit simultaneous monitoring of bile acids in the gut and metabolic tissues. This led us to conceive an innovative method to measure bile acid transport in live animals using a combination of proton (1H) and fluorine (19F) magnetic resonance imaging (MRI). Novel tracers for fluorine (19F)-based live animal MRI were created and tested, both in vitro and in vivo. Strengths of this approach include the lack of exposure to ionizing radiation and translational potential for clinical research and practice.

Using Multi-fluorinated Bile Acids and In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Measure Bile Acid Transport

Tools to diagnose bile acid malabsorption and measure bile acid transport in vivo are limited. An innovative approach in live animals is described that utilizes combined proton (1H) plus fluorine (19F) magnetic resonance imaging; this novel methodology has translational potential to screen for bile acid malabsorption in clinical practice.

En utilisant des acides biliaires multi-fluorés et<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie par résonance magnétique pour mesurer Bile Transport Acid

Along with their traditional role as detergents that facilitate fat absorption, emerging literature indicates that bile acids are potent signaling ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

Optimisé méthode LC-MS/MS pour l’analyse de haut débit d’échantillons cliniques de Ivacaftor, ses principaux métabolites et Lumacaftor dans les fluides biologiques des patients atteints de fibrose kystique

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Procédé amélioré pour la création d’un In Vitro barrière hémato - encéphalique modèle basé sur les cellules endothéliales du cerveau porcin

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a promising therapeutic target in many disorders, such as autoimmune diseases, atherosclerosis, and cancer. RNAi-mediated gene silencing is a valuable approach of choice to probe and manipulate macrophage function; however, the transfection of macrophages with siRNA is often considered to be technically challenging, and, at present, few methodologies dedicated to the siRNA transfer to macrophages are available. Here, we present a protocol of using polyethyleneimine-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles (PEI-SPIONs) as a vehicle for the targeted delivery of siRNA to macrophages. PEI-SPIONs are capable of binding and completely condensing siRNA when the Fe:siRNA weight ratio reaches 4 and above. In vitro, these nanoparticles can efficiently deliver siRNA into primary macrophages, as well as into the macrophage-like RAW 264.7 cell line, without compromising cell viability at the optimal dose for transfection, and, ultimately, they induce siRNA-mediated target gene silencing. Apart from being used for in vitro siRNA transfection, PEI-SPIONs are also a promising tool for delivering siRNA to macrophages in vivo. In view of its combined features of magnetic property and gene-silencing ability, systemically administered PEI-SPION/siRNA particles are expected not only to modulate macrophage function but also to enable macrophages to be imaged and tracked. In essence, PEI-SPIONs represent a simple, safe, and effective nonviral platform for siRNA delivery to macrophages both in vitro and in vivo.

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

We describe a method of using polyethyleneimine (PEI)-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles for transfecting macrophages with siRNA. These nanoparticles can efficiently deliver siRNA to macrophages in vitro and in vivo and silence target gene expression.

Nanoparticules de Polyéthylèneimine recouvertes d’oxyde de fer comme un véhicule pour la livraison de petits ARN interférents à Macrophages In Vitro et In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...