O estudo foi financiado por números de subvenção: NCI P30 CA023108 e NCI U54 CA151662.

O Dartmouth College Animal Care and Use Program é credenciado pela American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care (iAAALAC) e adere a todas as diretrizes e regulamentos da UDSA e do NIH (Office of Laboratory Animal Welfare). Todos os estudos in vivo foram aprovados pelo Dartmouth College Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). O procedimento de eutanásia adere às Diretrizes da AVMA de 2020 para a Eutanásia de Animais.
1. Instrumentação/concepção do sistema
<ol><li>Projete a antena AMF personalizada (bobina) para ser um circuito fechado, escolhendo formas para criar o campo magnético desejado. Use fórmulas e características de indutância da escolha do gerador de energia para projetar bobinas compatíveis para gerar o campo desejado. Use diferentes projetos para experimentos in vitro e in vivo.</li>
	<li>Certifique-se de que a indutância da antena AMF esteja dentro do alcance aceitável do gerador de energia. Adicione ou subtraia capacitores para combinar (sintonizar) a antena com o gerador de energia.</li>
	<li>Para experimentos in vitro, projete uma bobina helicoidal de 14 voltas, diâmetro interno de 2 cm e comprimento de 14 cm, que pode conter tubos de 1,5 mL, permitindo o tratamento de múltiplas amostras simultaneamente. Isole a bobina com um polímero de vinil e use um espaçador de poliestireno para separar a bobina dos tubos. Detalhes da especificação e considerações do projeto estão presentes no Arquivo Suplementar 1.</li>
	<li>Para experimentos in vivo, adquira uma bobina helicoidal de corpo inteiro personalizada de um fabricante com informações de design proprietárias. Use tubos quadrados de 8 mm (pois cria um campo mais uniforme dentro do furo da bobina) e um concentrador na área de tratamento direcionada. Faça o concentrador 5,0 cm de comprimento, com um total de 5 voltas resultando em um diâmetro interno de 3,6 cm, 5,2 cm de diâmetro externo e tenha sua localização na área de tratamento alvo. Envolva a bobina com um invólucro de policarbonato.</li>
	<li>Use um gerador AMF com potência e frequência ajustáveis, avaliado em 10 kW ou mais como fonte de energia. A indutância corresponde à fonte de energia e às antenas/bobinas para uma faixa de 0,62 a 1,18 μHenries (μH), permitindo frequências que variam entre 30-300 kHz. Arrefecer o gerador utilizando água reciclada através de uma bomba centrífuga de impulso, pressão regulada para 50 psi.</li>
	<li>Resfrie as bobinas com um resfriador de capacidade de resfriamento de 5,6 toneladas que bombeia 25% de fluido de transferência de calor à base de etilenoglicol diluído com água através da antena AMF. Ajuste a temperatura do resfriador para que a antena não aqueça ou resfrie a amostra.</li>
	<li>Para a contenção do animal, construa um suporte tubular que possa ser suspenso no centro da bobina com um espaço de ar de 0,5 cm entre o suporte e a superfície da bobina. Conecte uma bomba de ar condicionado ajustável que circula o ar através do invólucro ao redor da bobina e configure-a para manter uma temperatura central normal do animal. Conecte a máquina de anestesia ao suporte tubular do animal perto da cabeça do animal para garantir a entrega adequada da anestesia.</li>
	<li>Para a contenção celular, crie um aparelho que circule a água de um banho-maria através do espaçador onde os tubos são colocados. Ajuste a temperatura deste banho-maria de modo a que os tubos sejam rodeados por água a 37 °C.</li>
	<li>Use sondas de fibra óptica para monitorar as temperaturas dentro do tumor, o núcleo do animal e o ambiente animal ou para estudos in vitro, monitorando a temperatura da pelota celular e a água ao redor dos tubos.</li>
	<li>Use nanopartículas magnéticas de óxido de ferro com 100 nm de tamanho para todos os experimentos. NOTA: A concentração e a taxa de absorção específica (SAR) são duas características que devem ser consideradas na escolha das nanopartículas, pois afetam diretamente o possível aquecimento e a dose térmica18.</li>
</ol>2. Hipertermia in vitro
<ol><li>Cultura de células de melanoma murino B16F10 em meio RPMI com 10% de FBS e 1% de Pen/estreptococo. Placa 150, 000 células/poço em placas de 6 poços, com 2 mL de meio completo.</li>
	<li>Determinar o tratamento adequado para cada poço, ou seja, células sem mNPs e sem FMA, células com mNPs e sem FMA, células sem mNPs e FMA, células com mNPs e FMA. NOTA: Além disso, certifique-se de que existem controlos adequados se combinar hipertermia com outra terapêutica. O AMF é realizado em um laboratório de bancada de pesquisa padrão adaptado com os recursos de energia e resfriamento necessários.</li>
	<li>24 h após o revestimento, adicionar mNPs aos poços apropriados, conforme determinado na etapa anterior. Adicionar mNPs a uma concentração de 3 mg de ferro/mL. Certifique-se de que os mNPs estejam distribuídos por todo o poço, seja criando uma solução de mídia de estoque/mNP (removendo a mídia antiga, adicionando essa solução) ou adicionando as placas de rodopio direta e suave para distribuição homogênea.</li>
	<li>Iniciar o tratamento, 48 h após a adição de mNPs, quando os poços estiverem ~80% confluentes, removendo o meio e lavando os poços com meio fresco. Remova a mídia.</li>
	<li>Adicione 0,5 mL de tripsina a cada poço a ser tratado e gire suavemente. Use um microscópio para verificar se as células estão separadas.</li>
	<li>Adicione 1 mL de meio a cada poço para coletar as células em tubos de 1,5 mL. Colete todas as células do poço (~1 x 106 células). Use um tubo separado claramente rotulado para cada poço.</li>
	<li>Tubos de rotação a 60 x g por 2-3 min para permitir que as células sejam pellet. Retenha o pellet na mídia.</li>
	<li>Coloque os tubos no espaçador cheios de água dentro da bobina. Regule a temperatura do banho-maria de modo a que o meio e o pellet celular sejam mantidos a 37 °C. Monitore a temperatura dentro do tubo e do banho de água usando sondas de temperatura de fibra óptica separadas.</li>
	<li>Ligue o chiller, verifique se o refrigerante está fluindo através da bobina. Ligue a fonte de alimentação e ajuste a porcentagem do máximo para o campo desejado. Operar a bobina solenoide de 14 voltas, alimentada por gerador de 10 kW, a 165 kHz e 23,87 kA/m (300 Oe).</li>
	<li>Coloque uma sonda de temperatura de fibra óptica separada em um dos tubos. Trate as células até a dose térmica do protocolo previamente determinado. Um exemplo é 30 min a 43 °C (CEM43 de 30).</li>
	<li>Ressuspeite as células no meio que está em seus tubos e re-prato em novas placas de 6 poços. Rotule claramente as novas placas. O objetivo é re-placa todas as células coletadas (~ 1 x 106 células). NOTA: Novas placas de 6 poços devem ser usadas para garantir que as células que estão sendo cultivadas recebam tratamento. Se as placas antigas forem usadas, ainda pode haver células deixadas nas placas que não foram tripsinizadas com sucesso.</li>
	<li>Se necessário, para o próximo procedimento experimental, lise as células para análise de RNA ou expressão de proteínas.</li>
</ol>3. Hipertermia in vivo
<ol><li>Cultura celular e inoculação<ol><li>Cultura de células de melanoma murino B16F10 em meio RPMI com 10% de FBS e 1% de Pen/estreptococo. Use pratos / pratos que fornecerão células suficientes para a inoculação do número desejado de animais. Por exemplo, pratos de 10, 100 mm, banhados a 100.000 células, serão confluentes com células suficientes para 20 injeções de camundongos dentro de 48 h.</li>
		<li>Tripsinize as células e colete usando mídia RPMI pura (sem FBS ou caneta/estreptococo).</li>
		<li>Conte células e crie uma solução para a concentração desejada de células, com base no volume de inoculação e no número de camundongos.</li>
		<li>Anestesiar camundongos C57Bl/6 fêmeas de 6 semanas de idade usando isoflurano vaporizado e oxigênio. Coloque os animais em uma caixa de plexiglass com 5% de isoflurano e 95% de oxigênio até induzir. Uma vez induzido, remova o animal e use um cone facial a 2% de isoflurano para completar as etapas 3.1.5-3.1.7 e 3.3.3-3.3.6. NOTA: Para anestesia durante o tratamento, use uma contenção de anestesia embutida. Siga os protocolos institucionais padrão para anestesia de camundongos. Antes da experimentação animal, assegure a aprovação apropriada da IACUC. Após a anestesia, devolva o animal à gaiola e monitore a recuperação para garantir que não haja complicações.</li>
		<li>Verifique a falta de resposta aos reflexos de endireitamento.</li>
		<li>Raspe o flanco direito usando um barbeador elétrico.</li>
		<li>Limpe a área de injeção com um toalhete com álcool. Injetar 1-2 x 106 células, utilizando uma seringa de vidro de 100 μL com uma agulha de 28 G, dispersa em 50 μL de meio intradérmico no flanco direito raspado de anestesiado.</li>
	</ol></li>
	<li>Crescimento tumoral/Injeção de nanopartículas<ol><li>Meça tumores em 3 dimensões usando paquímetros (comprimento, largura e profundidade) e calcule os volumes por (comprimento x largura x profundidade x π)/6.</li>
		<li>Quando os volumes tumorais atingirem 120 mm 3 (+/- 20 mm3), coloque os animais em estudo. Projetar o estudo, garantindo que haja grupos de controle e tratamento apropriados, incluindo coortes de terapia combinada (ou seja, controle, mNPH, radiação e a combinação).</li>
		<li>Anestesiar ratinhos que irão receber mNPs, conforme descrito no ponto 3.1.4.</li>
		<li>Limpe a área com um toalhete com álcool. Injete mNPs no tumor 3 h antes do tratamento com FMA. Injete um volume tal que a dose seja de 7,5 mg de ferro/cm3 de tumor. NOTA: Dados não publicados do laboratório sugerem que a captação máxima de mNP ocorre em 3-6 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Tratamento de FMA<ol><li>Anestesiar o mouse e colocar em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura central.</li>
		<li>Verifique a falta de resposta aos reflexos de endireitamento. Remova a marca auricular ou quaisquer outros objetos de metal no mouse.</li>
		<li>Coloque suavemente uma sonda de temperatura de fibra óptica lubrificada no reto do mouse.</li>
		<li>Coloque um cateter no tumor, removendo a agulha. Corte o cateter de tal forma que ele não saia muito do tumor. NOTA: Os cateteres de temperatura de fibra óptica são colocados e removidos enquanto os ratos estão sob anestesia geral, ou seja, os cateteres só estão no lugar durante o procedimento de aquecimento do tumor. Os ratos recebem uma dose subcutânea única de um medicamento para analgesia de AINEs, cetoprofeno (5 mg / kg), no momento do procedimento. Não observamos desconforto ou morbidade a curto ou longo prazo associados à colocação dos cateteres.</li>
		<li>Insira uma sonda de temperatura de fibra óptica de 3 sensores no cateter. O cateter protege os sensores de sonda de temperatura de fibra óptica.</li>
		<li>Cole a sonda retal e intratumoral na cauda do animal para garantir que eles permaneçam no lugar.</li>
		<li>Coloque o rato num tubo de 50 ml, dirija-se ao fundo. O tubo deve ter um orifício perto da cabeça, onde a anestesia será conectada e entregue.</li>
		<li>Coloque o tubo dentro da bobina configurada e reconecte a anestesia.</li>
		<li>Coloque uma sonda de temperatura de fibra óptica frouxamente no tubo para medir a temperatura ambiente.</li>
		<li>Ligue o resfriador e certifique-se de que o líquido de arrefecimento está circulando.</li>
		<li>Verifique e verifique se o software do computador está exibindo as várias temperaturas e comece a gravar para permitir que um cálculo CEM43 seja exibido em tempo real. O CEM43 necessário é a dose previamente determinada. NOTA: Antes que o ímã seja ligado, certifique-se de que nenhum item de metal esteja ligado ao animal, pois eles aquecerão rapidamente. Além disso, certifique-se de que todos na sala não tenham um marcapasso e que seja seguro para eles estarem lá.</li>
		<li>Ligue o ímã em uma porcentagem de baixa potência.</li>
		<li>Certifique-se de que as sondas de temperatura de fibra óptica estão registrando as mudanças de temperatura. As temperaturas aumentarão quando o FMA for ativado à medida que o campo aumentar. Assegurar que a temperatura central do animal se mantém a 38 °C. Regule a temperatura central usando a camisa de ar condicionado.</li>
		<li>Ajuste a força do campo magnético alterando a energia no gerador, usando o mostrador de controle embutido, que por sua vez controla o nível de temperatura no tumor.</li>
		<li>Desligue o FMA uma vez que a dose desejada, conforme previamente determinado pelo usuário (por exemplo, CEM43 40), seja alcançada dentro do tumor.</li>
		<li>Uma vez que o AMF é desligado, remova o tubo da bobina.</li>
		<li>Remova o mouse do tubo, extraindo as várias sondas e cateter. Se necessário, marque o animal com uma nova marca auricular de metal.</li>
		<li>Uma vez que os tratamentos são concluídos, desligue o chiller.</li>
		<li>Recupere os animais da anestesia garantindo que não haja complicações. Monitore seu comportamento para garantir o retorno ao normal.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm nada a revelar.

O projeto e a implementação deste sistema fornecem a capacidade de conduzir experimentos precisos e reprodutíveis de hipertermia de nanopartículas magnéticas in vitro e in vivo. É fundamental que o sistema seja projetado de tal forma que a frequência e a intensidade do campo AMF sejam adequadamente combinadas com o tipo de nanopartícula magnética, a concentração e a localização e temperatura do tecido desejadas. Além disso, o monitoramento preciso da temperatura em tempo real é crucial para a segurança e o cálculo de uma dose térmica precisa (minutos equivalentes cumulativos a 43 °C / CEM). A colocação de sondas, conforme demonstrado na Figura 1, permite o monitoramento em tempo real da dose térmica e da temperatura corporal central, conforme observado na Figura 2.
O primeiro passo na entrega precisa da hipertermia de nanopartículas magnéticas é a construção de um sistema seguro para animais e operadores. Todos os componentes do sistema também devem ser bem compreendidos do ponto de vista operacional e de entrega. Nessa situação, isso significa entender o potencial das correntes parasitas AMF e saber onde as partículas magnéticas estão localizadas. As antenas, ou bobinas, são um fator-chave na forma e resistência do campo, e o sistema de resfriamento usado é importante para evitar o superaquecimento da bobina20. A intensidade do campo fora do condutor é diretamente proporcional à força da corrente que flui através do condutor. A intensidade do campo magnético em qualquer ponto do espaço ao redor do condutor é a soma vetorial dos campos produzidos pelos condutores na área circundante. O campo magnético é produzido em um ângulo reto com o fluxo de corrente e a força diminui exponencialmente, em função da distância do condutor, de acordo com a regra do quadrado inverso de Biot-Savart21. Assim, a tubulação quadrada é usada para hipertermia in vivo para um campo mais uniforme dentro da bobina. Criar um campo magnético com a força e o volume necessários para um sistema potencialmente clinicamente relevante requer uma alta corrente elétrica. Portanto, os projetos de antenas devem ser capazes de acomodar níveis significativos de energia elétrica. Além disso, as antenas AMF devem ser projetadas para que sua indutância fique dentro da faixa aceitável do gerador de energia. Nas frequências normalmente usadas, a maior parte do fluxo de corrente está na superfície do condutor da antena, o que significa que a superfície afeta o aquecimento resistivo, que pode ser minimizado pela eliminação de defeitos de superfície. Este aquecimento resistivo também significa que um sistema de resfriamento da bobina é necessário para garantir que a bobina e o ambiente não superaqueçam.
Uma limitação do projeto do nosso sistema é que ele não permite uma gama total de frequências e campos magnéticos, mas permite que sejam gerados campos apropriados para células, roedores e animais de grande porte. Especificamente, a intensidade máxima de campo disponível de qualquer sistema de aquecimento por indução está diretamente relacionada ao fluxo de corrente na antena (bobina). Os geradores AMF são classificados em quilowatts, que são calculados multiplicando a tensão disponível pela corrente disponível (amperes). Assim, um sistema de 10kW com um limite de 500 V teria uma amperagem máxima de 20 A. O projeto das bobinas determinará qual limite é atingido primeiro e, portanto, o limite dos sistemas. A intensidade do campo magnético criada por qualquer corrente diminui exponencialmente em função da distância do condutor. Portanto, uma bobina de diâmetro maior com a mesma geometria que uma bobina de diâmetro menor, executada no mesmo sistema, teria uma menor força de campo no centro da bobina. Assim, o tamanho e a força do campo magnético necessários são limitados pela capacidade do gerador AMF. Construir uma bobina maior e usar mais energia leva a preocupações adicionais, principalmente aquecimento por correntes parasitas.
Existem várias preocupações de segurança que devem ser abordadas ao usar esse sistema para proteger usuários, animais e o próprio sistema. Primeiro, a ventilação adequada da sala deve ser mantida durante o uso da anestesia. Em segundo lugar, todas as áreas associadas à bobina devem estar livres de metal e/ou condutores, incluindo misturas salinas elevadas. Os usuários devem remover anéis e outras joias ao trabalhar em torno do AMF, e as amostras não devem conter nenhum tipo de metal. Da maior importância, as pessoas com marcapassos ou outros dispositivos ou objetos implantados devem consultar seu médico antes de trabalhar em torno do AMF. Para proteger o sistema, um sistema à prova de falhas deve ser usado para garantir que as necessidades de resfriamento do gerador e da bobina sejam atendidas antes que a energia seja aplicada. Além disso, uma visão geral da câmera térmica deve ser usada para detectar o aquecimento não intencional.
Para estudos in vitro, os passos mais importantes a seguir são a concentração de ferro nas células, a concentração de células, os parâmetros de FMA e a avaliação da dose térmica. As células podem ser tratadas/aquecidas com hipertermia de nanopartículas magnéticas, colocando as nanopartículas magnéticas no sobrenadante, células ou ambos. A quantidade de aquecimento de nanopartículas magnéticas dependerá do nível de nanopartículas magnéticas/Fe. Se o desejo é tratar apenas células com ferro internalizado, nossa experiência é que as células cancerosas individuais só absorverão um número limitado de nanopartículas magnéticas e que, mesmo quando a absorção é ótima, as células devem ser agregadas / peletizadas para criar uma situação de aquecimento celular, mesmo com FMA otimizada. Manter a temperatura do meio e das células em níveis biologicamente relevantes (quando não estão sendo aquecidos) também é importante para a medição precisa do aquecimento verdadeiro. A bobina solenoide de 14 voltas descrita aqui permite que temperaturas biologicamente relevantes sejam mantidas submergindo as amostras em uma coluna de água controlada termicamente.
Para os estudos in vivo, manter a temperatura central do animal e medir com precisão a temperatura dentro do tumor são fatores-chave. Este sistema de contenção animal e o design da bobina eliminam a deriva térmica no ambiente do animal devido às configurações de bobina / energia e ajudam a manter a temperatura corporal central normal. Manter a temperatura central do corpo é fundamental para resultados significativos do experimento. A sonda retal permite o monitoramento em tempo real da temperatura central do animal. Quando sob anestesia, a temperatura central de um animal diminui inerentemente. Para resolver essa situação, desenvolvemos um sistema de aquecimento ambiental que fornece ar quente ao redor do recipiente de contenção animal, permitindo que a temperatura central permaneça na faixa normal. Manter a temperatura central normal é essencial para garantir uma interpretação precisa dos resultados do tratamento da hipertermia e a eliminação de fatores ambientais. A colocação das sondas de monitoramento de temperatura em vários locais no tecido/tumor alvo é importante para obter uma avaliação precisa da temperatura e da dose térmica alcançada. Como é extremamente difícil, se não impossível, distribuir nanopartículas magnéticas de forma homogênea dentro de um tumor, conhecer os parâmetros de aquecimento em vários locais é essencial para alcançar uma dose térmica consistente e precisa de tecido/tumor. É importante notar que a concentração para estudos in vitro e in vivo é variável. Essa variação ocorre porque há menos limites na cultura de células, com as células tendo mais acesso aos mNPs, de modo que uma concentração menor pode ser usada. In vivo, uma maior concentração é necessária devido à natureza heterogênea dos tumores e à complicada morfologia 3D. Portanto, usar a mesma concentração de partículas in vivo e in vitro levaria a muito menos sendo absorvido pelas células.
Este manuscrito descreve os parâmetros e a instrumentação necessários para desenvolver um gerador de campo magnético alternado eficaz e flexível e um sistema de bobinas para tratamentos de hipertermia de nanopartículas magnéticas. Este sistema pode ser utilizado para estudos in vitro e in vivo. O sistema é eficaz para hipertermia localizada/direcionada e a preservação de tecido normal, tornando-o atraente, em comparação com outros sistemas de hipertermia AMF-mNP. Esses tratamentos de hipertermia podem ser alterados para investigar os efeitos de diferentes doses, com uma variedade de nanopartículas ou nanocarreadores e tratamentos adjuntos. Como o aquecimento tecidual, especialmente o aquecimento de nanopartículas magnéticas, pode ser afetado por tantas variáveis, é essencial entender os parâmetros em uma investigação. Se esses critérios forem atendidos, a hipertermia de nanopartículas magnéticas pode abordar muitas situações moleculares, celulares e clínicas, incluindo o controle independente e adjuvante do tumor. Embora os métodos aqui descritos exijam um esforço significativo, se as diretrizes forem seguidas, todo o potencial da hipertermia mNP pode ser realizado.

A hipertermia tem sido historicamente usada na terapia do câncer, isoladamente ou em combinação com outros tratamentos. Embora tenha uma longa história de uso, o método mais vantajoso para a entrega deste tratamento ainda está sendo debatido e depende do local e localização da doença. Os métodos de entrega de hipertermia incluem micro-ondas, radiofrequência, ultrassom focalizado, laser e nanopartículas metálicas (como ouro ou óxido de ferro)1,2,3,4. Esses métodos de entrega podem levar a uma variedade de temperaturas de tratamento desde o nível da febre até centenas de graus C. O efeito biológico da hipertermia depende principalmente das temperaturas utilizadas e da duração do tratamento5. Para este manuscrito e propósito, estamos nos concentrando na hipertermia de nanopartículas magnéticas (mNPH). Este método permite mudanças de temperatura focadas, localizadas, bem monitoradas e controladas, usando nanopartículas de óxido de ferro não tóxicas, aprovadas pela FDA.
Uma armadilha de outras modalidades de hipertermia é a falta de direcionamento celular preciso; a hipertermia não tem uma razão terapêutica inerentemente alta, portanto, é necessária uma termometria e direcionamento cuidadosos6. A mNPH permite a injeção sistêmica ou intratumoral de mNPs, com o calor sendo gerado apenas onde as mNPs estão localizadas, direcionando assim o tratamento diretamente para o tumor. O mNPH pode ser eficaz quando as nanopartículas magnéticas estão localizadas dentro ou fora da célula. Para a terapia do câncer, a visão geral da mNPH é que as nanopartículas magnéticas são injetadas (intratumoral ou intravenosamente), em seguida, um campo magnético alternado é aplicado, fazendo com que os polos magnéticos das nanopartículas se realinhem constantemente, levando a um aquecimento localizado das células e tecidos associados às nanopartículas 7,8 . Ajustando o volume de nanopartículas e a frequência/intensidade do campo magnético alternado (FMA), é possível controlar cuidadosamente a temperatura gerada dentro do tecido.
Esse tratamento funciona bem em tumores que estão próximos à superfície corporal, pois tumores mais profundos requerem FMA mais forte, de modo que o risco de aquecimento por correntes parasitas aumenta9. Há evidências de hipertermia sendo utilizada clinicamente como monoterapia, no entanto, muitas vezes a hipertermia é combinada com radioterapia ou quimioterapia, levando a um efeito anticâncer mais direcionado10,11,12. Evidências clínicas de hipertermia trabalhando em combinação com radioterapia são revisadas em publicação anterior13. Nosso laboratório tem tratado com sucesso uma variedade de animais, de camundongos a porcos e cânceres caninos espontâneos, utilizando o método mNPH12,14,15. Este protocolo é projetado para aqueles interessados em investigar os efeitos do tratamento da hipertermia localizada, isoladamente ou em combinação com outras terapias.
Um dos fatores mais importantes na hipertermia é ser capaz de medir e entender, em tempo real, a dose térmica que está sendo entregue ao tecido alvo / tumoral. Uma forma normalizada de calcular e comparar a dose é através da demonstração dos minutos equivalentes cumulativos de aquecimento a 43 °C; esse algoritmo permite a comparação de doses independentes do sistema de entrega, temperaturas máximas e mínimas (dentro de uma faixa específica) e parâmetros de aquecimento/resfriamento 5,16. O cálculo CEM funciona melhor para temperaturas entre 39-57 °C5. Por exemplo, em alguns dos estudos que realizamos, escolhemos uma dose térmica de CEM43 30 (ou seja, 30 min a 43 °C). A escolha dessa dose permitiu observar efeitos imunogenéticos seguros, eficazes e in vitro, tanto isoladamente quanto em combinação com uma dose única de radiação17.
Com a hipertermia de nanopartículas magnéticas, existem vários fatores que precisam ser considerados na construção de um sistema de entrega apropriado. O projeto de instrumentação inclui importantes fatores de segurança, como o uso de um resfriador para garantir que o equipamento de entrega de campo magnético permaneça frio mesmo quando operado em alta potência e procedimentos à prova de falhas que impedem que o sistema seja ligado se todos os sistemas de temperatura, avaliação de energia e controle não tiverem sido ativados. Além disso, existem fatores biológicos importantes que precisam ser considerados para situações in vivo e in vitro. Ao usar células cultivadas, é necessário tratar em meios de crescimento e manter a uma temperatura viável consistente para evitar alterações fisiológicas que possam afetar os resultados. Para tipos individuais de nanopartículas, é importante conhecer a taxa de absorção específica (SAR) ao calcular os parâmetros de aquecimento baseados em FMA. Da mesma forma, é importante conhecer a concentração de mNP/Fe, em células e tecidos, que é necessária para alcançar o aquecimento desejado. Os métodos in vivo requerem ainda mais atenção aos detalhes, uma vez que o animal deve ser mantido sob anestesia durante o tratamento e a temperatura corporal central do animal mantida em um nível normal durante todo o tratamento. Permitir que a temperatura corporal do animal caia, como acontece sob anestesia, pode afetar os resultados gerais, no que diz respeito à dose térmica do tecido a ser tratado.
Neste manuscrito, discutimos os métodos utilizados para projetar e construir um versátil sistema de hipertermia de nanopartículas magnéticas, bem como importantes fatores de uso que precisam ser considerados. O sistema descrito permite a entrega robusta, consistente, biologicamente apropriada, segura e bem controlada da hipertermia de nanopartículas magnéticas. Finalmente, deve-se notar que os estudos de mNPH que conduzimos geralmente envolvem outras terapias, como radiação, quimioterapia e imunoterapia. Para que esses resultados sejam significativos, é importante determinar como o calor fornecido pode afetar a eficácia e/ou a toxicidade de segurança de outras modalidades (ou vice-versa) e o bem-estar do animal. Por esta razão e pela dosimetria e situações terapêuticas anteriormente mencionadas, é essencial prestar muita atenção à precisão da dosagem de hipertermia de nanopartículas magnéticas e às medições contínuas de temperatura central e alvo. O objetivo deste protocolo é fornecer um método e uma descrição simples e consistentes para a entrega de hipertermia segura e eficaz de nanopartículas magnéticas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>.25% Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-664</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf 22363204</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16F10 murine melanoma cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-6475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/Bl6 mice</td>
			<td>Charles river</td>
			<td>027C57BL/6</td>
			<td>6-week-old female mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chiller</td>
			<td>Thermal Care</td>
			<td>NQ 5 series</td>
			<td>chiller that cools the coil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coolant fluid</td>
			<td>Dow Chemical Company</td>
			<td>Dowtherm SR-1</td>
			<td>antenna cooling fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fiber optic probes, software and chassis</td>
			<td>FISO</td>
			<td></td>
			<td>FISO evolution software used to read the temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR camera</td>
			<td>Flir</td>
			<td></td>
			<td>infrared camera to monitor unintentional heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iron oxide nanoparticles</td>
			<td>micromod Partikeltechnologie GmbH</td>
			<td>Bionized NanoFerrite</td>
			<td>dextran coated iron oxide nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse coil, solenoid</td>
			<td>Fluxtrol</td>
			<td>custom built</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-652</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF generator</td>
			<td>Huttinger</td>
			<td>TIG 10/300</td>
			<td>power source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI media</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-396</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo delivery of magnetic nanoparticle hyperthermia using a custom-built delivery system

A hipertermia tem sido usada há muito tempo no tratamento do câncer. As técnicas têm variado desde a inserção intratumoral de barras de ferro quente, até nanopartículas magnéticas direcionadas a anticorpos tumorais administradas sistemicamente, a temperaturas de 39 °C (nível de febre) a 1.000 °C (eletrocautério) e tempos de tratamento de segundos a horas. A relação temperatura-tempo (dose térmica) dita o efeito com altas doses térmicas, resultando na ablação tecidual e doses térmicas mais baixas, resultando em efeitos subletais, como aumento do fluxo sanguíneo, acúmulo de drogas e estimulação imunológica. Uma das terapias médicas atuais mais promissoras é a hipertermia de nanopartículas magnéticas (mNPH). Esta técnica envolve a ativação de nanopartículas magnéticas, que podem ser entregues sistemicamente ou intratumoralmente, com um campo magnético alternado não invasivo e não tóxico. O tamanho, a construção e a associação das nanopartículas magnéticas e a frequência e a intensidade do campo magnético são os principais determinantes do aquecimento. Desenvolvemos instrumentação e técnicas sofisticadas para fornecer hipertermia de nanopartículas magnéticas reprodutíveis em modelos animais grandes e pequenos e células cultivadas. Essa abordagem, usando monitoramento contínuo e em tempo real da temperatura em vários locais, permite a entrega de doses térmicas bem definidas para o tecido alvo (tumor) ou células, limitando o aquecimento do tecido não alvo. O controle e o monitoramento precisos da temperatura, em vários locais, e o uso do algoritmo padrão da indústria (minutos equivalentes cumulativos a 43 °C /CEM43) permitem uma determinação e quantificação precisas da dose térmica. Nosso sistema, que permite uma ampla variedade de temperaturas, doses térmicas e efeitos biológicos, foi desenvolvido por meio de uma combinação de aquisições comerciais e desenvolvimentos internos de engenharia e biologia. Este sistema foi otimizado de uma forma que permite a rápida conversão entre técnicas ex vivo, in vitro e in vivo. O objetivo deste protocolo é demonstrar como projetar, desenvolver e implementar uma técnica e um sistema eficazes para fornecer hipertermia reprodutível e precisa da terapia de nanopartículas magnéticas (mNP).

Estudos in vitro As células só alcançarão e manterão a temperatura e a dose térmica desejadas se a quantidade e a concentração das nanopartículas magnéticas/ferro e do FMA forem adequadamente combinadas. Ao usar nanopartículas magnéticas para aquecer células in vitro (e in vivo), deve-se notar que, para alcançar a hipertermia em células com nanopartículas magnéticas internalizadas, será necessário um nível específico de mNP/Fe intracelular, e o número e a proximidade de células carregadas de mNP, entre si, serão necessários. Se o nível de mNP/Fe nas células/tecidos-alvo for suficiente para alcançar um efeito de aquecimento, a frequência e a intensidade do campo magnético podem ser ajustadas para atingir a temperatura e os efeitos desejados. Se banhados corretamente, estudos adicionais que analisam as diferenças genéticas e moleculares entre diferentes doses e tempos podem ser realizados17. A Figura 1 representa um esquema dos métodos in vitro.
Esses métodos in vitro podem ser usados para investigar o mRNA celular e a mudança na expressão de proteínas. Um exemplo recente do nosso laboratório determinou diferenças imunogenéticas após o tratamento CEM43 30 mNPH, um tratamento de radiação de 8 Gy e a combinação. Conseguimos identificar semelhanças e diferenças na expressão entre as vias imunes e citotóxicas para obter uma melhor compreensão do mecanismo por trás dos efeitos e como eles se combinam sinergicamente17. Cada experimento utiliza uma variedade de amostras de controle ambientalmente e aquecidas. Os controles terão diferentes níveis de mRNA e expressão de proteínas em comparação com aqueles que recebem tratamento de hipertermia.
Estudos in vivo Em estudos in vivo, há considerações adicionais. Independentemente da dose térmica alvo, é absolutamente essencial manter uma temperatura central fisiologicamente aceitável no animal a ser tratado. Isso pode ser um desafio com roedores sob anestesia, pois a temperatura central pode ser rapidamente perdida (técnicas de modulação de temperatura central, como almofadas de aquecimento, são frequentemente necessárias). Temperaturas corporais mais baixas do que o normal podem exigir a necessidade de empurrar o AMF-mNPH muito longe, ao tentar atingir uma dose térmica específica no tumor, resultando em efeitos inaceitáveis no tecido não alvo (o aquecimento da corrente parasita do tecido não alvo é uma dessas possibilidades). Mesmo pequenos desvios na temperatura corporal central podem levar a complicações fisiológicas indesejáveis no tumor ou tecido normal. Como mencionado anteriormente, no entanto, vale a pena repetir, para um aquecimento preciso e reprodutível, é essencial alcançar uma correspondência entre a concentração tecidual mNP / Fe, a frequência AMF e os parâmetros de monitoramento de temperatura da força do campo e o tamanho e a profundidade do tecido alvo. Deve haver uma concentração basal de mNPs dentro do tumor para permitir um aquecimento mensurável. O nível/capacidade de calor depende não apenas da concentração tecidual de mNP (mg Fe/g de tecido) e sua distribuição relativa dentro do tumor, mas também da frequência do FMA e da força de campo subsequente. Alterações em qualquer um dos itens acima podem levar a diferentes faixas de temperaturas atingíveis dentro do tecido. Através de muitos anos de experiência, otimizamos a concentração que usamos para tratamentos pré-clínicos de tumores e a frequência e a força de campo do sistema AMF para permitir uma ativação segura e eficaz. Como é impossível medir a temperatura/dose térmica em todos os locais teciduais, também é essencial colocar o maior número possível de sondas de temperatura de fibra óptica em locais estratégicos que permitam a avaliação de eficácia e segurança em tempo real, como visto na Figura 2. Essas sondas permitem o registro de temperaturas ao longo do experimento, permitindo dosimetria precisa e histórico térmico do experimento. A Figura 3 demonstra as curvas geradas durante um experimento in vivo, destacando a capacidade de monitorar de perto a temperatura e ajustar o sistema para manter as temperaturas do tumor dentro da faixa desejada. A Figura 4 resume os métodos in vivo.
Estes métodos in vivo, semelhantes aos métodos in vitro, podem ser usados para investigar diferentes tipos de câncer, diferentes doses de hipertermia e com vários tratamentos combinados. Por exemplo, estudos prévios em nosso laboratório investigaram a combinação de hipertermia e quimioterapia12. Também concluímos numerosos experimentos de hipertermia e radiação para a determinação da eficácia e dos mecanismos moleculares. Os ratos de controle para esses experimentos passam por todos os procedimentos, exceto para a geração real de hipertermia. A Figura 5 contém dois gráficos vulcânicos que demonstram genes diferencialmente expressos após o tratamento de hipertermia mNP in vitro e in vivo (mNPH). Essas figuras são exemplos de como usamos técnicas moleculares para monitorar os efeitos da hipertermia.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61413/61413fig01.jpg"> Figura 1: Esquema de hipertermia mNP in vitro. Este esquema demonstra o método para hipertermia de nanopartículas magnéticas in vitro. Para garantir que o aquecimento ocorra, as células devem receber partículas e tempo suficientes para a absorção adequada de mNP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61413/61413fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61413/61413fig02.jpg"> Figura 2: Colocação de cateteres para monitoramento de temperatura. Esta figura demonstra a colocação de cateteres que abrigam as sondas de temperatura de fibra óptica para registrar temperaturas em diferentes locais do tumor e/ou da região tumoral. Este valor é adaptado da ref.19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61413/61413fig02large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61413/61413fig03.jpg"> Figura 3: Monitoramento da temperatura em tempo real durante o tratamento de um tumor de camundongo. Este gráfico demonstra as leituras de temperatura em tempo real que permitem monitorar a temperatura corporal central, as temperaturas ambientais e as múltiplas temperaturas dentro do tumor, durante um experimento in vivo. O controle das temperaturas dentro do tumor é demonstrado através das variações mínimas em larga escala na porção ampliada da figura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61413/61413fig03large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61413/61413fig04.jpg"> Figura 4: Esquema de hipertermia mNP in vivo. Este esquema demonstra o método para hipertermia de nanopartículas magnéticas in vivo. A injeção de nanopartículas suficientes, bem como tempo suficiente para distribuição e absorção, garante a capacidade de fornecer a dose térmica desejada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61413/61413fig04large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61413/61413fig05.jpg"> Figura 5: Expressão gênica diferencial. Expressão gênica diferencial após tratamento de hipertermia mNP in vitro (A) e in vivo (B). Essas parcelas vulcânicas representam mudanças genéticas em um eixo x log 2, com significância no eixo y, tanto para métodos mNPH in vitro quanto in vivo. Cada círculo representa um gene diferente, com os 20 genes diferencialmente expressos mais significativos marcados. Quanto mais longe o gene é de zero no eixo x, maior a mudança da dobra, e quanto maior o gene está no eixo y, menor o valor de p. Embora ambos tivessem a mesma dose térmica, a hipertermia in vivo levou a maiores alterações na expressão gênica do que in vitro. Esses gráficos são exemplos dos dados biológicos que podem ser gerados usando o protocolo descrito. A parcela do vulcão in vitro foi adaptada da ref.17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61413/61413fig05large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Arquivo Suplementar 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61413/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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In Vitro and In Vivo Delivery of Magnetic Nanoparticle Hyperthermia Using a Custom-Built Delivery System

Este protocolo apresenta técnicas e metodologia necessárias para a entrega precisa de hipertermia de nanopartículas magnéticas usando um sofisticado sistema de entrega e monitoramento.

Entrega In Vitro e In Vivo de Hipertermia de Nanopartículas Magnéticas usando um Sistema de Entrega Personalizado

Hyperthermia has long been used in the treatment of cancer. Techniques have varied from the intra-tumoral insertion of hot iron rods, to systemically ...

in-vitro-vivo-delivery-magnetic-nanoparticle-hyperthermia-using

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

4.2K visualizações.  Dartmouth College. Este protocolo apresenta técnicas e metodologia necessárias para a entrega precisa de hipertermia de nanopartículas magnéticas usando um sofisticado sistema de entrega e monitoramento.

Vídeo: In Vitro and In Vivo Delivery of Magnetic Nanoparticle Hyperthermia Using a Custom-Built Delivery System

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery. Fresh patient tissue obtained at the time of surgery is sliced and maintained in culture. The ex vivo model system allows for the physical delivery of genes into intact patient tissue and gene expression is analysed by bioluminescence imaging using the IVIS detection system. The bioluminescent detection system demonstrates rapid and accurate quantification of gene expression within individual slices without the need for tissue sacrifice. This slice tissue culture system may be used in a variety of tissue types including normal and malignant tissue and allows us to study the effects of the heterogeneous nature of intact tissue and the high degree of variability between individual patients. This model system could be used in certain situations as an alternative to animal models and as a complementary preclinical mode prior to entering clinical trial.

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

This article describes the culture of patient tissue slices for gene delivery studies and subsequent analysis of gene expression using IVIS bioluminescence imaging.

Ex Cultura Vivo de tecido do paciente e Exame de Entrega Gene

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Medicina

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

Multi-modal de imagem de angiogênese em um modelo de rato nu de Câncer de mama utilizando a ressonância magnética, tomografia computadorizada volumétrica e ultra-som

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue revascularization and cell survival. In addition, further observations revealed that specific stem cells, such as cardiac stem cells, mesenchymal stem cells and cardiospheres have the ability to integrate within the surrounding myocardium by differentiating into cardiomyocytes, smooth muscle cells and endothelial cells.
Here, we present the materials and methods to reliably deliver noncontractile cells into the left ventricular wall of immunodepleted mice. The salient steps of this microsurgical procedure involve anesthesia and analgesia injection, intratracheal intubation, incision to open the chest and expose the heart and delivery of cells by a sterile 30-gauge needle and a precision microliter syringe.
Tissue processing consisting of heart harvesting, embedding, sectioning and histological staining showed that intramyocardial cell injection produced a small damage in the epicardial area, as well as in the ventricular wall. Noncontractile cells were retained into the myocardial wall of immunocompromised mice and were surrounded by a layer of fibrotic tissue, likely to protect from cardiac pressure and mechanical load.

Intramyocardial cell delivery in murine models of cardiovascular diseases, such as hypertension or myocardial infarction, is widely used to test the therapeutic potential of different cell types in regenerative studies. Therefore, a detailed description and a clear visualization of this surgical procedure will help to define the limits and advantages of cardiovascular cell therapeutic analyses in small rodents.

Entrega celular intramiocárdico: Observações em murino Corações

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these diseases. Chronic retinal diseases such as retinal oedema or neovascularization usually require multiple intraocular injections to effectively treat the condition. However, the risks associated with these injections increase with repeated delivery of the drug. Therefore, alternative delivery methods need to be established in order to minimize the risks of reinjection. Several other investigations have developed methods to deliver drugs over extended time, through materials capable of releasing chemicals slowly into the eye. In this investigation, we outline the use of Elvax 40W, a copolymer resin, to act as a vehicle for drug delivery to the adult rat retina. The resin is made and loaded with the drug. The drug-resin complex is then implanted into the vitreous cavity, where it will slowly release the drug over time. This method was tested using 2-amino-4-phosphonobutyrate (APB), a glutamate analogue that blocks the light response of the retina. It was demonstrated that the APB was slowly released from the resin, and was able to block the retinal response by 7 days after implantation. This indicates that slow-release drug delivery using this copolymer resin is effective for treating the retina, and could be used therapeutically with further testing.

This paper details how Elvax 40W can be used as a slow-release method for drug delivery to the adult rat retina. The protocol for preparing, loading, and delivering the drug-resin complex to the eye is described.

De liberação lenta Drug Delivery através Elvax 40W para o Rat Retina: implicações para o tratamento de condições crônicas

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences between the murine and human respiratory systems, especially in their upper respiratory tracts (URT). In some models, these differences in the murine nasal cavity can have a significant impact on disease progression and presentation in the lower respiratory tract (LRT) when using intranasal instillation techniques, potentially limiting the usefulness of the mouse model to study these diseases. For these reasons, it would be advantageous to develop a technique to instill bacteria directly into the mouse lungs in order to study LRT disease in the absence of involvement of the URT. We have termed this lung specific delivery technique intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation. This noninvasive technique minimizes the potential for instillation into the bloodstream, which can occur during more invasive traditional surgical intratracheal infection approaches, and limits the possibility of incidental digestive tract delivery. IMIT is a two-step process in which mice are first intubated, with an intermediate step to ensure correct catheter placement into the trachea, followed by insertion of a blunt needle into the catheter to mediate direct delivery of bacteria into the lung. This approach facilitates a &#62;98% efficacy of delivery into the lungs with excellent distribution of reagent throughout the lung. Thus, IMIT represents a novel approach to study LRT disease and therapeutic delivery directly into the lung, improving upon the ability to use mice as surrogates to study human respiratory disease. Furthermore, the accuracy and reproducibility of this delivery system also makes it amenable to Good Laboratory Practice Standards (GLPS), as well as delivery of a wide range of reagents which require high efficiency delivery to the lung.

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation of reagents is an excellent, noninvasive method for studying respiratory disease, as well as a method for instilling therapeutic reagents directly into the lung. It is a rapid and highly reproducible method which is suitable for preclinical testing.

Intratraqueal (IMIT) instilação mediada por intubação: A não-invasiva, sistema de entrega Lung-specific

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Telemetria Intrauterine medir Rato contrátil Pressão<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Depleção de células do rato de xenoenxertos de tumor humano Melhora Significativamente Análise Downstream de células alvo

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Using Multi-fluorinated Bile Acids and In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Measure Bile Acid Transport

Along with their traditional role as detergents that facilitate fat absorption, emerging literature indicates that bile acids are potent signaling molecules that affect multiple organs; they modulate gut motility and hormone production, and alter vascular tone, glucose metabolism, lipid metabolism, and energy utilization. Changes in fecal bile acids may alter the gut microbiome and promote colon pathology including cholerrheic diarrhea and colon cancer. Key regulators of fecal bile acid composition are the small intestinal Apical Sodium-dependent Bile Acid Transporter (ASBT) and fibroblast growth factor-19 (FGF19). Reduced expression and function of ASBT decreases intestinal bile acid up-take. Moreover, in vitro data suggest that some FDA-approved drugs inhibit ASBT function. Deficient FGF19 release increases hepatic bile acid synthesis and release into the intestines to levels that overwhelm ASBT. Either ASBT dysfunction or FGF19 deficiency increases fecal bile acids and may cause chronic diarrhea and promote colon neoplasia. Regrettably, tools to measure bile acid malabsorption and the actions of drugs on bile acid transport in vivo are limited. To understand the complex actions of bile acids, techniques are required that permit simultaneous monitoring of bile acids in the gut and metabolic tissues. This led us to conceive an innovative method to measure bile acid transport in live animals using a combination of proton (1H) and fluorine (19F) magnetic resonance imaging (MRI). Novel tracers for fluorine (19F)-based live animal MRI were created and tested, both in vitro and in vivo. Strengths of this approach include the lack of exposure to ionizing radiation and translational potential for clinical research and practice.

Using Multi-fluorinated Bile Acids and In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Measure Bile Acid Transport

Tools to diagnose bile acid malabsorption and measure bile acid transport in vivo are limited. An innovative approach in live animals is described that utilizes combined proton (1H) plus fluorine (19F) magnetic resonance imaging; this novel methodology has translational potential to screen for bile acid malabsorption in clinical practice.

Utilizando os ácidos biliares e multi-fluorados<em&gt; In Vivo</em&gt; Magnetic Resonance Imaging medir Bile transporte do ácido

Along with their traditional role as detergents that facilitate fat absorption, emerging literature indicates that bile acids are potent signaling ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

Método otimizado de LC-MS/MS para a análise do elevado-throughput de amostras clínicas de Ivacaftor, seus principais metabolitos e Lumacaftor em fluidos biológicos de pacientes de fibrose cística

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Melhor método para o estabelecimento de uma In Vitro barreira hemato - encefálica modelo baseado em células endoteliais do cérebro de suínos

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Entrega In Vitro e In Vivo de Hipertermia de Nanopartículas Magnéticas usando um Sistema de Entrega Personalizado

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