Die Studie wurde durch die Fördernummern NCI P30 CA023108 und NCI U54 CA151662 finanziert.

Das Dartmouth College Animal Care and Use Program ist von der American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care (iAAALAC) akkreditiert und hält sich an alle Richtlinien und Vorschriften von UDSA und NIH (Office of Laboratory Animal Welfare). Alle In-vivo-Studien wurden vom Dartmouth College Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. Das Euthanasieverfahren entspricht den AVMA-Richtlinien für die Euthanasie von Tieren aus dem Jahr 2020.
1. Instrumentierung/Aufbau des Systems
<ol><li>Entwerfen Sie eine benutzerdefinierte AMF-Antenne (Spule) als geschlossene Schleife und wählen Sie Formen aus, um das gewünschte Magnetfeld zu erzeugen. Verwenden Sie Induktivitätsformeln und Eigenschaften aus der Auswahl des Stromgenerators, um kompatible Spulen zu entwerfen, um das gewünschte Feld zu erzeugen. Verwenden Sie unterschiedliche Designs für In-vitro- und In-vivo-Experimente.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Induktivität der AMF-Antenne innerhalb des akzeptablen Bereichs des Stromgenerators liegt. Fügen Sie Kondensatoren hinzu oder subtrahieren Sie sie, um die Antenne an den Stromgenerator anzupassen (abzustimmen).</li>
	<li>Entwerfen Sie für In-vitro-Experimente eine spiralförmige Spule mit 14 Windungen und einem Innendurchmesser von 2 cm und einer Länge von 14 cm, die 1,5-ml-Röhrchen enthalten kann, so dass mehrere Proben gleichzeitig behandelt werden können. Isolieren Sie die Spule mit einem Vinylpolymer und verwenden Sie einen Styropor-Abstandhalter, um die Spule von den Rohren zu trennen. Einzelheiten zu den Entwurfsspezifikationen und -überlegungen sind in der Zusatzdatei 1 enthalten.</li>
	<li>Erwerben Sie für In-vivo-Experimente eine speziell angefertigte Ganzkörper-Spiralspule von einem Hersteller mit proprietären Designinformationen. Verwenden Sie einen 8-mm-Vierkantschlauch (da dies ein gleichmäßigeres Feld innerhalb der Bohrung der Spule erzeugt) und einen Konzentrator im Zielbehandlungsbereich. Machen Sie den Konzentrator 5,0 cm lang, mit insgesamt 5 Umdrehungen, was zu einem Innendurchmesser von 3,6 cm und einem Außendurchmesser von 5,2 cm führt, und positionieren Sie sich im Zielbereich. Umgeben Sie die Spule mit einer Polycarbonat-Schale.</li>
	<li>Verwenden Sie einen AMF-Generator mit einstellbarer Leistung und Frequenz von 10 kW oder mehr als Stromquelle. Die Induktivität passt die Stromquelle und die Antennen/Spulen auf einen Bereich von 0,62 bis 1,18 μHenries (μH) an, was Frequenzen zwischen 30 und 300 kHz ermöglicht. Kühlen Sie den Generator mit recyceltem Wasser durch eine Zentrifugalpumpe, deren Druck auf 50 psi geregelt ist.</li>
	<li>Kühlen Sie die Spulen mit einem Kühler mit einer Kühlleistung von 5,6 Tonnen, der 25% Wärmeträgerflüssigkeit auf Ethylenglykolbasis, die mit Wasser verdünnt ist, durch die AMF-Antenne pumpt. Stellen Sie die Temperatur des Kühlers so ein, dass die Antenne die Probe nicht erwärmt oder kühlt.</li>
	<li>Für die Tiereindämmung konstruieren Sie einen schlauchförmigen Halter, der in der Mitte der Spule mit einem Luftspalt von 0,5 cm zwischen dem Halter und der Spulenoberfläche aufgehängt werden kann. Schließen Sie eine einstellbare konditionierte Luftpumpe an, die Luft durch die Schale um die Spule zirkulieren lässt, und stellen Sie sie so ein, dass sie eine normale Tierkerntemperatur aufrechterhält. Verbinden Sie das Anästhesiegerät mit dem röhrenförmigen Tierhalter in der Nähe des Kopfes des Tieres, um eine ordnungsgemäße Anästhesie zu gewährleisten.</li>
	<li>Erstellen Sie für die Zelleindämmung eine Vorrichtung, die Wasser aus einem Wasserbad durch den Abstandshalter zirkulieren lässt, in dem sich die Schläuche befinden. Stellen Sie die Temperatur dieses Wasserbades so ein, dass die Rohre von Wasser bei 37 °C umgeben sind.</li>
	<li>Verwenden Sie faseroptische Sonden, um die Temperaturen innerhalb des Tumors, des Tierkerns und der Tierumgebung zu überwachen, oder für In-vitro-Studien, um die Temperatur des Zellpellets und des Wassers, das die Röhrchen umgibt, zu überwachen.</li>
	<li>Verwenden Sie magnetische Eisenoxid-Nanopartikel mit einer Größe von 100 nm für alle Experimente. ANMERKUNG: Konzentration und spezifische Absorptionsrate (SAR) sind zwei Merkmale, die bei der Auswahl von Nanopartikeln berücksichtigt werden müssen, da sie sich direkt auf die mögliche Wärme- und Wärmedosis auswirken18.</li>
</ol>2. Hyperthermie in vitro
<ol><li>Kultur B16F10 murine Melanomzellen in RPMI-Medien mit 10% FBS und 1% Pen/Streptokokken. Platte 150.000 Zellen/Well in 6-Well-Platten mit 2 mL vollständigem Medium.</li>
	<li>Bestimmen Sie die geeignete Behandlung für jede Vertiefung, d.h. Zellen ohne mNPs und ohne AMF, Zellen mit mNPs und ohne AMF, Zellen ohne mNPs und AMF, Zellen mit mNPs und AMF. HINWEIS: Stellen Sie außerdem sicher, dass geeignete Kontrollen vorhanden sind, wenn Sie Hyperthermie mit einer anderen Therapie kombinieren. AMF wird in einem Standard-Forschungslabor durchgeführt, das mit den erforderlichen Strom- und Kühlkapazitäten nachgerüstet ist.</li>
	<li>24 Stunden nach der Beschichtung mNPs in die entsprechenden Vertiefungen geben, wie im vorherigen Schritt bestimmt. Fügen Sie mNPs zu einer Konzentration von 3 mg Eisen / ml hinzu. Stellen Sie sicher, dass die mNPs im gesamten Bohrloch verteilt sind, indem Sie entweder eine Standardmedien/mNP-Lösung erstellen (alte Medien entfernen, diese Lösung hinzufügen) oder indem Sie die mNPs direkt und sanft wirbelnde Platten hinzufügen, um eine homogene Verteilung zu gewährleisten.</li>
	<li>Beginnen Sie die Behandlung 48 Stunden nach der Zugabe von mNPs, wenn die Wells ~ 80% konfluent sind, indem Sie das Medium entfernen und die Wells mit frischen Medien waschen. Entfernen Sie das Medium.</li>
	<li>Fügen Sie 0,5 ml Trypsin zu jedem behandelten Wohlbefinden hinzu und schwenken Sie es sanft. Verwenden Sie ein Mikroskop, um zu überprüfen, ob die Zellen abgelöst sind.</li>
	<li>Geben Sie 1 ml Medium in jede Vertiefung, um die Zellen in 1,5-ml-Röhrchen zu sammeln. Sammeln Sie alle Zellen aus dem Brunnen (~ 1 x 106 Zellen). Verwenden Sie für jede Vertiefung ein deutlich beschriftetes separates Röhrchen.</li>
	<li>Spinnröhrchen bei 60 x g für 2-3 min, damit die Zellen pelletieren können. Bewahren Sie das Pellet im Medium auf.</li>
	<li>Legen Sie die Schläuche in den mit Wasser gefüllten Abstandhalter in der Spule. Stellen Sie die Temperatur des Wasserbades so ein, dass das Medium und das Zellpellet auf 37 °C gehalten werden. Überwachen Sie die Temperatur innerhalb der Röhre und des Wasserbades mit separaten faseroptischen Temperaturfühlern.</li>
	<li>Schalten Sie den Kühler ein und überprüfen Sie, ob das Kühlmittel durch die Spule fließt. Schalten Sie die Stromquelle ein, und stellen Sie den Prozentsatz des Maximums auf das gewünschte Feld ein. Betreiben Sie die 14-Gang-Magnetspule, die von einem 10-kW-Generator gespeist wird, bei 165 kHz und 23,87 kA/m (300 Oe).</li>
	<li>Platzieren Sie einen separaten faseroptischen Temperaturfühler in einem der Rohre. Behandeln Sie die Zellen bis zur zuvor festgelegten thermischen Protokolldosis. Ein Beispiel ist 30 min bei 43 °C (CEM43 von 30).</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen in den Medien, die sich in ihren Röhrchen befinden, und beschichten Sie sie in neue 6-Well-Platten. Beschriften Sie die neuen Schilder deutlich. Das Ziel ist es, alle gesammelten Zellen (~ 1 x 106 Zellen) neu zu beschichten. HINWEIS: Es sollten neue 6-Well-Platten verwendet werden, um sicherzustellen, dass die zu kultivierenden Zellen behandelt werden. Wenn die alten Platten verwendet werden, können immer noch Zellen auf den Platten verbleiben, die nicht erfolgreich trypsinisiert wurden.</li>
	<li>Falls erforderlich, für das nächste experimentelle Verfahren, lysieren Sie die Zellen für die RNA- oder Proteinexpressionsanalyse.</li>
</ol>3. Hyperthermie in vivo
<ol><li>Zellkultur und Impfung<ol><li>Kultur B16F10 murine Melanomzellen in RPMI-Medien mit 10% FBS und 1% Pen/Streptokokken. Verwenden Sie Teller / Schüsseln, die genügend Zellen für die Impfung der gewünschten Anzahl von Tieren liefern. Zum Beispiel werden 10, 100 mm Schalen, die mit 100.000 Zellen plattiert sind, mit genügend Zellen für 20 Mäuseinjektionen innerhalb von 48 Stunden konfluieren.</li>
		<li>Trypsinisieren Sie die Zellen und sammeln Sie sie mit reinem RPMI-Medium (kein FBS oder Pen/Streptokokken).</li>
		<li>Zählen Sie die Zellen und erstellen Sie eine Lösung für die gewünschte Zellkonzentration, basierend auf dem Impfvolumen und der Anzahl der Mäuse.</li>
		<li>Betäuben Sie 6 Wochen alte weibliche C57Bl/6-Mäuse mit verdampftem Isofluran und Sauerstoff. Legen Sie die Tiere in einen Plexiglaskasten mit 5% Isofluran und 95% Sauerstoff, bis sie induziert sind. Nach der Induktion wird das Tier entnommen und ein Stirnkegel mit 2 % Isofluran verwendet, um die Schritte 3.1.5-3.1.7 und 3.3.3-3.3.6 abzuschließen. HINWEIS: Für die Anästhesie während der Behandlung verwenden Sie eine eingebaute Anästhesieeindämmung. Befolgen Sie die institutionellen Standardprotokolle für die Anästhesie der Maus. Stellen Sie vor dem Tierversuch eine entsprechende IACUC-Zulassung sicher. Bringen Sie das Tier nach der Anästhesie in den Käfig zurück und überwachen Sie die Genesung, um sicherzustellen, dass keine Komplikationen auftreten.</li>
		<li>Überprüfen Sie, ob Sie nicht auf die aufrichtenden Reflexe reagieren.</li>
		<li>Rasieren Sie die rechte Flanke mit einem Elektrorasierer.</li>
		<li>Reinigen Sie den Injektionsbereich mit einem Alkoholtupfer. Injizieren Sie 1-2 x 106 Zellen mit einer 100 μL Glasspritze mit einer 28 G Nadel, dispergiert in 50 μL Medien intradermal auf der rasierten rechten Flanke der Anästhesie.</li>
	</ol></li>
	<li>Tumorwachstum/Nanopartikel-Injektion<ol><li>Messen Sie Tumore in 3 Dimensionen mit Messschiebern (Länge, Breite und Tiefe) und berechnen Sie Volumina nach (Länge x Breite x Tiefe x π)/6.</li>
		<li>Wenn das Tumorvolumen 120 mm3 (+/- 20mm3) erreicht, werden die Tiere untersucht. Entwerfen Sie die Studie und stellen Sie sicher, dass es geeignete Kontroll- und Behandlungsgruppen gibt, einschließlich Kombinationstherapie-Kohorten (d. h. Kontrolle, mNPH, Bestrahlung und die Kombination).</li>
		<li>Betäubung von Mäusen, die mNPs erhalten, wie in 3.1.4 beschrieben.</li>
		<li>Reinigen Sie den Bereich mit einem Alkoholtupfer. Injizieren Sie mNPs 3 h vor der AMF-Behandlung in den Tumor. Injizieren Sie ein Volumen, so dass die Dosis 7,5 mg Eisen / cm3 des Tumors beträgt. HINWEIS: Unveröffentlichte Daten aus dem Labor deuten darauf hin, dass die maximale mNP-Aufnahme nach 3-6 Stunden erfolgt.</li>
	</ol></li>
	<li>AMF-Behandlung<ol><li>Betäuben Sie die Maus und legen Sie sie auf ein Heizkissen, um die Kerntemperatur aufrechtzuerhalten.</li>
		<li>Überprüfen Sie, ob Sie nicht auf die aufrichtenden Reflexe reagieren. Entfernen Sie die Ohrmarke oder andere Metallgegenstände an der Maus.</li>
		<li>Setzen Sie vorsichtig einen geschmierten faseroptischen Temperaturfühler in das Rektum der Maus ein.</li>
		<li>Legen Sie einen Katheter in den Tumor und entfernen Sie die Nadel. Schneiden Sie den Katheter so, dass er nicht zu sehr aus dem Tumor herausragt. HINWEIS: Die faseroptischen Temperaturkatheter werden platziert und entfernt, während sich die Mäuse unter Vollnarkose befinden, d.h. die Katheter sind nur während der Tumorerwärmung an Ort und Stelle. Mäuse erhalten zum Zeitpunkt des Eingriffs eine subkutane Einzeldosis eines NSAID-Analgesiemedikaments, Ketoprofen (5 mg/kg). Wir haben keine kurz- oder langfristigen Beschwerden oder Morbiditäten im Zusammenhang mit der Platzierung der Katheter beobachtet.</li>
		<li>Führen Sie einen faseroptischen 3-Sensor-Temperaturfühler in den Katheter ein. Der Katheter schützt die faseroptischen Temperaturfühlersensoren.</li>
		<li>Kleben Sie die rektale und intratumorale Sonde an den Schwanz des Tieres, um sicherzustellen, dass sie an Ort und Stelle bleiben.</li>
		<li>Legen Sie die Maus in ein 50-ml-Röhrchen und gehen Sie mit dem Kopf nach unten. Der Schlauch sollte ein Loch in der Nähe des Kopfes haben, wo die Anästhesie angeschlossen und abgegeben wird.</li>
		<li>Legen Sie den Schlauch in die Spule und schließen Sie die Anästhesie wieder an.</li>
		<li>Legen Sie einen faseroptischen Temperaturfühler locker in die Röhre, um die Umgebungstemperatur zu messen.</li>
		<li>Schalten Sie den Kühler ein und stellen Sie sicher, dass das Kühlmittel zirkuliert.</li>
		<li>Überprüfen und stellen Sie sicher, dass die Computersoftware die verschiedenen Temperaturen anzeigt, und beginnen Sie mit der Aufzeichnung, damit eine CEM43-Berechnung in Echtzeit angezeigt werden kann. Das erforderliche CEM43 ist die zuvor festgelegte Dosis. HINWEIS: Bevor der Magnet eingeschaltet wird, stellen Sie sicher, dass keine Metallgegenstände am Tier befestigt sind, da sich diese schnell erwärmen. Stellen Sie außerdem sicher, dass jeder im Raum keinen Herzschrittmacher hat und es für sie sicher ist, dort zu sein.</li>
		<li>Schalten Sie den Magneten bei einem niedrigen Leistungsprozentsatz ein.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass die faseroptischen Temperaturfühler Temperaturänderungen aufzeichnen. Die Temperaturen steigen an, sobald das AMF aktiviert wird, wenn das Feld zunimmt. Stellen Sie sicher, dass die Kerntemperatur des Tieres bei 38 °C bleibt. Regulieren Sie die Kerntemperatur mit dem klimatisierten Luftmantel.</li>
		<li>Passen Sie die Stärke des Magnetfeldes an, indem Sie die Leistung des Generators mit dem eingebauten Einstellrad ändern, das wiederum das Temperaturniveau im Tumor steuert.</li>
		<li>Schalten Sie die AMF ab, sobald die gewünschte Dosis, wie sie zuvor vom Benutzer bestimmt wurde (z. B. CEM43 40), innerhalb des Tumors erreicht ist.</li>
		<li>Sobald die AMF abgeschaltet ist, entfernen Sie den Schlauch von der Spule.</li>
		<li>Nehmen Sie die Maus aus dem Röhrchen und ziehen Sie die verschiedenen Sonden und den Katheter heraus. Wenn nötig, markieren Sie das Tier mit einer neuen Ohrmarke aus Metall.</li>
		<li>Sobald die Behandlungen abgeschlossen sind, schalten Sie den Kühler aus.</li>
		<li>Erholen Sie die Tiere aus der Narkose, um Komplikationen zu vermeiden. Überwachen Sie ihr Verhalten, um sicherzustellen, dass sie zur Normalität zurückkehren.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das Design und die Implementierung dieses Systems bietet die Möglichkeit, genaue und reproduzierbare In-vitro- und In-vivo-Experimente zur magnetischen Nanopartikel-Hyperthermie durchzuführen. Es ist wichtig, dass das System so ausgelegt ist, dass die AMF-Frequenz und die Feldstärke angemessen auf den magnetischen Nanopartikeltyp, die Konzentration und die gewünschte Gewebeposition und -temperatur abgestimmt sind. Darüber hinaus ist die genaue Überwachung der Temperatur in Echtzeit entscheidend für die Sicherheit ...

Hyperthermie wurde in der Vergangenheit in der Krebstherapie eingesetzt, entweder allein oder in Kombination mit anderen Behandlungen. Obwohl es eine lange Geschichte der Verwendung hat, wird die vorteilhafteste Methode zur Verabreichung dieser Behandlung immer noch diskutiert und hängt vom Krankheitsort und -ort ab. Zu den Verfahren zur Hyperthermieabgabe gehören Mikrowellen-, Hochfrequenz-, fokussierter Ultraschall, Laser und metallische Nanopartikel (wie Gold oder Eisenoxid)1,2,3,4. Diese Verabreichungsmethoden können zu einer Reihe von Behandlungstemperaturen von Fieber bis zu Hunderten von Grad Celsius führen. Die biologische Wirkung der Hyperthermie hängt in erster Linie von den verwendeten Temperaturen und der Dauer der Behandlungab 5. Für dieses Manuskript und Zweck konzentrieren wir uns auf die magnetische Nanopartikel-Hyperthermie (mNPH). Diese Methode ermöglicht fokussierte, lokalisierte, gut überwachte und kontrollierte Temperaturänderungen unter Verwendung von ungiftigen, von der FDA zugelassenen Eisenoxid-Nanopartikeln.
Ein Fallstrick bei anderen Hyperthermie-Modalitäten ist das Fehlen eines präzisen zellulären Targetings. Hyperthermie hat kein inhärent hohes therapeutisches Verhältnis, daher ist eine sorgfältige Thermometrie und gezieltes Targeting erforderlich6. mNPH ermöglicht die systemische oder intratumorale Injektion von mNPs, wobei Wärme nur dort erzeugt wird, wo sich die mNPs befinden, wodurch die Behandlung direkt auf den Tumor ausgerichtet ist. mNPH kann wirksam sein, wenn sich die magnetischen Nanopartikel innerhalb oder außerhalb der Zelle befinden. Für die Krebstherapie ist die allgemeine Übersicht von mNPH, dass die magnetischen Nanopartikel injiziert werden (intratumoral oder intravenös), dann wird ein magnetisches Wechselfeld angelegt, wodurch sich die magnetischen Pole der Nanopartikel ständig neu ausrichten, was zu einer lokalen Erwärmung der Zellen und des Gewebes führt, die mit den Nanopartikeln assoziiertsind 7,8 . Durch die Einstellung des Volumens der Nanopartikel und der Frequenz/Stärke des magnetischen Wechselfeldes (AMF) ist es möglich, die im Gewebe erzeugte Temperatur sorgfältig zu steuern.
Diese Behandlung funktioniert gut bei Tumoren, die sich in der Nähe der Körperoberfläche befinden, da tiefere Tumore eine stärkere AMF erfordern, so dass das Risiko einer Wirbelstromerwärmung steigt9. Es gibt Hinweise darauf, dass Hyperthermie klinisch als Monotherapie eingesetzt wird, jedoch wird Hyperthermie oft mit einer Strahlentherapie oder Chemotherapie kombiniert, was zu einer gezielteren Anti-Krebs-Wirkung führt10,11,12. Der klinische Nachweis von Hyperthermie in Kombination mit einer Strahlentherapie wurde in einer früheren Veröffentlichungüberprüft 13. Unser Labor hat eine Vielzahl von Tieren, von Mäusen über Schweine bis hin zu spontanen Krebserkrankungen bei Hunden, mit der mNPH-Methode12,14,15 erfolgreich behandelt. Dieses Protokoll richtet sich an alle, die daran interessiert sind, die Auswirkungen einer lokalisierten Hyperthermiebehandlung allein oder in Kombination mit anderen Therapien zu untersuchen.
Einer der wichtigsten Faktoren bei der Hyperthermie ist die Fähigkeit, die thermische Dosis, die an das Ziel-/Tumorgewebe abgegeben wird, in Echtzeit zu messen und zu verstehen. Eine Standardmethode zur Berechnung und zum Vergleich der Dosis ist der Nachweis der kumulativen äquivalenten Erhitzungsminuten bei 43 °C. Dieser Algorithmus ermöglicht den Vergleich von Dosen unabhängig vom Abgabesystem, maximalen und minimalen Temperaturen (innerhalb eines bestimmten Bereichs) und Aufheiz-/Abkühlparametern 5,16. Die CEM-Berechnung funktioniert am besten für Temperaturen zwischen 39-57 °C5. Zum Beispiel haben wir in einigen der von uns durchgeführten Studien eine thermische Dosis von CEM43 30 (d.h. 30 min bei 43 °C) gewählt. Die Wahl dieser Dosis ermöglichte es uns, eine sichere, wirksame, immungenetische Wirkung in vitro zu untersuchen, sowohl allein als auch in Kombination mit einer EinzeldosisStrahlung 17.
Bei der magnetischen Nanopartikel-Hyperthermie gibt es mehrere Faktoren, die beim Aufbau eines geeigneten Verabreichungssystems berücksichtigt werden müssen. Das Instrumentierungsdesign umfasst wichtige Sicherheitsfaktoren, wie z. B. die Verwendung eines Kühlers, um sicherzustellen, dass die Magnetfeldübertragungsgeräte auch bei hoher Leistung kühl bleiben, und ausfallsichere Verfahren, die verhindern, dass das System eingeschaltet wird, wenn nicht alle Temperatur-, Leistungsbewertungs- und Steuerungssysteme aktiviert wurden. Darüber hinaus gibt es wichtige biologische Faktoren, die sowohl für In-vivo- als auch für In-vitro-Situationen berücksichtigt werden müssen. Bei der Verwendung von kultivierten Zellen ist es notwendig, in Wachstumsmedien zu behandeln und auf einer konstanten lebensfähigen Temperatur zu halten, um physiologische Veränderungen zu vermeiden, die die Ergebnisse beeinflussen könnten. Für einzelne Nanopartikeltypen ist es wichtig, die spezifische Absorptionsrate (SAR) zu kennen, wenn AMF-basierte Heizparameter berechnet werden. Ebenso ist es wichtig, die mNP/Fe-Konzentration in Zellen und Geweben zu kennen, die notwendig ist, um die gewünschte Erwärmung zu erreichen. In-vivo-Methoden erfordern noch mehr Liebe zum Detail, da das Tier während der Behandlung unter Narkose gehalten werden muss und die Körperkerntemperatur des Tieres während der gesamten Behandlung auf einem normalen Niveau gehalten werden muss. Wenn die Körpertemperatur des Tieres sinkt, wie dies unter Narkose der Fall ist, kann dies das Gesamtergebnis in Bezug auf die thermische Dosis des zu behandelnden Gewebes beeinflussen.
In diesem Manuskript diskutieren wir die Methoden, die verwendet werden, um ein vielseitiges magnetisches Nanopartikel-Hyperthermiesystem zu entwerfen und zu konstruieren, sowie wichtige Anwendungsfaktoren, die berücksichtigt werden müssen. Das beschriebene System ermöglicht die robuste, konsistente, biologisch angemessene, sichere und gut kontrollierte Abgabe von magnetischer Nanopartikel-Hyperthermie. Schließlich ist zu beachten, dass die von uns durchgeführten mNPH-Studien häufig andere Therapien wie Bestrahlung, Chemotherapie und Immuntherapie beinhalten. Damit diese Ergebnisse aussagekräftig sind, ist es wichtig zu bestimmen, wie sich die abgegebene Wärme auf die Wirksamkeit und/oder Sicherheitstoxizität anderer Modalitäten (oder umgekehrt) und das Wohlbefinden des Tieres auswirken kann. Aus diesem Grund und den zuvor genannten Dosimetrie- und Therapiesituationen ist es unerlässlich, der Dosiergenauigkeit der magnetischen Nanopartikel-Hyperthermie und den kontinuierlichen Kern- und Zieltemperaturmessungen strikte Aufmerksamkeit zu schenken. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine einfache, konsistente Methode und Beschreibung für die Bereitstellung einer sicheren und effektiven magnetischen Nanopartikel-Hyperthermie bereitzustellen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>.25% Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-664</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf 22363204</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16F10 murine melanoma cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-6475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/Bl6 mice</td>
			<td>Charles river</td>
			<td>027C57BL/6</td>
			<td>6-week-old female mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chiller</td>
			<td>Thermal Care</td>
			<td>NQ 5 series</td>
			<td>chiller that cools the coil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coolant fluid</td>
			<td>Dow Chemical Company</td>
			<td>Dowtherm SR-1</td>
			<td>antenna cooling fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fiber optic probes, software and chassis</td>
			<td>FISO</td>
			<td></td>
			<td>FISO evolution software used to read the temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR camera</td>
			<td>Flir</td>
			<td></td>
			<td>infrared camera to monitor unintentional heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iron oxide nanoparticles</td>
			<td>micromod Partikeltechnologie GmbH</td>
			<td>Bionized NanoFerrite</td>
			<td>dextran coated iron oxide nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse coil, solenoid</td>
			<td>Fluxtrol</td>
			<td>custom built</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-652</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF generator</td>
			<td>Huttinger</td>
			<td>TIG 10/300</td>
			<td>power source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI media</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-396</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo delivery of magnetic nanoparticle hyperthermia using a custom-built delivery system

Hyperthermie wird seit langem bei der Behandlung von Krebs eingesetzt. Die Techniken reichen von der intratumoralen Einführung von heißen Eisenstäben bis hin zu systemisch verabreichten magnetischen Nanopartikeln, die auf Tumorantikörper abzielen, bei Temperaturen von 39 °C (Fieber) bis 1.000 °C (Elektrokauterisation) und Behandlungszeiten von Sekunden bis Stunden. Die Temperatur-Zeit-Beziehung (thermische Dosis) bestimmt die Wirkung mit hohen thermischen Dosen, die zur Gewebeablation führen, und niedrigeren thermischen Dosen, die zu subletalen Effekten wie erhöhtem Blutfluss, Akkumulation von Medikamenten und Immunstimulation führen. Eine der vielversprechendsten medizinischen Therapien ist die magnetische Nanopartikel-Hyperthermie (mNPH). Bei dieser Technik werden magnetische Nanopartikel, die systemisch oder intratumoral abgegeben werden können, mit einem nicht-invasiven, nicht-toxischen magnetischen Wechselfeld aktiviert. Die Größe, der Aufbau und die Assoziation der magnetischen Nanopartikel sowie die Frequenz und Feldstärke des Magnetfeldes sind wichtige Erwärmungsdeterminanten. Wir haben ausgeklügelte Instrumente und Techniken entwickelt, um eine reproduzierbare magnetische Nanopartikel-Hyperthermie in großen und kleinen Tiermodellen und kultivierten Zellen zu ermöglichen. Dieser Ansatz, der eine kontinuierliche Echtzeit-Temperaturüberwachung an mehreren Standorten verwendet, ermöglicht die Abgabe genau definierter thermischer Dosen an das Zielgewebe (Tumor) oder die Zielzellen, während die Erwärmung des Nicht-Zielgewebes begrenzt wird. Die präzise Steuerung und Überwachung der Temperatur an mehreren Standorten und die Verwendung des Industriestandardalgorithmus (kumulative äquivalente Minuten bei 43 °C /CEM43) ermöglichen eine genaue Bestimmung und Quantifizierung der thermischen Dosis. Unser System, das eine Vielzahl von Temperaturen, thermischen Dosen und biologischen Effekten ermöglicht, wurde durch eine Kombination aus kommerziellen Akquisitionen und internen technischen und biologischen Entwicklungen entwickelt. Dieses System wurde so optimiert, dass eine schnelle Umstellung zwischen Ex-vivo-, In-vitro- und In-vivo-Techniken möglich ist. Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie eine effektive Technik und ein System zur Bereitstellung einer reproduzierbaren und genauen magnetischen Nanopartikeltherapie (mNP) Hyperthermie entworfen, entwickelt und implementiert werden können.

In-vitro-Studien Zellen erreichen und halten die gewünschte Temperatur und thermische Dosis nur dann aufrecht, wenn die Menge und Konzentration der magnetischen Nanopartikel / Eisen und der AMF entsprechend abgestimmt sind. Bei der Verwendung von magnetischen Nanopartikeln zur Erwärmung von Zellen in vitro (und in vivo) sollte beachtet werden, dass zur Erzielung einer Hyperthermie in Zellen mit internalisierten magnetischen Nanopartikeln ein bestimmtes Maß an intrazellulärem mNP / Fe erforderlich ...

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In Vitro and In Vivo Delivery of Magnetic Nanoparticle Hyperthermia Using a Custom-Built Delivery System

Dieses Protokoll stellt Techniken und Methoden vor, die für die genaue Verabreichung von magnetischer Nanopartikel-Hyperthermie unter Verwendung eines ausgeklügelten Verabreichungs- und Überwachungssystems erforderlich sind.

In-vitro- und In-vivo-Verabreichung von magnetischer Nanopartikel-Hyperthermie mit einem maßgeschneiderten Verabreichungssystem

Hyperthermia has long been used in the treatment of cancer. Techniques have varied from the intra-tumoral insertion of hot iron rods, to systemically ...

in-vitro-vivo-delivery-magnetic-nanoparticle-hyperthermia-using

Research

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Medicine

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Serie: In Vitro and In Vivo Delivery of Magnetic Nanoparticle Hyperthermia Using a Custom-Built Delivery System

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery. Fresh patient tissue obtained at the time of surgery is sliced and maintained in culture. The ex vivo model system allows for the physical delivery of genes into intact patient tissue and gene expression is analysed by bioluminescence imaging using the IVIS detection system. The bioluminescent detection system demonstrates rapid and accurate quantification of gene expression within individual slices without the need for tissue sacrifice. This slice tissue culture system may be used in a variety of tissue types including normal and malignant tissue and allows us to study the effects of the heterogeneous nature of intact tissue and the high degree of variability between individual patients. This model system could be used in certain situations as an alternative to animal models and as a complementary preclinical mode prior to entering clinical trial.

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This article describes the culture of patient tissue slices for gene delivery studies and subsequent analysis of gene expression using IVIS bioluminescence imaging.

Ex vivo-Kultur der Patient Tissue &amp; Prüfung von Gentransfer

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Forschung

Medizin

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue revascularization and cell survival. In addition, further observations revealed that specific stem cells, such as cardiac stem cells, mesenchymal stem cells and cardiospheres have the ability to integrate within the surrounding myocardium by differentiating into cardiomyocytes, smooth muscle cells and endothelial cells.
Here, we present the materials and methods to reliably deliver noncontractile cells into the left ventricular wall of immunodepleted mice. The salient steps of this microsurgical procedure involve anesthesia and analgesia injection, intratracheal intubation, incision to open the chest and expose the heart and delivery of cells by a sterile 30-gauge needle and a precision microliter syringe.
Tissue processing consisting of heart harvesting, embedding, sectioning and histological staining showed that intramyocardial cell injection produced a small damage in the epicardial area, as well as in the ventricular wall. Noncontractile cells were retained into the myocardial wall of immunocompromised mice and were surrounded by a layer of fibrotic tissue, likely to protect from cardiac pressure and mechanical load.

Intramyocardial cell delivery in murine models of cardiovascular diseases, such as hypertension or myocardial infarction, is widely used to test the therapeutic potential of different cell types in regenerative studies. Therefore, a detailed description and a clear visualization of this surgical procedure will help to define the limits and advantages of cardiovascular cell therapeutic analyses in small rodents.

Intramyokardiale Zell Lieferung: Beobachtungen im Herzen Murine

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these diseases. Chronic retinal diseases such as retinal oedema or neovascularization usually require multiple intraocular injections to effectively treat the condition. However, the risks associated with these injections increase with repeated delivery of the drug. Therefore, alternative delivery methods need to be established in order to minimize the risks of reinjection. Several other investigations have developed methods to deliver drugs over extended time, through materials capable of releasing chemicals slowly into the eye. In this investigation, we outline the use of Elvax 40W, a copolymer resin, to act as a vehicle for drug delivery to the adult rat retina. The resin is made and loaded with the drug. The drug-resin complex is then implanted into the vitreous cavity, where it will slowly release the drug over time. This method was tested using 2-amino-4-phosphonobutyrate (APB), a glutamate analogue that blocks the light response of the retina. It was demonstrated that the APB was slowly released from the resin, and was able to block the retinal response by 7 days after implantation. This indicates that slow-release drug delivery using this copolymer resin is effective for treating the retina, and could be used therapeutically with further testing.

This paper details how Elvax 40W can be used as a slow-release method for drug delivery to the adult rat retina. The protocol for preparing, loading, and delivering the drug-resin complex to the eye is described.

Slow-Release-Drug Delivery durch Elvax 40W, um die Ratte Retina: Implikationen für die Behandlung von chronischen Erkrankungen

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences between the murine and human respiratory systems, especially in their upper respiratory tracts (URT). In some models, these differences in the murine nasal cavity can have a significant impact on disease progression and presentation in the lower respiratory tract (LRT) when using intranasal instillation techniques, potentially limiting the usefulness of the mouse model to study these diseases. For these reasons, it would be advantageous to develop a technique to instill bacteria directly into the mouse lungs in order to study LRT disease in the absence of involvement of the URT. We have termed this lung specific delivery technique intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation. This noninvasive technique minimizes the potential for instillation into the bloodstream, which can occur during more invasive traditional surgical intratracheal infection approaches, and limits the possibility of incidental digestive tract delivery. IMIT is a two-step process in which mice are first intubated, with an intermediate step to ensure correct catheter placement into the trachea, followed by insertion of a blunt needle into the catheter to mediate direct delivery of bacteria into the lung. This approach facilitates a &#62;98% efficacy of delivery into the lungs with excellent distribution of reagent throughout the lung. Thus, IMIT represents a novel approach to study LRT disease and therapeutic delivery directly into the lung, improving upon the ability to use mice as surrogates to study human respiratory disease. Furthermore, the accuracy and reproducibility of this delivery system also makes it amenable to Good Laboratory Practice Standards (GLPS), as well as delivery of a wide range of reagents which require high efficiency delivery to the lung.

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation of reagents is an excellent, noninvasive method for studying respiratory disease, as well as a method for instilling therapeutic reagents directly into the lung. It is a rapid and highly reproducible method which is suitable for preclinical testing.

Intubation vermittelte Intratracheale (IMIT) Instillation: eine nichtinvasive, lungenspezifischen Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Depletion von Maus-Zellen aus menschlichem Tumorxenografte deutlich verbessert Downstream-Analyse von Zielzellen

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Intravascular Delivery of Biologics to the Rat Kidney

The renal microvascular compartment plays an important role in the progression of kidney disease and hypertension, leading to the development of End Stage Renal Disease with high risk of death for cardiovascular events. Moreover, recent clinical studies have shown that renovascular structure and function may have a great impact on functional renal recovery after surgery. Here, we describe a protocol for the delivery of drugs into the renal artery of rats. This procedure offers significant advantages over the frequently used systemic administration as it may allow a more localized therapeutic effect. In addition, the use of rodents in pharmacodynamic analysis of preclinical studies may be cost effective, paving the way for the design of translational experiments in larger animal models. Using this technique, infusion of rat recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) protein in rats has induced activation of VEGF signaling as shown by increased expression of FLK1, pAKT/AKT, pERK/ERK. In summary, we established a protocol for the intrarenal delivery of drugs in rats, which is simple and highly reproducible.

The administration of drugs for recovery of kidney function requires control of the localization and distribution of the therapeutic compound. Here, we describe in detail a simple technique for intrarenal delivery of drugs in rats. This procedure may be easily performed with no mortality and high reproducibility.

Die intravaskuläre Lieferung von Biologics zur Rattenniere

The renal microvascular compartment plays an important role in the progression of kidney disease and hypertension, leading to the development of End Stage ...

Using Multi-fluorinated Bile Acids and In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Measure Bile Acid Transport

Along with their traditional role as detergents that facilitate fat absorption, emerging literature indicates that bile acids are potent signaling molecules that affect multiple organs; they modulate gut motility and hormone production, and alter vascular tone, glucose metabolism, lipid metabolism, and energy utilization. Changes in fecal bile acids may alter the gut microbiome and promote colon pathology including cholerrheic diarrhea and colon cancer. Key regulators of fecal bile acid composition are the small intestinal Apical Sodium-dependent Bile Acid Transporter (ASBT) and fibroblast growth factor-19 (FGF19). Reduced expression and function of ASBT decreases intestinal bile acid up-take. Moreover, in vitro data suggest that some FDA-approved drugs inhibit ASBT function. Deficient FGF19 release increases hepatic bile acid synthesis and release into the intestines to levels that overwhelm ASBT. Either ASBT dysfunction or FGF19 deficiency increases fecal bile acids and may cause chronic diarrhea and promote colon neoplasia. Regrettably, tools to measure bile acid malabsorption and the actions of drugs on bile acid transport in vivo are limited. To understand the complex actions of bile acids, techniques are required that permit simultaneous monitoring of bile acids in the gut and metabolic tissues. This led us to conceive an innovative method to measure bile acid transport in live animals using a combination of proton (1H) and fluorine (19F) magnetic resonance imaging (MRI). Novel tracers for fluorine (19F)-based live animal MRI were created and tested, both in vitro and in vivo. Strengths of this approach include the lack of exposure to ionizing radiation and translational potential for clinical research and practice.

Using Multi-fluorinated Bile Acids and In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Measure Bile Acid Transport

Tools to diagnose bile acid malabsorption and measure bile acid transport in vivo are limited. An innovative approach in live animals is described that utilizes combined proton (1H) plus fluorine (19F) magnetic resonance imaging; this novel methodology has translational potential to screen for bile acid malabsorption in clinical practice.

Mit Multi-fluorierten Bile Acids und<em&gt; In Vivo</em&gt; Magnetic Resonance Imaging Maßnahme Gallensäure-Transport

Along with their traditional role as detergents that facilitate fat absorption, emerging literature indicates that bile acids are potent signaling ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

Optimierte LC-MS/MS-Methode für die Hochdurchsatz-Analyse der klinischen Proben von Ivacaftor, seinen Hauptmetaboliten und Lumacaftor in biologischen Flüssigkeiten von Mukoviszidose-Patienten

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Verbesserte Methode für die Einrichtung einer In-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modell auf porcinen Endothelzellen Gehirnzellen basiert

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a promising therapeutic target in many disorders, such as autoimmune diseases, atherosclerosis, and cancer. RNAi-mediated gene silencing is a valuable approach of choice to probe and manipulate macrophage function; however, the transfection of macrophages with siRNA is often considered to be technically challenging, and, at present, few methodologies dedicated to the siRNA transfer to macrophages are available. Here, we present a protocol of using polyethyleneimine-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles (PEI-SPIONs) as a vehicle for the targeted delivery of siRNA to macrophages. PEI-SPIONs are capable of binding and completely condensing siRNA when the Fe:siRNA weight ratio reaches 4 and above. In vitro, these nanoparticles can efficiently deliver siRNA into primary macrophages, as well as into the macrophage-like RAW 264.7 cell line, without compromising cell viability at the optimal dose for transfection, and, ultimately, they induce siRNA-mediated target gene silencing. Apart from being used for in vitro siRNA transfection, PEI-SPIONs are also a promising tool for delivering siRNA to macrophages in vivo. In view of its combined features of magnetic property and gene-silencing ability, systemically administered PEI-SPION/siRNA particles are expected not only to modulate macrophage function but also to enable macrophages to be imaged and tracked. In essence, PEI-SPIONs represent a simple, safe, and effective nonviral platform for siRNA delivery to macrophages both in vitro and in vivo.

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

We describe a method of using polyethyleneimine (PEI)-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles for transfecting macrophages with siRNA. These nanoparticles can efficiently deliver siRNA to macrophages in vitro and in vivo and silence target gene expression.

Polyethyleneimine beschichteten Eisenoxid-Nanopartikeln als Vehikel für die Lieferung von kleinen interferierende RNA an Makrophagen In Vitro und In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...