이 연구는 NCI P30 CA023108 및 NCI U54 CA151662의 보조금 번호로 자금을 지원받았습니다.

다트머스 대학 동물 관리 및 사용 프로그램은 미국 실험실 동물 관리 인증 협회 (iAAALAC)의 인증을 받았으며 모든 UDSA 및 NIH (실험 동물 복지 사무소) 지침 및 규정을 준수합니다. 모든 생체 내 연구는 다트머스 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다. 안락사 절차는 동물 안락사에 대한 2020 AVMA 지침을 준수합니다.
1. 시스템의 계측/설계
<ol><li>맞춤형 AMF 안테나(코일)를 폐쇄 루프로 설계하고 원하는 자기장을 생성하기 위해 모양을 선택합니다. 발전기 선택의 인덕턴스 공식과 특성을 사용하여 원하는 필드를 생성하는 호환 가능한 코일을 설계합니다. 시험관 내 및 생체 내 실험에 다양한 디자인을 사용하십시오.</li>
	<li>AMF 안테나 인덕턴스가 발전기의 허용 범위 내에 있는지 확인합니다. 커패시터를 더하거나 빼서 안테나를 발전기에 일치(조정)합니다.</li>
	<li>체외 실험의 경우 1.5mL 튜브를 포함할 수 있는 내경 2cm, 길이 14cm의 14회전 헬리컬 코일을 설계하여 여러 샘플을 동시에 처리할 수 있습니다. 코일을 비닐 폴리머로 절연하고 폴리스티렌 스페이서를 사용하여 튜브에서 코일을 분리하십시오. 설계 사양 및 고려 사항에 대한 자세한 내용은 보충 파일 1에 있습니다.</li>
	<li>생체 내 실험의 경우 독점 설계 정보가 있는 제조업체로부터 맞춤형 전신 헬리컬 코일을 구입하십시오. 8mm 사각 튜브(코일 보어 내에 보다 균일한 필드를 생성하므로)와 대상 처리 영역에 집중기를 사용하십시오. 농축기를 5.0cm 길이로 만들고 총 5회 돌려 내경 3.6cm, 외경 5.2cm를 만들고 표적 치료 부위에 위치합니다. 코일을 폴리 카보네이트 쉘로 둘러싸십시오.</li>
	<li>정격 전력이 10kW 이상인 조정 가능한 전력 및 주파수가 있는 AMF 발전기를 전원으로 사용하십시오. 인덕턴스는 전원과 안테나/코일을 0.62에서 1.18μHenries(μH) 범위로 일치시켜 30-300kHz 범위의 주파수를 허용합니다. 50psi로 조절된 원심 부스트 펌프를 통해 재활용된 물을 사용하여 발전기를 냉각합니다.</li>
	<li>AMF 안테나를 통해 물로 희석된 25% 에틸렌 글리콜 기반 열전달 유체를 펌핑하는 5.6톤 냉각 용량 냉각기로 코일을 냉각합니다. 안테나가 샘플을 가열하거나 냉각하지 않도록 냉각기의 온도를 설정하십시오.</li>
	<li>동물 격리의 경우 홀더와 코일 표면 사이에 0.5cm의 에어 갭이 있는 코일 중앙에 매달릴 수 있는 관형 홀더를 구성합니다. 코일 주위의 쉘을 통해 공기를 순환시키는 조정 가능한 조절 식 공기 펌프를 연결하고 정상적인 동물 코어 온도를 유지하도록 설정하십시오. 마취 기계를 동물의 머리 근처의 관형 동물 홀더에 연결하여 적절한 마취 전달을 보장합니다.</li>
	<li>세포 봉쇄를 위해 튜브가 놓인 스페이서를 통해 수조에서 물을 순환시키는 장치를 만드십시오. 튜브가 37 ° C에서 물로 둘러싸이도록이 수조의 온도를 설정하십시오.</li>
	<li>광섬유 프로브를 사용하여 종양, 동물의 핵심 및 동물 환경 내의 온도를 모니터링하거나 시험관 내 연구를 위해 세포 펠릿의 온도와 튜브를 둘러싼 물을 모니터링합니다.</li>
	<li>모든 실험에 100nm 크기의 자성 산화철 나노 입자를 사용하십시오. 참고 : 농도와 전자파 흡수율 (SAR)은 가능한 가열 및 열 선량18에 직접적인 영향을 미치기 때문에 나노 입자를 선택할 때 고려해야 할 두 가지 특성입니다.</li>
</ol>2. 시험관 내 온열요법
<ol><li>B16F10 뮤린 흑색종 세포를 10% FBS 및 1% Pen/연쇄상 구균이 있는 RPMI 배지에서 배양합니다. 6웰 플레이트에 150, 000개의 세포/웰을 플레이트하고 2mL의 완전 배지를 사용합니다.</li>
	<li>각각의 웰, 즉 mNP가 없고 AMF가 없는 세포, mNP가 있고 AMF가 없는 세포, mNP가 없는 세포 및 AMF가 없는 세포, mNP 및 AMF가 있는 세포에 대한 적절한 처리를 결정한다. 알림: 또한 온열요법과 다른 요법을 병용하는 경우 적절한 대조군이 있는지 확인하십시오. AMF는 필요한 전력 및 냉각 기능을 갖춘 표준 연구 벤치 실험실에서 수행됩니다.</li>
	<li>도금 후 24시간 후, 이전 단계에서 결정된 대로 적절한 웰에 mNP를 추가합니다. 3 mg 철 / mL의 농도에 mNP를 추가하십시오. 스톡 미디어/mNP 솔루션을 생성하거나(오래된 미디어 제거, 이 솔루션 추가) 균일한 분배를 위해 mNP를 직접 부드럽게 소용돌이치는 플레이트를 추가하여 mNP가 웰 전체에 분포되도록 합니다.</li>
	<li>mNP 첨가 후 48시간 후, 웰이 ~80% 합류할 때 배지를 제거하고 새로운 배지로 웰을 세척하여 처리를 시작합니다. 미디어를 제거합니다.</li>
	<li>치료중인 각 웰에 0.5mL의 트립신을 넣고 부드럽게 소용돌이 치십시오. 현미경을 사용하여 세포가 분리되어 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>각 웰에 1mL의 배지를 추가하여 세포를 1.5mL 튜브에 수집합니다. 웰에서 모든 세포를 수집합니다 (~ 1 x 106 세포). 각 웰에 대해 명확하게 표시된 별도의 튜브를 사용하십시오.</li>
	<li>세포가 펠릿이 될 수 있도록 60 x g 에서 2-3분 동안 튜브를 회전시킵니다. 미디어에 펠릿을 보관하십시오.</li>
	<li>코일 안에 물이 가득 찬 스페이서에 튜브를 놓습니다. 배지 및 셀 펠릿이 37°C로 유지되도록 수조의 온도를 설정한다. 별도의 광섬유 온도 프로브를 사용하여 튜브와 수조 내부의 온도를 모니터링합니다.</li>
	<li>냉각기를 켜고 냉각수가 코일을 통해 흐르고 있는지 확인하십시오. 전원을 켜고 최대 백분율을 원하는 필드로 조정합니다. 10kW 발전기로 구동되는 14회전 솔레노이드 코일을 165kHz 및 23.87kA/m(300Oe)에서 작동합니다.</li>
	<li>별도의 광섬유 온도 프로브를 튜브 중 하나에 놓습니다. 이전에 결정된 프로토콜 열 투여량까지 세포를 처리한다. 예는 43°C에서 30분(30/CEM43)입니다.</li>
	<li>튜브에 있는 배지에 세포를 재현탁하고 새 6웰 플레이트에 다시 플레이팅합니다. 새 번호판에 명확하게 라벨을 붙입니다. 목표는 수집된 모든 세포를 다시 플레이팅하는 것입니다(~1 x 106 셀). 알림: 배양되는 세포가 치료를 받았는지 확인하기 위해 새로운 6웰 플레이트를 사용해야 합니다. 오래된 플레이트를 사용하면 성공적으로 트립신 화되지 않은 플레이트에 여전히 세포가 남아있을 수 있습니다.</li>
	<li>필요한 경우 다음 실험 절차를 위해 RNA 또는 단백질 발현 분석을 위해 세포를 용해시킵니다.</li>
</ol>3. 생체 내 온열요법
<ol><li>세포 배양 및 접종<ol><li>B16F10 뮤린 흑색종 세포를 10% FBS 및 1% Pen/연쇄상 구균이 있는 RPMI 배지에서 배양합니다. 원하는 수의 동물을 접종하기에 충분한 세포를 제공하는 접시 / 접시를 사용하십시오. 예를 들어, 100, 000 개의 세포로 도금 된 10, 100 mm 접시는 48 시간 이내에 20 마리의 마우스 주사를위한 충분한 세포와 합류합니다.</li>
		<li>세포를 트립신화하고 순수 RPMI 배지(FBS 또는 펜/스트렙 없음)를 사용하여 수집합니다.</li>
		<li>세포를 계수하고 접종량과 마우스 수를 기반으로 원하는 세포 농도에 대한 용액을 만듭니다.</li>
		<li>기화된 이소플루란과 산소를 사용하여 6주 된 암컷 C57Bl/6 마우스를 마취합니다. 유도 될 때까지 5 % 이소 플루 란과 95 % 산소가 함유 된 플렉시 유리 상자에 동물을 넣습니다. 일단 유도되면, 동물을 제거하고 2% 이소플루란에서 페이스 콘을 사용하여 3.1.5-3.1.7 및 3.3.3-3.3.6단계를 완료하십시오. 알림: 치료 중 마취를 위해 내장 마취 봉쇄를 사용하십시오. 마우스 마취에 대한 표준 기관 프로토콜을 따르십시오. 동물 실험 전에 적절한 IACUC 승인을 확인하십시오. 마취 후 동물을 새장으로 되돌리고 회복을 모니터링하여 합병증이 없는지 확인하십시오.</li>
		<li>올바른 반사에 대한 반응이 없는지 확인하십시오.</li>
		<li>전기 면도기를 사용하여 오른쪽 측면을 면도하십시오.</li>
		<li>알코올 닦음으로 주사 부위를 청소하십시오. 1-2 x 106 세포를 주사하고, 28 G 바늘을 갖는 100 μL 유리 주사기를 사용하여, 50 μL의 배지에 분산시키고, 면도된 마취의 우측 옆구리에 피내로 분산시킨다.</li>
	</ol></li>
	<li>종양 성장/나노입자 주입<ol><li>캘리퍼스(길이, 너비 및 깊이)를 사용하여 종양을 3차원으로 측정하고 (길이 x 너비 x 깊이 x π)/6으로 부피를 계산합니다.</li>
		<li>종양 부피가 120 mm 3 (+/- 20 mm3)에 도달하면 동물을 연구에 두십시오. 조합 요법 코호트(즉, 대조군, mNPH, 방사선 및 조합)를 포함한 적절한 대조군 및 치료 그룹이 있는지 확인하여 연구를 설계합니다.</li>
		<li>3.1.4에 설명된 대로 mNP를 받을 마우스를 마취합니다.</li>
		<li>알코올 물티슈로 해당 부위를 청소하십시오. AMF 치료 3시간 전에 종양에 mNP를 주입합니다. 복용량이 종양의 철 / cm3 7.5mg이되도록 부피를 주사하십시오. 참고 : 실험실의 미공개 데이터에 따르면 최대 mNP 흡수는 3-6 시간에 발생합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>암프 치료<ol><li>마우스를 마취시키고 가열 패드에 올려 코어 온도를 유지하십시오.</li>
		<li>올바른 반사에 대한 반응이 없는지 확인하십시오. 마우스에서 귀 태그 또는 기타 금속 물체를 제거합니다.</li>
		<li>윤활된 광섬유 온도 프로브를 마우스의 직장에 부드럽게 놓습니다.</li>
		<li>카테터를 종양에 넣고 바늘을 제거하십시오. 카테터가 종양에서 너무 많이 튀어 나오지 않도록 자릅니다. 참고: 광섬유 온도 카테터는 마우스가 전신 마취 하에 있는 동안, 즉 카테터가 종양 가열 절차 동안에만 제자리에 있는 동안 배치 및 제거됩니다. 마우스는 시술시 NSAID 진통제 인 케토 프로 펜 (5mg / kg)을 단일 피하 투여받습니다. 카테터 배치와 관련된 단기 또는 장기간의 불편함이나 이환율을 관찰하지 못했습니다.</li>
		<li>3센서 광섬유 온도 프로브를 카테터에 삽입합니다. 카테터는 광섬유 온도 프로브 센서를 보호합니다.</li>
		<li>직장과 종양 내 프로브를 동물의 꼬리에 테이프로 붙여서 제자리에 유지되도록합니다.</li>
		<li>마우스를 50mL 튜브에 넣고 머리를 바닥으로 향하게 합니다. 튜브는 마취가 연결되고 전달 될 머리 근처에 구멍이 있어야합니다.</li>
		<li>설정된 코일 안에 튜브를 놓고 마취를 다시 연결합니다.</li>
		<li>광섬유 온도 프로브를 튜브에 느슨하게 배치하여 환경 온도를 측정합니다.</li>
		<li>냉각기를 켜고 냉각수가 순환되고 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>컴퓨터 소프트웨어가 다양한 온도를 표시하고 있는지 확인하고 CEM43 계산을 실시간으로 표시할 수 있도록 기록을 시작합니다. 필요한 CEM43은 이전에 결정된 용량입니다. 알림: 자석을 켜기 전에 빠르게 가열되므로 동물에 금속 물체가 부착되어 있지 않은지 확인하십시오. 또한 방에 있는 모든 사람에게 심박 조율기가 없고 안전하게 있어야 하는지 확인하십시오.</li>
		<li>낮은 전력 비율로 자석을 켭니다.</li>
		<li>광섬유 온도 프로브가 온도 변화를 기록하고 있는지 확인하십시오. 필드가 증가함에 따라 AMF가 활성화되면 온도가 증가합니다. 동물의 중심 온도가 38 ° C로 유지되도록하십시오. 조절된 에어 재킷을 사용하여 코어 온도를 조절하십시오.</li>
		<li>내장 된 제어 다이얼을 사용하여 발전기의 전원을 변경하여 자기장의 강도를 조정하면 종양의 온도 수준을 제어합니다.</li>
		<li>일단 AMF를 차단하면 원하는 투여량(예를 들어 CEM43 40)이 종양 내에서 달성된다.</li>
		<li>AMF가 종료되면 코일에서 튜브를 제거합니다.</li>
		<li>튜브에서 마우스를 제거하고 다양한 프로브 및 카테터를 추출합니다. 필요한 경우 새 금속 귀 태그로 동물에 태그를 지정하십시오.</li>
		<li>처리가 완료되면 냉각기를 종료하십시오.</li>
		<li>합병증이 없는지 마취에서 동물을 회복하십시오. 정상으로 돌아갈 수 있도록 행동을 모니터링하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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이 시스템의 설계 및 구현은 정확하고 재현 가능한 in vitro 및 in vivo 자성 나노입자 온열요법 실험을 수행할 수 있는 기능을 제공합니다. AMF 주파수 및 전계 강도가 자성 나노입자 유형, 농도, 원하는 조직 위치 및 온도와 적절하게 일치하도록 시스템을 설계하는 것이 중요합니다. 또한 실시간으로 온도를 정확하게 모니터링하는 것은 안전과 정확한 열 선량(43°C/CEM에서 누적 등가 시간)을 계산하는 ?...

온열요법은 역사적으로 단독으로 또는 다른 치료법과 함께 암 치료에 사용되어 왔습니다. 오랜 사용 역사를 가지고 있지만이 치료법을 제공하는 가장 유리한 방법은 여전히 논의 중이며 질병 부위와 위치에 따라 다릅니다. 온열요법 전달 방법에는 마이크로파, 고주파, 집속 초음파, 레이저 및 금속 나노입자(예: 금 또는 산화철)1,2,3,4가 포함됩니다. 이러한 전달 방법은 발열 수준에서 수백 °C까지 다양한 치료 온도로 이어질 수 있습니다. 온열요법의 생물학적 효과는 주로 사용되는 온도와 치료 기간에 따라 달라집니다5. 이 원고와 목적을 위해 우리는 자성 나노 입자 온열요법(mNPH)에 초점을 맞추고 있습니다. 이 방법은 무독성, FDA 승인 산화철 나노 입자를 사용하여 집중되고 국소화되고 잘 모니터링되고 제어 된 온도 변화를 허용합니다.
다른 온열요법 양식의 한 가지 함정은 정확한 세포 표적화가 부족하다는 것입니다. 온열요법은 본질적으로 높은 치료율을 갖지 않으므로, 신중한 체온 측정 및 표적화가 필요하다6. mNPH는 mNP의 전신 또는 종양내 주사를 허용하며, mNP가 위치한 곳에서만 열이 발생하므로 종양에 대한 치료를 직접 표적으로 합니다. mNPH는 자성 나노입자가 세포의 내부 또는 외부에 위치할 때 효과적일 수 있다. 암 치료의 경우, mNPH의 일반적인 개요는 자성 나노 입자가 주입 (종양 내 또는 정맥 내)되고, 그런 다음 교류 자기장이 적용되어 나노 입자 자극이 지속적으로 재정렬되어 나노 입자와 관련된 세포 및 조직의 국부적 인 가열을 유도한다는 것입니다 7,8 . 나노 입자의 부피와 교류 자기장 (AMF)의 주파수 / 강도를 조정함으로써 조직 내에서 발생하는 온도를 신중하게 제어 할 수 있습니다.
이 치료법은 더 깊은 종양이 더 강한 AMF를 필요로하므로 와전류 가열의 위험이 증가하기 때문에 신체 표면 근처에있는 종양에서 잘 작동합니다9. 온열요법이 단독 요법으로 임상적으로 사용된다는 증거가 있지만, 종종 온열요법은 방사선 요법 또는 화학 요법과 결합되어 보다 표적화된 항암 효과를 유발합니다10,11,12. 방사선 요법과 함께 작동하는 온열요법의 임상 증거는 이전 간행물13에서 검토되었습니다. 우리 실험실은 mNPH 방법12,14,15를 사용하여 생쥐에서 돼지 및 자발적인 송곳니 암에 이르기까지 다양한 동물을 성공적으로 치료했습니다. 이 프로토콜은 국소 온열요법 치료의 효과를 단독으로 또는 다른 치료법과 함께 조사하는 데 관심이 있는 사람들을 위해 설계되었습니다.
온열요법에서 가장 중요한 요소 중 하나는 표적/종양 조직에 전달되는 열량을 실시간으로 측정하고 이해할 수 있다는 것입니다. 선량을 계산하고 비교하는 표준 방법은 43 ° C에서 가열의 누적 등가 분을 입증하는 것입니다. 이 알고리즘을 사용하면 전달 시스템, 최대 및 최소 온도(특정 범위 내) 및 가열/냉각 매개변수(5,16)와 무관한 용량을 비교할 수 있습니다. CEM 계산은 39-57 ° C 사이의 온도에서 가장 잘 작동합니다5. 예를 들어, 우리가 수행 한 일부 연구에서 CEM43 30 (즉, 43 ° C에서 30 분)의 열 용량을 선택했습니다. 이 선량을 선택하면 시험관 내에서 안전하고 효과적인 면역 유전 효과를 단독으로 또는 단일 방사선 량과 함께 볼 수있었습니다17.
자성 나노입자 온열요법의 경우 적절한 전달 시스템을 구축할 때 고려해야 할 몇 가지 요소가 있습니다. 계측 설계에는 고전력으로 작동하는 경우에도 자기장 전달 장비가 냉각 상태를 유지하도록 하는 냉각기 사용과 모든 온도, 전력 평가 및 제어 시스템이 활성화되지 않은 경우 시스템이 켜지지 않도록 하는 페일 세이프 절차와 같은 중요한 안전 요소가 포함됩니다. 또한 생체 내 및 시험관 내 상황 모두에서 고려해야 할 중요한 생물학적 요인이 있습니다. 배양된 세포를 사용할 때는 결과에 영향을 미칠 수 있는 생리학적 변화를 피하기 위해 성장 배지에서 처리하고 일관된 실행 가능한 온도를 유지해야 합니다. 개별 나노입자 유형의 경우 AMF 기반 가열 매개변수를 계산할 때 전자파 흡수율(SAR)을 아는 것이 중요합니다. 유사하게, 원하는 가열을 달성하는 데 필요한 세포와 조직의 mNP/Fe 농도를 아는 것이 중요합니다. In vivo 방법은 치료 중 동물을 마취 상태로 유지해야하며 치료 내내 동물의 핵심 체온을 정상 수준으로 유지해야하기 때문에 세부 사항에 더 많은주의가 필요합니다. 마취 상태에서 발생하는 것처럼 동물의 체온이 떨어지도록 허용하면 치료되는 조직의 열 선량과 관련하여 전반적인 결과에 영향을 줄 수 있습니다.
이 원고에서는 다목적 자성 나노입자 온열요법 시스템을 설계하고 구성하는 데 사용되는 방법과 고려해야 할 중요한 사용 요소에 대해 논의합니다. 설명된 시스템은 자성 나노입자 온열요법의 견고하고 일관되며 생물학적으로 적절하고 안전하며 잘 제어된 전달을 가능하게 합니다. 마지막으로, 우리가 수행하는 mNPH 연구에는 종종 방사선, 화학 요법 및 면역 요법과 같은 다른 치료법이 포함된다는 점에 유의해야합니다. 이러한 결과가 의미가 있으려면 전달 된 열이 다른 양식의 효능 및 / 또는 안전성 독성 (또는 그 반대)과 동물의 웰빙에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 결정하는 것이 중요합니다. 이러한 이유와 앞서 언급한 선량 측정 및 치료 상황 때문에, 자성 나노입자 온열요법 투여 정확도와 연속 코어 및 목표 온도 측정에 엄격한 주의를 기울이는 것이 필수적이다. 이 프로토콜의 목표는 안전하고 효과적인 자성 나노입자 온열요법을 전달하기 위한 간단하고 일관된 방법과 설명을 제공하는 것입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>.25% Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-664</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf 22363204</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16F10 murine melanoma cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-6475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/Bl6 mice</td>
			<td>Charles river</td>
			<td>027C57BL/6</td>
			<td>6-week-old female mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chiller</td>
			<td>Thermal Care</td>
			<td>NQ 5 series</td>
			<td>chiller that cools the coil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coolant fluid</td>
			<td>Dow Chemical Company</td>
			<td>Dowtherm SR-1</td>
			<td>antenna cooling fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fiber optic probes, software and chassis</td>
			<td>FISO</td>
			<td></td>
			<td>FISO evolution software used to read the temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR camera</td>
			<td>Flir</td>
			<td></td>
			<td>infrared camera to monitor unintentional heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iron oxide nanoparticles</td>
			<td>micromod Partikeltechnologie GmbH</td>
			<td>Bionized NanoFerrite</td>
			<td>dextran coated iron oxide nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse coil, solenoid</td>
			<td>Fluxtrol</td>
			<td>custom built</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-652</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF generator</td>
			<td>Huttinger</td>
			<td>TIG 10/300</td>
			<td>power source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI media</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-396</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo delivery of magnetic nanoparticle hyperthermia using a custom-built delivery system

고열은 오랫동안 암 치료에 사용되어 왔습니다. 기술은 뜨거운 철봉의 종양 내 삽입에서 39 ° C (발열 수준)에서 1,000 ° C (전기 소작)까지의 온도에서 전신적으로 전달되는 종양 항체 표적 자성 나노 입자에 이르기까지 다양하며 치료 시간은 몇 초에서 몇 시간까지 다양합니다. 온도-시간 관계(열 선량)는 높은 열 선량으로 인해 조직 절제를 일으키고 열 선량을 낮추면 혈류 증가, 약물 축적 및 면역 자극과 같은 치사 효과가 발생합니다. 현재 가장 유망한 의료 요법 중 하나는 자성 나노입자 온열요법(mNPH)입니다. 이 기술은 비 침습적, 무독성 교류 자기장으로 전신 또는 종양 내로 전달 될 수있는 자성 나노 입자를 활성화하는 것을 포함합니다. 자성 나노 입자의 크기, 구성 및 결합과 자기장의 주파수 및 전계 강도는 주요 가열 결정 요인입니다. 당사는 크고 작은 동물 모델과 배양된 세포에서 재현 가능한 자성 나노입자 온열요법을 전달하기 위한 정교한 기기와 기술을 개발했습니다. 여러 위치에서 연속적인 실시간 온도 모니터링을 사용하는 이 접근 방식은 비표적 조직 가열을 제한하면서 표적 조직(종양) 또는 세포에 잘 정의된 열 투여량을 전달할 수 있습니다. 여러 현장에서 온도를 정밀하게 제어 및 모니터링하고 산업 표준 알고리즘(43°C/CEM43에서 누적 등가 시간)을 사용하여 열 선량을 정확하게 결정하고 정량화할 수 있습니다. 다양한 온도, 열 선량 및 생물학적 효과를 허용하는 당사의 시스템은 상업적 인수와 사내 엔지니어링 및 생물학 개발의 조합을 통해 개발되었습니다. 이 시스템은 생체외, 시험관내 및 생체내 기술 간의 신속한 전환을 허용하는 방식으로 최적화되었다. 이 프로토콜의 목표는 재현 가능하고 정확한 자성 나노입자 치료(mNP) 온열요법을 제공하기 위한 효과적인 기술과 시스템을 설계, 개발 및 구현하는 방법을 입증하는 것입니다.

시험관 내 연구 세포는 자성 나노 입자 / 철과 AMF의 양과 농도가 적절하게 일치하는 경우에만 원하는 온도와 열 선량을 달성하고 유지합니다. 자성 나노입자를 사용하여 체외(및 생체 내)에서 세포를 가열할 때, 내재화된 자성 나노입자가 있는 세포에서 온열요법을 달성하려면 특정 수준의 세포 내 mNP/Fe가 필요하며 mNP 로딩 세포의 수와 근접성이 서로 필요하다는 점에 유의해야 합?...

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In Vitro and In Vivo Delivery of Magnetic Nanoparticle Hyperthermia Using a Custom-Built Delivery System

이 프로토콜은 정교한 전달 및 모니터링 시스템을 사용하여 자성 나노입자 온열요법의 정확한 전달에 필요한 기술과 방법론을 제시합니다.

맞춤형 전달 시스템을 사용한 자성 나노입자 온열요법의 체외 및 생체 내 전달

Hyperthermia has long been used in the treatment of cancer. Techniques have varied from the intra-tumoral insertion of hot iron rods, to systemically ...

in-vitro-vivo-delivery-magnetic-nanoparticle-hyperthermia-using

Research

JoVE Journal

Medicine

4.2K 조회수.  Dartmouth College. 이 프로토콜은 정교한 전달 및 모니터링 시스템을 사용하여 자성 나노입자 온열요법의 정확한 전달에 필요한 기술과 방법론을 제시합니다.

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Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery. Fresh patient tissue obtained at the time of surgery is sliced and maintained in culture. The ex vivo model system allows for the physical delivery of genes into intact patient tissue and gene expression is analysed by bioluminescence imaging using the IVIS detection system. The bioluminescent detection system demonstrates rapid and accurate quantification of gene expression within individual slices without the need for tissue sacrifice. This slice tissue culture system may be used in a variety of tissue types including normal and malignant tissue and allows us to study the effects of the heterogeneous nature of intact tissue and the high degree of variability between individual patients. This model system could be used in certain situations as an alternative to animal models and as a complementary preclinical mode prior to entering clinical trial.

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This article describes the culture of patient tissue slices for gene delivery studies and subsequent analysis of gene expression using IVIS bioluminescence imaging.

환자 조직 및 유전자 전달의 시험 전의 VIVO 문화

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

연구

의학

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue revascularization and cell survival. In addition, further observations revealed that specific stem cells, such as cardiac stem cells, mesenchymal stem cells and cardiospheres have the ability to integrate within the surrounding myocardium by differentiating into cardiomyocytes, smooth muscle cells and endothelial cells.
Here, we present the materials and methods to reliably deliver noncontractile cells into the left ventricular wall of immunodepleted mice. The salient steps of this microsurgical procedure involve anesthesia and analgesia injection, intratracheal intubation, incision to open the chest and expose the heart and delivery of cells by a sterile 30-gauge needle and a precision microliter syringe.
Tissue processing consisting of heart harvesting, embedding, sectioning and histological staining showed that intramyocardial cell injection produced a small damage in the epicardial area, as well as in the ventricular wall. Noncontractile cells were retained into the myocardial wall of immunocompromised mice and were surrounded by a layer of fibrotic tissue, likely to protect from cardiac pressure and mechanical load.

Intramyocardial cell delivery in murine models of cardiovascular diseases, such as hypertension or myocardial infarction, is widely used to test the therapeutic potential of different cell types in regenerative studies. Therefore, a detailed description and a clear visualization of this surgical procedure will help to define the limits and advantages of cardiovascular cell therapeutic analyses in small rodents.

심근 내 휴대 납품 : 쥐과 마음의 관찰

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these diseases. Chronic retinal diseases such as retinal oedema or neovascularization usually require multiple intraocular injections to effectively treat the condition. However, the risks associated with these injections increase with repeated delivery of the drug. Therefore, alternative delivery methods need to be established in order to minimize the risks of reinjection. Several other investigations have developed methods to deliver drugs over extended time, through materials capable of releasing chemicals slowly into the eye. In this investigation, we outline the use of Elvax 40W, a copolymer resin, to act as a vehicle for drug delivery to the adult rat retina. The resin is made and loaded with the drug. The drug-resin complex is then implanted into the vitreous cavity, where it will slowly release the drug over time. This method was tested using 2-amino-4-phosphonobutyrate (APB), a glutamate analogue that blocks the light response of the retina. It was demonstrated that the APB was slowly released from the resin, and was able to block the retinal response by 7 days after implantation. This indicates that slow-release drug delivery using this copolymer resin is effective for treating the retina, and could be used therapeutically with further testing.

This paper details how Elvax 40W can be used as a slow-release method for drug delivery to the adult rat retina. The protocol for preparing, loading, and delivering the drug-resin complex to the eye is described.

쥐의 망막에 Elvax 40W를 통해 서방 약물 전달 : 만성 질환의 치료를위한 시사점

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences between the murine and human respiratory systems, especially in their upper respiratory tracts (URT). In some models, these differences in the murine nasal cavity can have a significant impact on disease progression and presentation in the lower respiratory tract (LRT) when using intranasal instillation techniques, potentially limiting the usefulness of the mouse model to study these diseases. For these reasons, it would be advantageous to develop a technique to instill bacteria directly into the mouse lungs in order to study LRT disease in the absence of involvement of the URT. We have termed this lung specific delivery technique intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation. This noninvasive technique minimizes the potential for instillation into the bloodstream, which can occur during more invasive traditional surgical intratracheal infection approaches, and limits the possibility of incidental digestive tract delivery. IMIT is a two-step process in which mice are first intubated, with an intermediate step to ensure correct catheter placement into the trachea, followed by insertion of a blunt needle into the catheter to mediate direct delivery of bacteria into the lung. This approach facilitates a &#62;98% efficacy of delivery into the lungs with excellent distribution of reagent throughout the lung. Thus, IMIT represents a novel approach to study LRT disease and therapeutic delivery directly into the lung, improving upon the ability to use mice as surrogates to study human respiratory disease. Furthermore, the accuracy and reproducibility of this delivery system also makes it amenable to Good Laboratory Practice Standards (GLPS), as well as delivery of a wide range of reagents which require high efficiency delivery to the lung.

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation of reagents is an excellent, noninvasive method for studying respiratory disease, as well as a method for instilling therapeutic reagents directly into the lung. It is a rapid and highly reproducible method which is suitable for preclinical testing.

삽관 매개 기관 내 (IMIT) 떨어 뜨림 : 비 침습적, 폐 별 전달 시스템

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

인간 종양 이종 이식에서 마우스 세포의 고갈은 크게 대상 세포의 다운 스트림 분석을 향상

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Intravascular Delivery of Biologics to the Rat Kidney

The renal microvascular compartment plays an important role in the progression of kidney disease and hypertension, leading to the development of End Stage Renal Disease with high risk of death for cardiovascular events. Moreover, recent clinical studies have shown that renovascular structure and function may have a great impact on functional renal recovery after surgery. Here, we describe a protocol for the delivery of drugs into the renal artery of rats. This procedure offers significant advantages over the frequently used systemic administration as it may allow a more localized therapeutic effect. In addition, the use of rodents in pharmacodynamic analysis of preclinical studies may be cost effective, paving the way for the design of translational experiments in larger animal models. Using this technique, infusion of rat recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) protein in rats has induced activation of VEGF signaling as shown by increased expression of FLK1, pAKT/AKT, pERK/ERK. In summary, we established a protocol for the intrarenal delivery of drugs in rats, which is simple and highly reproducible.

The administration of drugs for recovery of kidney function requires control of the localization and distribution of the therapeutic compound. Here, we describe in detail a simple technique for intrarenal delivery of drugs in rats. This procedure may be easily performed with no mortality and high reproducibility.

쥐의 신장에 생물의 혈관 배달

The renal microvascular compartment plays an important role in the progression of kidney disease and hypertension, leading to the development of End Stage ...

Using Multi-fluorinated Bile Acids and In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Measure Bile Acid Transport

Along with their traditional role as detergents that facilitate fat absorption, emerging literature indicates that bile acids are potent signaling molecules that affect multiple organs; they modulate gut motility and hormone production, and alter vascular tone, glucose metabolism, lipid metabolism, and energy utilization. Changes in fecal bile acids may alter the gut microbiome and promote colon pathology including cholerrheic diarrhea and colon cancer. Key regulators of fecal bile acid composition are the small intestinal Apical Sodium-dependent Bile Acid Transporter (ASBT) and fibroblast growth factor-19 (FGF19). Reduced expression and function of ASBT decreases intestinal bile acid up-take. Moreover, in vitro data suggest that some FDA-approved drugs inhibit ASBT function. Deficient FGF19 release increases hepatic bile acid synthesis and release into the intestines to levels that overwhelm ASBT. Either ASBT dysfunction or FGF19 deficiency increases fecal bile acids and may cause chronic diarrhea and promote colon neoplasia. Regrettably, tools to measure bile acid malabsorption and the actions of drugs on bile acid transport in vivo are limited. To understand the complex actions of bile acids, techniques are required that permit simultaneous monitoring of bile acids in the gut and metabolic tissues. This led us to conceive an innovative method to measure bile acid transport in live animals using a combination of proton (1H) and fluorine (19F) magnetic resonance imaging (MRI). Novel tracers for fluorine (19F)-based live animal MRI were created and tested, both in vitro and in vivo. Strengths of this approach include the lack of exposure to ionizing radiation and translational potential for clinical research and practice.

Using Multi-fluorinated Bile Acids and In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Measure Bile Acid Transport

Tools to diagnose bile acid malabsorption and measure bile acid transport in vivo are limited. An innovative approach in live animals is described that utilizes combined proton (1H) plus fluorine (19F) magnetic resonance imaging; this novel methodology has translational potential to screen for bile acid malabsorption in clinical practice.

멀티 플루오르 담즙 산 및 사용<em&gt; 생체</em&gt; 자기 공명 영상은 측정하는 담즙 산 전송

Along with their traditional role as detergents that facilitate fat absorption, emerging literature indicates that bile acids are potent signaling ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

Ivacaftor, 그것의 주요 대사 산물, 및 생물 학적 체액의 낭 성 섬유 증 환자에서 Lumacaftor의 임상 샘플의 높은 처리량 분석에 대 한 최적화 된 LC-MS/MS 방법

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

생체 외에서 혈액-뇌 장벽 돼지 뇌 내 피 세포를 기반으로 하는 모델의 설립에 대 한 방법 개선

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a promising therapeutic target in many disorders, such as autoimmune diseases, atherosclerosis, and cancer. RNAi-mediated gene silencing is a valuable approach of choice to probe and manipulate macrophage function; however, the transfection of macrophages with siRNA is often considered to be technically challenging, and, at present, few methodologies dedicated to the siRNA transfer to macrophages are available. Here, we present a protocol of using polyethyleneimine-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles (PEI-SPIONs) as a vehicle for the targeted delivery of siRNA to macrophages. PEI-SPIONs are capable of binding and completely condensing siRNA when the Fe:siRNA weight ratio reaches 4 and above. In vitro, these nanoparticles can efficiently deliver siRNA into primary macrophages, as well as into the macrophage-like RAW 264.7 cell line, without compromising cell viability at the optimal dose for transfection, and, ultimately, they induce siRNA-mediated target gene silencing. Apart from being used for in vitro siRNA transfection, PEI-SPIONs are also a promising tool for delivering siRNA to macrophages in vivo. In view of its combined features of magnetic property and gene-silencing ability, systemically administered PEI-SPION/siRNA particles are expected not only to modulate macrophage function but also to enable macrophages to be imaged and tracked. In essence, PEI-SPIONs represent a simple, safe, and effective nonviral platform for siRNA delivery to macrophages both in vitro and in vivo.

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

We describe a method of using polyethyleneimine (PEI)-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles for transfecting macrophages with siRNA. These nanoparticles can efficiently deliver siRNA to macrophages in vitro and in vivo and silence target gene expression.

Polyethyleneimine 코팅 된 산화 철 나노 입자 작은 간섭 RNA의 세포에 배달 하는 수단으로 생체 외에서 그리고 Vivo에서

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...