El estudio fue financiado por los números de subvención: NCI P30 CA023108 y NCI U54 CA151662.

El Programa de Cuidado y Uso de Animales de Dartmouth College está acreditado por la Asociación Americana para la Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (iAAALAC) y se adhiere a todas las pautas y regulaciones de UDSA y NIH (Oficina de Bienestar de Animales de Laboratorio). Todos los estudios in vivo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Dartmouth College (IACUC). El procedimiento de eutanasia se adhiere a las Directrices AVMA 2020 para la eutanasia de animales.
1. Instrumentación/diseño del sistema
<ol><li>Diseñe una antena AMF personalizada (bobina) para que sea un circuito cerrado, eligiendo formas para crear el campo magnético deseado. Utilice fórmulas y características de inductancia de la elección del generador de energía para diseñar bobinas compatibles para generar el campo deseado. Utilice diferentes diseños para experimentos in vitro e in vivo.</li>
	<li>Asegúrese de que la inductancia de la antena AMF esté dentro del rango aceptable del generador de energía. Suma o resta condensadores para que coincida (sintonice) la antena con el generador de energía.</li>
	<li>Para experimentos in vitro, diseñe una bobina helicoidal de 14 vueltas, diámetro interior 2 cm y longitud 14 cm, que pueda contener tubos de 1,5 ml, lo que permite el tratamiento de múltiples muestras simultáneamente. Aísle la bobina con un polímero de vinilo y use un espaciador de poliestireno para separar la bobina de los tubos. Los detalles de las especificaciones de diseño y las consideraciones están presentes en el Archivo Suplementario 1.</li>
	<li>Para experimentos in vivo, adquiera una bobina helicoidal de cuerpo entero construida a medida de un fabricante con información de diseño patentada. Use tubos cuadrados de 8 mm (ya que crea un campo más uniforme dentro del orificio de la bobina) y un concentrador en el área de tratamiento objetivo. Haga que el concentrador tenga 5.0 cm de largo, con un total de 5 vueltas que resultan en un diámetro interno de 3.6 cm, un diámetro exterior de 5.2 cm, y tenga su ubicación en el área de tratamiento objetivo. Rodee la bobina con una carcasa de policarbonato.</li>
	<li>Utilice un generador AMF con potencia y frecuencia ajustables, con una potencia nominal de 10 kW o superior como fuente de alimentación. La inductancia hace coincidir la fuente de alimentación y las antenas/bobinas a un rango de 0,62 a 1,18 μHenries (μH), lo que permite frecuencias que oscilan entre 30-300 kHz. Enfriar el generador utilizando agua reciclada a través de una bomba de refuerzo centrífuga, presión regulada a 50 psi.</li>
	<li>Enfríe las bobinas con un enfriador de capacidad de enfriamiento de 5.6 toneladas que bombea un fluido de transferencia de calor a base de etilenglicol al 25% diluido con agua a través de la antena AMF. Ajuste la temperatura del enfriador de tal manera que la antena no caliente ni enfríe la muestra.</li>
	<li>Para la contención del animal, construya un soporte tubular que pueda suspenderse en el centro de la bobina con un espacio de aire de 0,5 cm entre el soporte y la superficie de la bobina. Conecte una bomba de aire acondicionado ajustable que haga circular aire a través de la carcasa alrededor de la bobina y configúrela para mantener una temperatura central normal del animal. Conecte la máquina de anestesia al soporte tubular del animal cerca de la cabeza del animal para garantizar la administración adecuada de la anestesia.</li>
	<li>Para la contención celular, cree un aparato que haga circular el agua de un baño de agua a través del espaciador donde se colocan los tubos. Ajuste la temperatura de este baño de agua de tal manera que los tubos estén rodeados de agua a 37 ° C.</li>
	<li>Use sondas de fibra óptica para monitorear las temperaturas dentro del tumor, el núcleo del animal y el entorno animal o para estudios in vitro, monitoreando la temperatura del pellet celular y el agua que rodea los tubos.</li>
	<li>Utilice nanopartículas magnéticas de óxido de hierro que tengan un tamaño de 100 nm para todos los experimentos. NOTA: La concentración y la tasa de absorción específica (SAR) son dos características que deben considerarse al elegir nanopartículas, ya que afectan directamente el posible calentamiento y la dosis térmica18.</li>
</ol>2. Hipertermia in vitro
<ol><li>Cultivo de células de melanoma murino B16F10 en medios RPMI con 10% FBS y 1% Pen/estreptococo. Placa 150, 000 células/pocillo en placas de 6 pocillos, con 2 mL de medio completo.</li>
	<li>Determinar el tratamiento apropiado para cada pocillo, es decir, células sin mNPs y sin AMF, células con mNPs y sin AMF, células sin mNPs y AMF, células con mNPs y AMF. NOTA: Además, asegúrese de que haya controles apropiados si combina hipertermia con otra terapia. AMF se realiza en un laboratorio de banco de investigación estándar adaptado con las capacidades de energía y refrigeración necesarias.</li>
	<li>24 h después del enchapado, agregue mNP a los pozos apropiados según lo determinado en el paso anterior. Añadir mNPs a una concentración de 3 mg de hierro/ml. Asegúrese de que los mNP se distribuyan por todo el pozo, ya sea creando una solución de medios de stock / mNP (eliminando los medios antiguos, agregando esta solución) o agregando los mNP directamente y agitando suavemente las placas para una distribución homogénea.</li>
	<li>Comience el tratamiento, 48 h después de la adición de mNPs, cuando los pozos sean ~ 80% confluentes, eliminando los medios y lavando los pozos con medios frescos. Retire el medio.</li>
	<li>Agregue 0.5 ml de tripsina a cada estado que se esté tratando y agite suavemente. Use un microscopio para verificar que las células estén separadas.</li>
	<li>Agregue 1 ml de medio a cada pocillo para recolectar las células en tubos de 1.5 ml. Recoja todas las celdas del pozo (~1 x 106 celdas). Use un tubo separado claramente etiquetado para cada pozo.</li>
	<li>Girar los tubos a 60 x g durante 2-3 min para permitir que las células se granulen. Retener el pellet en el medio.</li>
	<li>Coloque tubos en el espaciador llenos de agua dentro de la bobina. Ajuste la temperatura del baño maría de modo que el medio y el pellet de la celda se mantengan a 37 °C. Controle la temperatura dentro del tubo y el baño de agua utilizando sondas de temperatura de fibra óptica separadas.</li>
	<li>Encienda el enfriador, verifique que el refrigerante fluya a través de la bobina. Encienda la fuente de alimentación y ajuste el porcentaje de máximo al campo deseado. Opere la bobina solenoide de 14 vueltas, alimentada por un generador de 10 kW, a 165 kHz y 23,87 kA/m (300 Oe).</li>
	<li>Coloque una sonda de temperatura de fibra óptica separada en uno de los tubos. Tratar las células hasta la dosis térmica del protocolo previamente determinada. Un ejemplo es 30 min a 43 °C (CEM43 de 30).</li>
	<li>Resuspenda las células en el medio que está en sus tubos y vuelva a colocar en nuevas placas de 6 pocillos. Etiquete claramente las nuevas placas. El objetivo es volver a platear todas las células recolectadas (~1 x 106 celdas). NOTA: Se deben usar nuevas placas de 6 pocillos para garantizar que las células que se cultivan reciban tratamiento. Si se usan las placas viejas, todavía podría haber células en las placas que no fueron tripsinizadas con éxito.</li>
	<li>Si es necesario, para el siguiente procedimiento experimental, lisar las células para el análisis de expresión de ARN o proteínas.</li>
</ol>3. Hipertermia in vivo
<ol><li>Cultivo celular e inoculación<ol><li>Cultivo de células de melanoma murino B16F10 en medios RPMI con 10% FBS y 1% Pen/estreptococo. Use platos/platos que proporcionen suficientes células para la inoculación del número deseado de animales. Por ejemplo, las placas de 10, 100 mm, chapadas a 100, 000 células serán confluentes con suficientes células para 20 inyecciones de ratones dentro de las 48 h.</li>
		<li>Tripsinizar células y recolectar usando medios RPMI puros (sin FBS o pluma/estreptococo).</li>
		<li>Cuente las células y cree una solución para la concentración deseada de células, basada en el volumen de inoculación y el número de ratones.</li>
		<li>Anestesiar ratones hembra C57Bl/6 de 6 semanas de edad usando isoflurano vaporizado y oxígeno. Coloque a los animales en una caja de plexiglás con 5% de isoflurano y 95% de oxígeno hasta que sea inducido. Una vez inducido, retirar el animal y utilizar un cono facial al 2% de isoflurano para completar los pasos 3.1.5-3.1.7 y 3.3.3-3.3.6. NOTA: Para la anestesia durante el tratamiento, use una contención de anestesia incorporada. Siga los protocolos institucionales estándar para la anestesia en ratones. Antes de la experimentación con animales, asegúrese de la aprobación adecuada de IACUC. Después de la anestesia, devuelva al animal a la jaula y controle la recuperación para asegurarse de que no haya complicaciones.</li>
		<li>Compruebe la falta de respuesta a los reflejos de enderezamiento.</li>
		<li>Afeite el flanco derecho con una afeitadora eléctrica.</li>
		<li>Limpie el área de inyección con una toallita con alcohol. Inyectar 1-2 x 106 células, utilizando una jeringa de vidrio de 100 μL con una aguja de 28 G, dispersas en 50 μL de medios por vía intradérmica en el flanco derecho afeitado de los anestesiados.</li>
	</ol></li>
	<li>Crecimiento tumoral/inyección de nanopartículas<ol><li>Mida los tumores en 3 dimensiones usando calibradores (largo, ancho y profundidad) y calcule los volúmenes por (largo x ancho x profundidad x π)/6.</li>
		<li>Cuando los volúmenes tumorales alcancen los 120 mm 3 (+/- 20 mm3), colocar los animales en estudio. Diseñar el estudio, asegurándose de que haya grupos de control y tratamiento apropiados, incluidas cohortes de terapia combinada (es decir, control, mNPH, radiación y la combinación).</li>
		<li>Anestesiar a los ratones que vayan a recibir mNPs como se describe en 3.1.4.</li>
		<li>Limpie el área con una toallita con alcohol. Inyecte mNPs en el tumor 3 h antes del tratamiento con HMA. Inyecte un volumen tal que la dosis sea de 7,5 mg de hierro/cm3 del tumor. NOTA: Los datos no publicados del laboratorio sugieren que la absorción máxima de mNP ocurre a las 3-6 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Tratamiento de la HMA<ol><li>Anestesiar el ratón y colocarlo en una almohadilla térmica para mantener la temperatura central.</li>
		<li>Compruebe la falta de respuesta a los reflejos de enderezamiento. Retire la marca auricular o cualquier otro objeto metálico del ratón.</li>
		<li>Coloque suavemente una sonda de temperatura de fibra óptica lubricada en el recto del ratón.</li>
		<li>Coloque un catéter en el tumor, retirando la aguja. Corte el catéter de manera que no sobresalga demasiado del tumor. NOTA: Los catéteres de temperatura de fibra óptica se colocan y retiran mientras los ratones están bajo anestesia general, es decir, los catéteres solo están en su lugar durante el procedimiento de calentamiento del tumor. Los ratones reciben una dosis subcutánea única de un medicamento para la analgesia AINE, ketoprofeno (5 mg / kg), en el momento del procedimiento. No hemos observado molestias o morbilidades a corto o largo plazo asociadas con la colocación de los catéteres.</li>
		<li>Inserte una sonda de temperatura de fibra óptica de 3 sensores en el catéter. El catéter protege los sensores de la sonda de temperatura de fibra óptica.</li>
		<li>Pegue la sonda rectal e intratumoral a la cola del animal para asegurarse de que permanezcan en su lugar.</li>
		<li>Coloque el mouse en un tubo de 50 ml, diríjase hacia abajo. El tubo debe tener un orificio cerca de la cabeza donde se conectará y administrará la anestesia.</li>
		<li>Coloque el tubo dentro de la bobina configurada y vuelva a conectar la anestesia.</li>
		<li>Coloque una sonda de temperatura de fibra óptica suelta en el tubo para medir la temperatura ambiente.</li>
		<li>Encienda el enfriador y asegúrese de que el refrigerante esté circulando.</li>
		<li>Compruebe y asegúrese de que el software de la computadora muestra las diversas temperaturas y comience a grabar para permitir que se muestre un cálculo CEM43 en tiempo real. El CEM43 requerido es la dosis previamente determinada. NOTA: Antes de encender el imán, asegúrese de que no haya elementos metálicos adheridos al animal, ya que se calentarán rápidamente. Además, asegúrese de que todos en la habitación no tengan un marcapasos y que sea seguro para ellos estar allí.</li>
		<li>Encienda el imán a un porcentaje de potencia bajo.</li>
		<li>Asegúrese de que las sondas de temperatura de fibra óptica registren los cambios de temperatura. Las temperaturas aumentarán una vez que se active el AMF a medida que aumenta el campo. Asegúrese de que la temperatura central del animal permanezca a 38 °C. Regule la temperatura central utilizando la camisa de aire acondicionado.</li>
		<li>Ajuste la fuerza del campo magnético cambiando la potencia del generador, utilizando el dial de control incorporado, que a su vez controla el nivel de temperatura en el tumor.</li>
		<li>Cierre la AMF una vez que se logre la dosis deseada, según lo determinado previamente por el usuario (por ejemplo, CEM43 40), dentro del tumor.</li>
		<li>Una vez que se haya apagado el AMF, retire el tubo de la bobina.</li>
		<li>Retire el ratón del tubo, extrayendo las diversas sondas y el catéter. Si es necesario, etiquete al animal con una nueva marca auricular de metal.</li>
		<li>Una vez que se completen los tratamientos, apague el enfriador.</li>
		<li>Recuperar a los animales de la anestesia asegurando que no haya complicaciones. Monitoree su comportamiento para asegurar el retorno a la normalidad.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

El diseño y la implementación de este sistema proporciona la capacidad de realizar experimentos precisos y reproducibles de hipertermia de nanopartículas magnéticas in vitro e in vivo. Es fundamental que el sistema esté diseñado de tal manera que la frecuencia AMF y la intensidad de campo se ajusten adecuadamente al tipo de nanopartícula magnética, la concentración y la ubicación y temperatura del tejido deseadas. Además, el monitoreo preciso de la temperatura en tiempo real es crucial para la seguridad y el c...

La hipertermia se ha utilizado históricamente en la terapia del cáncer, ya sea sola o en combinación con otros tratamientos. Aunque tiene una larga historia de uso, el método más ventajoso para administrar este tratamiento aún se está debatiendo y depende del sitio y la ubicación de la enfermedad. Los métodos para la administración de hipertermia incluyen microondas, radiofrecuencia, ultrasonido focalizado, láser y nanopartículas metálicas (como oro u óxido de hierro)1,2,3,4. Estos métodos de administración pueden conducir a un rango de temperaturas de tratamiento desde el nivel de fiebre hasta cientos de grados C. El efecto biológico de la hipertermia depende principalmente de las temperaturas utilizadas y de la duración del tratamiento5. Para este manuscrito y propósito, nos estamos centrando en la hipertermia de nanopartículas magnéticas (mNPH). Este método permite cambios de temperatura enfocados, localizados, bien monitoreados y controlados, utilizando nanopartículas de óxido de hierro no tóxicas, aprobadas por la FDA.
Una trampa de otras modalidades de hipertermia es la falta de orientación celular precisa; La hipertermia no tiene una relación terapéutica inherentemente alta, por lo tanto, es necesaria una termometría cuidadosa y una focalización6. mNPH permite la inyección sistémica o intratumoral de mNPs, y el calor solo se genera donde se encuentran los mNPs, dirigiendo así el tratamiento directamente al tumor. mNPH puede ser eficaz cuando las nanopartículas magnéticas se encuentran dentro o fuera de la célula. Para la terapia del cáncer, la visión general de mNPH es que las nanopartículas magnéticas se inyectan (intratumoral o intravenosamente), luego se aplica un campo magnético alterno, lo que hace que los polos magnéticos de nanopartículas se realineen constantemente, lo que lleva a un calentamiento localizado de las células y tejidos asociados con las nanopartículas 7,8 . Al ajustar el volumen de nanopartículas y la frecuencia / fuerza del campo magnético alterno (AMF), es posible controlar cuidadosamente la temperatura generada dentro del tejido.
Este tratamiento funciona bien en tumores que están cerca de la superficie del cuerpo, ya que los tumores más profundos requieren una AMF más fuerte, por lo que el riesgo de calentamiento por corrientes de Foucault aumenta9. Existe evidencia de que la hipertermia se utiliza clínicamente como monoterapia, sin embargo, a menudo la hipertermia se combina con radioterapia o quimioterapia, lo que lleva a un efecto anticancerígeno más dirigido10,11,12. La evidencia clínica de hipertermia que funciona en combinación con radioterapia se revisa en una publicación anterior13. Nuestro laboratorio ha tratado con éxito una variedad de animales, desde ratones hasta cerdos y cánceres caninos espontáneos, utilizando el método mNPH12,14,15. Este protocolo está diseñado para aquellos interesados en investigar los efectos del tratamiento de la hipertermia localizada, ya sea solo o en combinación con otras terapias.
Uno de los factores más importantes en la hipertermia es poder medir y comprender, en tiempo real, la dosis térmica que se administra al tejido diana/tumoral. Una forma estándar de calcular y comparar la dosis es mediante la demostración de los minutos equivalentes acumulados de calentamiento a 43 °C; Este algoritmo permite la comparación de dosis independientes del sistema de administración, temperaturas máximas y mínimas (dentro de un rango específico) y parámetros de calentamiento / enfriamiento 5,16. El cálculo CEM funciona mejor para temperaturas entre 39-57 °C5. Por ejemplo, en algunos de los estudios que hemos realizado, hemos elegido una dosis térmica de CEM43 30 (es decir, 30 min a 43 °C). La elección de esta dosis nos permitió observar efectos inmunogenéticos seguros y efectivos in vitro, tanto solos como en combinación con una sola dosis de radiación17.
Con la hipertermia de nanopartículas magnéticas, hay varios factores que deben considerarse en la construcción de un sistema de administración apropiado. El diseño de la instrumentación incluye importantes factores de seguridad, como el uso de un enfriador para garantizar que el equipo de suministro de campo magnético permanezca frío incluso cuando se opera a alta potencia, y procedimientos a prueba de fallas que evitan que el sistema se encienda si no se han activado todos los sistemas de temperatura, evaluación de potencia y control. Además, hay factores biológicos importantes que deben considerarse tanto para situaciones in vivo como in vitro. Cuando se utilizan células cultivadas, es necesario tratar en medios de crecimiento y mantener a una temperatura viable constante para evitar cambios fisiológicos que podrían afectar los resultados. Para los tipos de nanopartículas individuales, es importante conocer la tasa de absorción específica (SAR) al calcular los parámetros de calentamiento basados en AMF. Del mismo modo, es importante conocer la concentración de mNP/Fe, en células y tejidos, que es necesaria para lograr el calentamiento deseado. Los métodos in vivo requieren aún más atención a los detalles, ya que el animal debe mantenerse bajo anestesia durante el tratamiento y la temperatura corporal central del animal debe mantenerse a un nivel normal durante todo el tratamiento. Permitir que la temperatura corporal del animal baje, como sucede bajo anestesia, puede afectar los resultados generales, con respecto a la dosis térmica del tejido que se está tratando.
En este manuscrito, discutimos los métodos utilizados para diseñar y construir un sistema versátil de hipertermia de nanopartículas magnéticas, así como los factores de uso importantes que deben considerarse. El sistema descrito permite la entrega robusta, consistente, biológicamente apropiada, segura y bien controlada de la hipertermia de nanopartículas magnéticas. Finalmente, debe tenerse en cuenta que los estudios de mNPH que realizamos a menudo involucran otras terapias como radiación, quimioterapia e inmunoterapia. Para que estos resultados sean significativos, es importante determinar cómo el calor suministrado puede afectar la eficacia y/o seguridad-toxicidad de otras modalidades (o viceversa) y el bienestar del animal. Por esta razón y las situaciones dosimétricas y terapéuticas mencionadas anteriormente, es esencial prestar estricta atención a la precisión de la dosificación de hipertermia de nanopartículas magnéticas y las mediciones continuas del núcleo y la temperatura objetivo. El objetivo de este protocolo es proporcionar un método y una descripción sencillos y consistentes para la administración de hipertermia de nanopartículas magnéticas segura y efectiva.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>.25% Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-664</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf 22363204</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16F10 murine melanoma cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-6475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/Bl6 mice</td>
			<td>Charles river</td>
			<td>027C57BL/6</td>
			<td>6-week-old female mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chiller</td>
			<td>Thermal Care</td>
			<td>NQ 5 series</td>
			<td>chiller that cools the coil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coolant fluid</td>
			<td>Dow Chemical Company</td>
			<td>Dowtherm SR-1</td>
			<td>antenna cooling fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fiber optic probes, software and chassis</td>
			<td>FISO</td>
			<td></td>
			<td>FISO evolution software used to read the temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR camera</td>
			<td>Flir</td>
			<td></td>
			<td>infrared camera to monitor unintentional heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iron oxide nanoparticles</td>
			<td>micromod Partikeltechnologie GmbH</td>
			<td>Bionized NanoFerrite</td>
			<td>dextran coated iron oxide nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse coil, solenoid</td>
			<td>Fluxtrol</td>
			<td>custom built</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-652</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF generator</td>
			<td>Huttinger</td>
			<td>TIG 10/300</td>
			<td>power source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI media</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-396</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo delivery of magnetic nanoparticle hyperthermia using a custom-built delivery system

La hipertermia se ha utilizado durante mucho tiempo en el tratamiento del cáncer. Las técnicas han variado desde la inserción intratumoral de barras de hierro calientes, hasta nanopartículas magnéticas dirigidas a anticuerpos tumorales administradas sistémicamente, a temperaturas de 39 ° C (nivel de fiebre) a 1.000 ° C (electrocauterio) y tiempos de tratamiento de segundos a horas. La relación temperatura-tiempo (dosis térmica) dicta el efecto con altas dosis térmicas que resultan en la ablación tisular y dosis térmicas más bajas que resultan en efectos subletales como aumento del flujo sanguíneo, acumulación de medicamentos y estimulación inmune. Una de las terapias médicas actuales más prometedoras es la hipertermia por nanopartículas magnéticas (mNPH). Esta técnica consiste en activar nanopartículas magnéticas, que pueden administrarse sistémica o intratumoralmente, con un campo magnético alterno no invasivo y no tóxico. El tamaño, la construcción y la asociación de las nanopartículas magnéticas y la frecuencia y la intensidad de campo del campo magnético son los principales determinantes del calentamiento. Hemos desarrollado instrumentación y técnicas sofisticadas para administrar hipertermia de nanopartículas magnéticas reproducibles en modelos de animales grandes y pequeños y células cultivadas. Este enfoque, que utiliza un monitoreo continuo de la temperatura en tiempo real en múltiples ubicaciones, permite la administración de dosis térmicas bien definidas al tejido o células diana (tumor) al tiempo que limita el calentamiento del tejido no objetivo. El control y monitoreo precisos de la temperatura, en múltiples sitios, y el uso del algoritmo estándar de la industria (minutos equivalentes acumulados a 43 ° C / CEM43), permite una determinación y cuantificación precisas de la dosis térmica. Nuestro sistema, que permite una amplia variedad de temperaturas, dosis térmicas y efectos biológicos, se desarrolló a través de una combinación de adquisiciones comerciales y desarrollos internos de ingeniería y biología. Este sistema ha sido optimizado de una manera que permite la rápida conversión entre técnicas ex vivo, in vitro e in vivo. El objetivo de este protocolo es demostrar cómo diseñar, desarrollar e implementar una técnica y un sistema efectivos para administrar hipertermia de terapia de nanopartículas magnéticas (mNP) reproducible y precisa.

Estudios in vitro Las células solo alcanzarán y mantendrán la temperatura deseada y la dosis térmica si la cantidad y la concentración de las nanopartículas magnéticas / hierro y el AMF se combinan adecuadamente. Cuando se utilizan nanopartículas magnéticas para calentar células in vitro (e in vivo), debe tenerse en cuenta que para lograr hipertermia en células con nanopartículas magnéticas internalizadas, será necesario un nivel específico de mNP / Fe intracelular, y será necesario el...

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In Vitro and In Vivo Delivery of Magnetic Nanoparticle Hyperthermia Using a Custom-Built Delivery System

Este protocolo presenta las técnicas y la metodología necesarias para la entrega precisa de la hipertermia de nanopartículas magnéticas utilizando un sofisticado sistema de entrega y monitoreo.

Entrega in vitro e in vivo de hipertermia de nanopartículas magnéticas utilizando un sistema de administración personalizado

Hyperthermia has long been used in the treatment of cancer. Techniques have varied from the intra-tumoral insertion of hot iron rods, to systemically ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

4.2K vistas.  Dartmouth College. Este protocolo presenta las técnicas y la metodología necesarias para la entrega precisa de la hipertermia de nanopartículas magnéticas utilizando un sofisticado sistema de entrega y monitoreo.

Video: In Vitro and In Vivo Delivery of Magnetic Nanoparticle Hyperthermia Using a Custom-Built Delivery System

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery. Fresh patient tissue obtained at the time of surgery is sliced and maintained in culture. The ex vivo model system allows for the physical delivery of genes into intact patient tissue and gene expression is analysed by bioluminescence imaging using the IVIS detection system. The bioluminescent detection system demonstrates rapid and accurate quantification of gene expression within individual slices without the need for tissue sacrifice. This slice tissue culture system may be used in a variety of tissue types including normal and malignant tissue and allows us to study the effects of the heterogeneous nature of intact tissue and the high degree of variability between individual patients. This model system could be used in certain situations as an alternative to animal models and as a complementary preclinical mode prior to entering clinical trial.

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This article describes the culture of patient tissue slices for gene delivery studies and subsequent analysis of gene expression using IVIS bioluminescence imaging.

Ex Vivo Cultura de tejido del paciente y examen de la entrega de genes

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Investigación

Medicina

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue revascularization and cell survival. In addition, further observations revealed that specific stem cells, such as cardiac stem cells, mesenchymal stem cells and cardiospheres have the ability to integrate within the surrounding myocardium by differentiating into cardiomyocytes, smooth muscle cells and endothelial cells.
Here, we present the materials and methods to reliably deliver noncontractile cells into the left ventricular wall of immunodepleted mice. The salient steps of this microsurgical procedure involve anesthesia and analgesia injection, intratracheal intubation, incision to open the chest and expose the heart and delivery of cells by a sterile 30-gauge needle and a precision microliter syringe.
Tissue processing consisting of heart harvesting, embedding, sectioning and histological staining showed that intramyocardial cell injection produced a small damage in the epicardial area, as well as in the ventricular wall. Noncontractile cells were retained into the myocardial wall of immunocompromised mice and were surrounded by a layer of fibrotic tissue, likely to protect from cardiac pressure and mechanical load.

Intramyocardial cell delivery in murine models of cardiovascular diseases, such as hypertension or myocardial infarction, is widely used to test the therapeutic potential of different cell types in regenerative studies. Therefore, a detailed description and a clear visualization of this surgical procedure will help to define the limits and advantages of cardiovascular cell therapeutic analyses in small rodents.

Intramiocárdica celular de la entrega: Las observaciones en murinos Hearts

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these diseases. Chronic retinal diseases such as retinal oedema or neovascularization usually require multiple intraocular injections to effectively treat the condition. However, the risks associated with these injections increase with repeated delivery of the drug. Therefore, alternative delivery methods need to be established in order to minimize the risks of reinjection. Several other investigations have developed methods to deliver drugs over extended time, through materials capable of releasing chemicals slowly into the eye. In this investigation, we outline the use of Elvax 40W, a copolymer resin, to act as a vehicle for drug delivery to the adult rat retina. The resin is made and loaded with the drug. The drug-resin complex is then implanted into the vitreous cavity, where it will slowly release the drug over time. This method was tested using 2-amino-4-phosphonobutyrate (APB), a glutamate analogue that blocks the light response of the retina. It was demonstrated that the APB was slowly released from the resin, and was able to block the retinal response by 7 days after implantation. This indicates that slow-release drug delivery using this copolymer resin is effective for treating the retina, and could be used therapeutically with further testing.

This paper details how Elvax 40W can be used as a slow-release method for drug delivery to the adult rat retina. The protocol for preparing, loading, and delivering the drug-resin complex to the eye is described.

De liberación lenta Drug Delivery través Elvax 40W a la Rata Retina: Implicaciones para el tratamiento de condiciones crónicas

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences between the murine and human respiratory systems, especially in their upper respiratory tracts (URT). In some models, these differences in the murine nasal cavity can have a significant impact on disease progression and presentation in the lower respiratory tract (LRT) when using intranasal instillation techniques, potentially limiting the usefulness of the mouse model to study these diseases. For these reasons, it would be advantageous to develop a technique to instill bacteria directly into the mouse lungs in order to study LRT disease in the absence of involvement of the URT. We have termed this lung specific delivery technique intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation. This noninvasive technique minimizes the potential for instillation into the bloodstream, which can occur during more invasive traditional surgical intratracheal infection approaches, and limits the possibility of incidental digestive tract delivery. IMIT is a two-step process in which mice are first intubated, with an intermediate step to ensure correct catheter placement into the trachea, followed by insertion of a blunt needle into the catheter to mediate direct delivery of bacteria into the lung. This approach facilitates a &#62;98% efficacy of delivery into the lungs with excellent distribution of reagent throughout the lung. Thus, IMIT represents a novel approach to study LRT disease and therapeutic delivery directly into the lung, improving upon the ability to use mice as surrogates to study human respiratory disease. Furthermore, the accuracy and reproducibility of this delivery system also makes it amenable to Good Laboratory Practice Standards (GLPS), as well as delivery of a wide range of reagents which require high efficiency delivery to the lung.

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation of reagents is an excellent, noninvasive method for studying respiratory disease, as well as a method for instilling therapeutic reagents directly into the lung. It is a rapid and highly reproducible method which is suitable for preclinical testing.

La intubación mediada intratraqueal (IMIT) instilación: A, Sistema de Entrega de pulmón-específica no invasiva

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

El agotamiento de las células de ratón a partir de xenoinjertos de tumores humanos mejora significativamente análisis de aguas abajo de las células diana

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Intravascular Delivery of Biologics to the Rat Kidney

The renal microvascular compartment plays an important role in the progression of kidney disease and hypertension, leading to the development of End Stage Renal Disease with high risk of death for cardiovascular events. Moreover, recent clinical studies have shown that renovascular structure and function may have a great impact on functional renal recovery after surgery. Here, we describe a protocol for the delivery of drugs into the renal artery of rats. This procedure offers significant advantages over the frequently used systemic administration as it may allow a more localized therapeutic effect. In addition, the use of rodents in pharmacodynamic analysis of preclinical studies may be cost effective, paving the way for the design of translational experiments in larger animal models. Using this technique, infusion of rat recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) protein in rats has induced activation of VEGF signaling as shown by increased expression of FLK1, pAKT/AKT, pERK/ERK. In summary, we established a protocol for the intrarenal delivery of drugs in rats, which is simple and highly reproducible.

The administration of drugs for recovery of kidney function requires control of the localization and distribution of the therapeutic compound. Here, we describe in detail a simple technique for intrarenal delivery of drugs in rats. This procedure may be easily performed with no mortality and high reproducibility.

Intravascular de entrega de los productos biológicos para el riñón de rata

The renal microvascular compartment plays an important role in the progression of kidney disease and hypertension, leading to the development of End Stage ...

Using Multi-fluorinated Bile Acids and In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Measure Bile Acid Transport

Along with their traditional role as detergents that facilitate fat absorption, emerging literature indicates that bile acids are potent signaling molecules that affect multiple organs; they modulate gut motility and hormone production, and alter vascular tone, glucose metabolism, lipid metabolism, and energy utilization. Changes in fecal bile acids may alter the gut microbiome and promote colon pathology including cholerrheic diarrhea and colon cancer. Key regulators of fecal bile acid composition are the small intestinal Apical Sodium-dependent Bile Acid Transporter (ASBT) and fibroblast growth factor-19 (FGF19). Reduced expression and function of ASBT decreases intestinal bile acid up-take. Moreover, in vitro data suggest that some FDA-approved drugs inhibit ASBT function. Deficient FGF19 release increases hepatic bile acid synthesis and release into the intestines to levels that overwhelm ASBT. Either ASBT dysfunction or FGF19 deficiency increases fecal bile acids and may cause chronic diarrhea and promote colon neoplasia. Regrettably, tools to measure bile acid malabsorption and the actions of drugs on bile acid transport in vivo are limited. To understand the complex actions of bile acids, techniques are required that permit simultaneous monitoring of bile acids in the gut and metabolic tissues. This led us to conceive an innovative method to measure bile acid transport in live animals using a combination of proton (1H) and fluorine (19F) magnetic resonance imaging (MRI). Novel tracers for fluorine (19F)-based live animal MRI were created and tested, both in vitro and in vivo. Strengths of this approach include the lack of exposure to ionizing radiation and translational potential for clinical research and practice.

Using Multi-fluorinated Bile Acids and In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Measure Bile Acid Transport

Tools to diagnose bile acid malabsorption and measure bile acid transport in vivo are limited. An innovative approach in live animals is described that utilizes combined proton (1H) plus fluorine (19F) magnetic resonance imaging; this novel methodology has translational potential to screen for bile acid malabsorption in clinical practice.

El uso de ácidos biliares y Multi-fluorados<em&gt; En Vivo</em&gt; Imagen de Resonancia Magnética para medir el transporte de ácidos biliares

Along with their traditional role as detergents that facilitate fat absorption, emerging literature indicates that bile acids are potent signaling ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

Método optimizado de LC-MS/MS para el análisis de alto rendimiento de las muestras clínicas de Ivacaftor, sus principales metabolitos y Lumacaftor en fluidos biológicos de pacientes con Fibrosis quística

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Mejor método para el establecimiento de un In Vitro Barrera Blood - Brain modelo basado en las células endoteliales de cerebro porcino

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a promising therapeutic target in many disorders, such as autoimmune diseases, atherosclerosis, and cancer. RNAi-mediated gene silencing is a valuable approach of choice to probe and manipulate macrophage function; however, the transfection of macrophages with siRNA is often considered to be technically challenging, and, at present, few methodologies dedicated to the siRNA transfer to macrophages are available. Here, we present a protocol of using polyethyleneimine-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles (PEI-SPIONs) as a vehicle for the targeted delivery of siRNA to macrophages. PEI-SPIONs are capable of binding and completely condensing siRNA when the Fe:siRNA weight ratio reaches 4 and above. In vitro, these nanoparticles can efficiently deliver siRNA into primary macrophages, as well as into the macrophage-like RAW 264.7 cell line, without compromising cell viability at the optimal dose for transfection, and, ultimately, they induce siRNA-mediated target gene silencing. Apart from being used for in vitro siRNA transfection, PEI-SPIONs are also a promising tool for delivering siRNA to macrophages in vivo. In view of its combined features of magnetic property and gene-silencing ability, systemically administered PEI-SPION/siRNA particles are expected not only to modulate macrophage function but also to enable macrophages to be imaged and tracked. In essence, PEI-SPIONs represent a simple, safe, and effective nonviral platform for siRNA delivery to macrophages both in vitro and in vivo.

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

We describe a method of using polyethyleneimine (PEI)-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles for transfecting macrophages with siRNA. These nanoparticles can efficiently deliver siRNA to macrophages in vitro and in vivo and silence target gene expression.

Nanopartículas de óxido de hierro recubierto de polietilamina como vehículo para la entrega de ARN interferente pequeño a los macrófagos In Vitro e In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...