Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé accorde 2 R15 GM061539-02 (à BAS), 2 R15 NS40425-03 (à JEL), MH 66179 (Dr Gary banquier de l&#39;Oregon Health &amp; Science University / OHSU), et P30 NS061800 (Dr Sue Aicher de OHSU). Nous remercions Barbara Smoody pour un large soutien à la culture de neurones de l&#39;hippocampe, et les Drs. Brian Long et James Abney pour une lecture critique de ce manuscrit.

1. Préparation de l&#39;échantillon <ol><li> Préparer l&#39;ADN codant pour une chimère photoconvertible ou photoactivable de VJCs ciblée, en utilisant des techniques de biologie moléculaire standard. Remarque: Une possibilité est l&#39;ADN codant pour un activateur tissulaire du plasminogène-Dendra2 chimère (tPA-Dendra2). Dendra2 est une protéine photoconvertible qui passe du vert au rouge émission lors de l&#39;exposition à la lumière ultraviolette 12. </li><li> Culture neurones de l&#39;hippocampe sur la haute performance # 1.5 couvercle glisse pour ~ 5-10 jours, à la suite de protocoles standard 13. </li><li> Transfecter le développement des neurones d&#39;hippocampe en utilisant un réactif lipidique cationique. Remarque: L&#39;infection virale médiée est plus efficace pour les neurones matures. Cette approche alternative a été décrite en détail par ailleurs 14. <ol><li> Préparer un tube de 1,5 ml contenant ~ 1 pg d&#39;ADN et 250 microlitres de milieu minimum essentiel (MEM) et un second tube de 1,5 ml contenant 4 pi de réactif lipidique cationique et 250 ulMEM. </li><li> Incuber les solutions pendant 5 min. </li><li> On combine les deux solutions et laisser incuber le mélange résultant pendant 30 min supplémentaires. </li><li> Au cours de l&#39;incubation, préparer un plat contenant plusieurs ml de milieu de culture chauffé à 37 ° C. </li><li> Transférer doucement lamelles contenant les neurones dans le plat contenant un milieu chaud et ajouter le mélange de transfection. </li><li> Inclinez le plat doucement puis le placer dans un incubateur à 37 ° C pendant 90 min. </li><li> Neurones revenir à leur «plat de la maison&quot; et attendre ~ 12-18 heures. </li></ol></li><li> Fixer les cellules pendant 45 min dans du paraformaldéhyde 4% / 4% de saccharose dans du tampon phosphate salin (PBS, pH 7,4) chauffé à 37 ° C. Remarque: Dans les expériences PALM, il est important d&#39;obtenir une bonne conservation de l&#39;ultrastructure et protocoles formaldéhyde de fixation standards utilisés pour la coloration par immunofluorescence sont généralement pas suffisant 15. Une raison importante pour mauvaise conservation structurelle est insuffisante ftemps de ixation parce formaldéhyde fixation implique la formation de produit d&#39;addition et la réticulation de protéines, et le dernier procédé est assez lent 16. A 45 min de fixation permet d&#39;atténuer ce problème sans perte induite de overfixation détectable de la fluorescence. </li><li> couverture de lavage glisse ~ 10x avec filtre PBS. Note: Ceci réduit les contaminants fluorescents. échantillons d&#39;image relativement rapidement après la fixation. Dans les cellules, des magasins intermédiaires à 4 ° C dans PBS filtrée dans un récipient étanche à la lumière. </li><li> Lamelles de montage contenant les neurones dans une chambre en filtrée PBS. Note: L&#39;échantillon doit être placé dans un milieu aqueux, comme du PBS, avec l&#39;indice de réfraction plus faible que celle du verre, à mettre en oeuvre une fluorescence totale de réflexion interne (TIRF) à base d&#39;illumination. Éclairage à base FRBR-est très utile car seuls couverture fluorophores glissement proximale sont excités, et il ya une baisse importante associée à la fluorescence de fond 17. </li></ol> Image 2. Acquisition &lt;/ P&gt; <ol><li> Allumez le système d&#39;imagerie super-résolution. <ol><li> Allumer la lampe à arc. </li><li> Retournez le &quot;système / PC&quot; et interrupteurs «composants» (sur l&#39;interrupteur de puissance) sur «on». </li><li> Allumez l&#39;ordinateur (après la station comprimé / d&#39;accueil de contrôle de microscope vient sur). Note: La station d&#39;accueil peut être utilisé pour contrôler et surveiller de nombreux attributs de l&#39;optique et chemin de lumière, notamment le choix de l&#39;objectif et de concentration. </li><li> Double-cliquez sur l&#39;icône du logiciel et choisissez l&#39;option &quot;système de démarrage&quot; dans la boîte de dialogue de connexion. </li></ol></li><li> Examiner l&#39;échantillon. <ol><li> Ouvrez le capot avant et les panneaux d&#39;accès haut sur l&#39;armoire de sécurité laser. </li><li> Inclinez le bras de lumière transmise pour accéder à la scène et objectifs. </li><li> Mettez l&#39;huile sur le Plan-Apochromat 100X ouverture numérique alpha / NA = 1,46 (FRBR) objectif. Remarque: Un objectif 63X haute NA peut être utilisé en lieu et place de la 100X. </li><li> Monter l&#39;échantillon sur la scène, et augmenter èmeobjectif de e vers l&#39;échantillon. </li><li> Surveiller la position de la lentille en utilisant la fonction XYZ de la station d&#39;accueil. Arrêtez-vous lorsque la lentille est dans le stade de mise au point (par exemple, z ~ 2,50 mm). </li><li> Fermer complètement les panneaux d&#39;accès. Remarque: Pour engager la sécurité laser. </li><li> Affiner la mise au point avec les oculaires et des boutons dans l&#39;onglet localiser. Remarque: L&#39;onglet localiser donne accès à des boutons qui produisent un éclairage sur la base de la lampe à arc et facilite l&#39;observation directe de l&#39;échantillon avec les oculaires. De même, l&#39;onglet d&#39;acquisition donne accès à des outils qui produisent un éclairage au laser et facilite la capture d&#39;image par la caméra. <ol><li> Allez à l&#39;onglet localiser, choisissez &quot;Trans On». </li><li> Cliquez sur le symbole d&#39;extension oculaire. Note: Ceci nous amène à un schéma de la trajectoire de la lumière. Attributs de la trajectoire de la lumière peuvent être modifiés en cliquant gauche icônes appropriées dans le schéma ou en utilisant l&#39;écran tactile de la station d&#39;accueil. Par exemple, un filtreadapté pour les émissions de Dendra2 peut être choisie en utilisant l&#39;icône réflecteur revolver. </li><li> Regardez dans les oculaires, et d&#39;amener les cellules au point en utilisant la station d&#39;accueil comme un guide. Note: L&#39;échantillon sera très peu peuplée avec des cellules fluorescentes parce que les neurones de l&#39;hippocampe sont difficiles à transfecter, et il peut donc être un peu difficile de se concentrer en utilisant un éclairage réfléchi. Si tel est le cas, utiliser l&#39;éclairage par transmission et z lecture de la station d&#39;accueil en tant que guide. </li><li> Basculer la lumière &quot;Off&quot; après mise au point. </li></ol></li></ol></li><li> Identifier une cellule qui est assez lumineux, présente fluorescence ponctuée, et a une morphologie classique qui est indicatif d&#39;une bonne santé. <ol><li> Choisissez la lumière réfléchie et la filtre approprié pour la visualisation émission verte de Dendra2. </li><li> Balayez la lamelle de cellules exprimant des chimères Dendra2 utilisant la lumière faible d&#39;excitation d&#39;intensité. </li></ol></li><li> Passez à l&#39;acquisition onglet. <ol><li> Utilisez le «gestionnaire de l&#39;expérience&quot; pour charger une configuration d&#39;acquisition PALM qui est bien conçu ou modifié facilement. Remarque: Si aucune expérience existe, concevoir une configuration expérimentale de départ en utilisant les paramètres suivants comme guide: curseurs de puissance de laser: 405 nm (~ 0,01% pour un laser de 50 mW); 488 nm (~ 3% pour un laser de 100 mW); 561 nm (~ 40%, pour un laser de 100 mW); Temps d&#39;exposition: ~ 50 ms; le gain de la caméra: ~ 200; Acquisition multidimensionnelle: séries chronologiques (cycles = 30 000, intervalle = 0); Tracks: 488 nm avec épi-illumination, et 561 nm avec un éclairage à base de la FRBR (voir l&#39;étape 2.5.1); Objectif: 100X (NA = 1,46); angle de la FRBR curseur: angle d&#39;incidence ~ 67-72 °; La taille du pixel: 100 nm; Champ de vision: la FRBR (les choix alternatifs donnent aux plus hautes intensités laser et sont utilisés pour des fluorophores qui sont plus difficiles à blanchir). </li><li> Cliquez sur &quot;oui&quot; quand un menu pop-up apparaît avec une requête sur le passage sur les lasers. </li></ol></li><li> Apportez l&#39;imagede la cellule en lumière au niveau du plan de la caméra. <ol><li> Choisissez l&#39;épi-illumination piste de laser de 488 nm. Remarque: les pistes sont des configurations de faisceaux utilisés lors de l&#39;imagerie. Ici, les noms de piste sont déterminées par la longueur d&#39;onde d&#39;excitation qui produit l&#39;émission qui est transmis à l&#39;appareil photo. Par exemple, la piste nm 561 utilise à la fois le 405 et 561 nm lignes laser, mais le cube de filtre ne laisse passer que les émissions de photoconverted Dendra2 excité par 561 nm lumière de la caméra. </li><li> Concentrer l&#39;image de la cellule de l&#39;appareil photo en utilisant le bouton d&#39;acquisition &quot;continu&quot;. </li></ol></li><li> Recueillir une image à grand champ conventionnel. <ol><li> Utilisez le bouton &quot;Snap&quot;. </li><li> Enregistrez l&#39;image en allant dans le menu &quot;Fichier&quot; et choisir &quot;Enregistrer / Enregistrer sous.&quot; </li></ol></li><li> Mettre en place l&#39;éclairage en fonction de la FRBR. <ol><li> Choisissez la piste 488 et passer à &quot;la FRBR&quot; en utilisant le bouton PEV / de la FRBR. </li><li> Choisissez acquisition &quot;continu&quot;. </li><li> Réglez téclairage curseur il basé FRBR. Remarque: la FRBR est atteint quand il ya un assombrissement soudain de fond et l&#39;échantillon peut être porté dans un plan 18. Si de nouvelles fonctionnalités apparaissent via concentrant vers le haut dans l&#39;échantillon, l&#39;angle d&#39;incidence est trop faible parce que dans la FRBR il ya seulement un plan de mise au point. </li><li> Vérifiez l&#39;angle de la FRBR en utilisant la piste 561 avec le laser à 405 nm &quot;off&quot;. </li><li> Tournez le laser à 405 nm de retour &quot;sur&quot; avant de lancer une expérience PALM. </li></ol></li><li> Recueillir des données PALM. <ol><li> Appuyez sur &quot;commencer l&#39;expérience.&quot; Remarque: Si vous le souhaitez, ouvrez l&#39;onglet &quot;options de traitement en ligne&quot; et cochez la case &quot;PALM ligne de traitement&quot; et &quot;Fit Gauss2D&quot; (avant l&#39;expérience) pour contrôler l&#39;image de PALM reconstruit lors de la collecte de données brutes. Ceci facilitera l&#39;évaluation de la qualité des données, et donc la valeur de la poursuite du processus de collecte de données relativement beaucoup de temps. </li><li> Visuellementsurveiller photoconversion. </li><li> Augmentez l&#39;intensité du laser 405 nm (photoconverting) quand Dendra2 photoconversion diminue (généralement après l&#39;acquisition de ~ 10 000 images brutes). </li><li> Poursuivre l&#39;expérience si photoconversion augmente. Sinon, arrêter l&#39;expérience (sans perte de données) en appuyant sur le bouton &quot;stop&quot; courant de l&#39;étape. </li><li> Enregistrez les images lorsque la collecte des données est terminée (après environ 15 min). </li></ol></li></ol> 3. Traitement de l&#39;image, l&#39;affichage et l&#39;analyse <ol><li> En l&#39;absence de traitement des images brutes, processus en ligne qui ont été enregistrés sur le disque. <ol><li> Cliquez sur l&#39;onglet de traitement, ouvrez l&#39;onglet de la méthode, et sélectionnez &quot;PALM&quot;. </li><li> Choisissez &quot;PALM&quot; nouveau des quatre sous-options. </li><li> Allez dans le menu fichier, ouvrir et afficher le fichier d&#39;intérêt, et appuyez sur &quot;Select&quot;. </li><li> Cliquez sur &quot;appliquer&quot;. Note: Ceci lancera pic / fluorophore constatation et le pic localisation avec optimisme par défautons. Si nécessaire, les pics peuvent également être regroupés en utilisant l&#39;onglet &quot;PAL-groupe&quot;. Regroupement affecte pics qui apparaissent dans plusieurs trames consécutives à une seule molécule si les coordonnées de pointe sont suffisamment similaires. En outre, les données peuvent être corrigées pour la dérive de l&#39;échantillon à l&#39;aide de l&#39;option d&#39;alignement de dérive basée sur un modèle de logiciel. </li></ol></li><li> Filtrer les composants mal localisés et mal échantillonnées dans les données de pic-localisée. <ol><li> Jeter fluorophores avec une précision de localisation, σ,&gt; 35 nm en utilisant l&#39;outil &quot;PAL-Filter&quot;. </li><li> Jeter fluorophores dans les zones où la distance moyenne entre les pics, d, est trop grand pour résoudre des vésicules de diamètre, D. <ol><li> Extrait de la précision moyenne de localisation, σ, de l&#39;histogramme de précision de la localisation. </li><li> Calculer une valeur maximale acceptable pour d basé sur σ, et la criteron Shannon-Nyquist 19, incarnée dans la résolution approximation 20 R = D =[(2.35σ) 2 + (2d) 2] 1/2. </li><li> Régler le seuil de l&#39;outil &quot;Supprimer les valeurs aberrantes PALM&quot; pour supprimer les pics entourés de moins de nD 2 / (4d 2) voisins dans un cercle de rayon D / 2. </li></ol></li><li> Convertir les données de PALM transformé en une image de PALM en utilisant l&#39;outil &quot;PAL-rendu&quot;; Voir Figure 1. </li><li> Quantifier les tailles et les séparations en choisissant la fonction &quot;Profil&quot;. <ol><li> Vérifiez la ligne associée et options de table, et tracer une ligne le long de la direction souhaitée dans l&#39;image. </li><li> Quantifier diamètres par la détermination des largeurs à mi-intensité maximale. </li><li> Quantifier les séparations par détermination des espacements de profils d&#39;intensité de crête à crête. </li></ol></li></ol></li></ol>

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	<li>Goldstein, A. Y., Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+and+the+delivery+of+pre-synaptic+components.">Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components.</a> Curr Opin Neurobiol. 18, 495-503 (2008).</li><li>Combs, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy:+a+concise+guide+to+current+imaging+methods.">Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods.</a> Curr Protoc Neurosci. , (2010).</li><li>Sengupta, P., Van Engelenburg, S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+cell+structure+and+function+with+point-localization+superresolution+imaging.">Visualizing cell structure and function with point-localization superresolution imaging.</a> Dev Cell. 23, 1092-1102 (2012).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2007).</li><li>Bury, L. A., Sabo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+trafficking+of+synaptic+vesicle+and+active+zone+proteins+prior+to+synapse+formation.">Coordinated trafficking of synaptic vesicle and active zone proteins prior to synapse formation.</a> Neural Dev. 6, 24 (2011).</li><li>Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+activity-dependent+secretion+of+brain-derived+neurotrophic+factor+from+axon+and+dendrite.">Differential activity-dependent secretion of brain-derived neurotrophic factor from axon and dendrite.</a> J Neurosci. 29, 14185-14198 (2009).</li><li>Tao-Cheng, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+localization+of+active+zone+and+synaptic+vesicle+proteins+in+a+preassembled+multi-vesicle+transport+aggregate.">Ultrastructural localization of active zone and synaptic vesicle proteins in a preassembled multi-vesicle transport aggregate.</a> Neuroscience. 150, 575-584 (2007).</li><li>Zhai, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembling+the+presynaptic+active+zone:+a+characterization+of+an+active+zone+precursor+vesicle.">Assembling the presynaptic active zone: a characterization of an active zone precursor vesicle.</a> Neuron. 29, 131-143 (2001).</li><li>Ahmari, S. E., Buchanan, J., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+presynaptic+active+zones+from+cytoplasmic+transport+packets.">Assembly of presynaptic active zones from cytoplasmic transport packets.</a> Nat Neurosci. 3, 445-451 (2000).</li><li>Garner, C. C., Zhai, R. G., Gundelfinger, E. D., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+CNS+synaptogenesis.">Molecular mechanisms of CNS synaptogenesis.</a> Trends Neurosci. 25, 243-251 (2002).</li><li>Chuang, J. Z., Milner, T. A., Zhu, M., Sung, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+29+kDa+intracellular+chloride+channel+p64H1+is+associated+with+large+dense-core+vesicles+in+rat+hippocampal+neurons.">A 29 kDa intracellular chloride channel p64H1 is associated with large dense-core vesicles in rat hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 19, 2919-2928 (1999).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+photoactivatable+fluorescent+protein+Dendra2+to+track+protein+movement.">Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement.</a> Biotechniques. 42, (2007).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Scalettar, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hindered+submicron+mobility+and+long-term+storage+of+presynaptic+dense-core+granules+revealed+by+single-particle+tracking.">Hindered submicron mobility and long-term storage of presynaptic dense-core granules revealed by single-particle tracking.</a> Dev Neurobiol. 72, 1181-1195 (2012).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+super-resolution+fluorescence+microscopy+to+work.">Putting super-resolution fluorescence microscopy to work.</a> Nat Methods. 6, 21-23 (2009).</li><li>Helander, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+binding+in+brain+and+kidney:+A+kinetic+study+of+fixation.">Formaldehyde binding in brain and kidney: A kinetic study of fixation.</a> Journal of Histotechnology. 22, 317-318 (1999).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology.">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2, 764-774 (2001).</li><li>Toomre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+and+calibration+of+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+systems.">Alignment and calibration of total internal reflection fluorescence microscopy systems.</a> Cold Spring Harb Protoc. 4, 504-509 (2012).</li><li>Shannon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communication+in+the+presence+of+noise.">Communication in the presence of noise.</a> Proc IRE. 37, 10-21 (1949).</li><li>Hess, S. T., Gould, T. J., Gunewardene, M., Bewersdorf, J., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh+resolution+imaging+of+biomolecules+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultrahigh resolution imaging of biomolecules by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Methods Mol Biol. 544, 483-522 (2009).</li><li>Sengupta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+protein+heterogeneity+in+the+plasma+membrane+using+PALM+and+pair+correlation+analysis.">Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis.</a> Nat Methods. 8, 969-975 (2011).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).</li><li>Zhong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivated+localization+microscopy+(PALM):+an+optical+technique+for+achieving+~10-nm+resolution.">Photoactivated localization microscopy (PALM): an optical technique for achieving ~10-nm resolution.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).</li><li>Lochner, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+copackaging+and+cotransport+yields+postsynaptic+colocalization+of+neuromodulators+associated+with+synaptic+plasticity.">Efficient copackaging and cotransport yields postsynaptic colocalization of neuromodulators associated with synaptic plasticity.</a> Dev Neurobiol. 68, 1243-1256 (2008).</li><li>Geisler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drift+estimation+for+single+marker+switching+based+imaging+schemes.">Drift estimation for single marker switching based imaging schemes.</a> Optics Express. 20, 7274-7289 (2012).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

PALM et des techniques de microscopie de fluorescence super-résolution connexes ont récemment émergé comme un complément précieux aux formes les mieux établies de la microscopie optique et la microscopie électronique (EM) 22-24. Attributs positifs de PALM comprennent la préparation de l&#39;échantillon relativement simple et l&#39;échantillon minimal perturbation. En principe, PALM peut également être utilisé pour étudier des cellules vivantes. Probablement le principal attribut négatif de PAL...

Un certain nombre de processus cellulaires dépendent de trafic précis et efficace des vésicules médiée par des biomolécules sous-cellulaires à des destinations spécifiques. Un exemple frappant est l&#39;assemblage synaptique, qui est précédé par une longue-distance, la livraison des vésicules synaptiques à médiation des constituants à partir de sites de la biogenèse du soma neuronal de sites pré-et post-synaptiques potentiellement distales 1. La microscopie à fluorescence est une méthode puissante et populaire d&#39;étudier le trafic vésiculaire. Points forts de la technique sont sa sensibilité, la spécificité, et la compatibilité avec l&#39;imagerie en direct 2. Malheureusement, jusqu&#39;à relativement récemment, la technique a souffert d&#39;une faiblesse majeure, la résolution limitée par la diffraction 2, ce qui entrave les études de structures avec des dimensions inférieures à ~ 250 nm. Récemment, la résolution latérale en microscopie à fluorescence a dépassé la barrière de diffraction avec l&#39;introduction de mi de fluorescence super-résolutiontechniques croscopy, tels que PALM 3. La résolution latérale de PALM, des dizaines de nanomètres, est idéalement adapté à l&#39;étude de vésicules, qui ont des dimensions qui vont généralement de ~ 50-250 nm 4. Il est donc maintenant possible d&#39;utiliser la fluorescence, avec ses forces multiples, pour élucider un spectre d&#39;attributs précédemment inaccessibles de vésicules, y compris certains aspects de leur trafic vers les sites sous-cellulaires spécifiques. PALM n&#39;est pas trivial à mettre en œuvre, et des stratégies efficaces doit souvent être adapté au type de système à l&#39;étude. Nous décrivons ici comment mettre en œuvre des études paume de structures vésiculaires, et nous démontrons l&#39;efficacité de notre approche pour le cas de VJCs dans les neurones de l&#39;hippocampe. En particulier, nous utilisons PALM à vérifier l&#39;hypothèse que le trafic de VJCs de synapses dans les neurones de l&#39;hippocampe est médiée par les pôles de DCV 5-8. trafic de cluster médiation de vésicules de synapses dans le développement de neurons est une possibilité intéressante, car elle peut faciliter la stabilisation synaptique rapide et assemblage 9,10. Les partisans de la traite cluster de VJCs citent la taille apparente de puncta fluorescent extrasynaptique hébergement fret DCV exogène comme preuve à l&#39;appui regroupement 6. Toutefois, ces points lacrymaux apparaissent dans les images générées en utilisant des techniques de microscopie de fluorescence diffraction limitée, qui ne sont pas adaptés à des effets de taille marquantes émanant diffraction de ceux découlant de clustering. Pour résoudre ce problème, nous avons recueilli de fluorescence à champ large classique et images paume de neurones de l&#39;hippocampe exprimant des chimères ciblées à VJCs. L&#39;analyse de ces images a révélé que&gt; 92% de présumés groupes de DCV extrasynaptiques en images classiques sont résolus 80 nm (DCV taille individuelle) 11 points lacrymaux en images PALM. Ainsi, ces données invalident largement l&#39;hypothèse de regroupement tel qu&#39;il est appliqué à l&#39;élaboration VJCs hippocaneurones MPAL.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1105">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Zeiss PALM</td>
			<td style="width:169px;">Carl Zeiss, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">Elyra PS.1</td>
			<td style="width:572px;">With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:245px;">Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td style="width:169px;">Life Technoligies</td>
			<td style="width:119px;">11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Minimum Essential Medium</td>
			<td style="width:169px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11095-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:169px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:169px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">19208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Sucrose</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S-8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">growth glass coverslips 18mm 1.5D</td>
			<td style="width:169px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC0059095</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of neuronal dense-core vesicles

<html> Détection de la fluorescence fournit la base pour de nombreuses techniques de microscopie largement utilisés et les progrès rapides utilisés dans des applications biologiques et médicales modernes. Points forts de fluorescence comprennent la sensibilité, la spécificité et la compatibilité avec l&#39;imagerie en direct. Malheureusement, les formes classiques de la microscopie de fluorescence souffrent d&#39;une faiblesse, une résolution limitée par la diffraction principal dans le plan de formation d&#39;image, ce qui entrave les études de structures ayant des dimensions inférieures à ~ 250 nm. Récemment, cette limitation a été surmontée avec l&#39;introduction de super-résolution des techniques de microscopie de fluorescence, comme la microscopie de localisation photoactivée (PALM). Contrairement à ses homologues conventionnels, PALM peut produire des images avec une résolution latérale de quelques dizaines de nanomètres. Il est donc maintenant possible d&#39;utiliser la fluorescence, avec ses forces multiples, pour élucider un spectre d&#39;attributs précédemment inaccessibles de la structure cellulaire et de l&#39;organisation. _content &quot;&gt; Malheureusement, PALM n&#39;est pas trivial à mettre en œuvre, et des stratégies efficaces doit souvent être adapté au type de système à l&#39;étude. Dans cet article, nous montrons comment mettre en œuvre une seule couleur études de paume de structures vésiculaires dans des neurones cultivés fixes. PALM est idéalement adapté à l&#39;étude de vésicules, qui ont des dimensions qui vont généralement de ~ 50-250 nm. étapes clés de notre approche comprennent l&#39;étiquetage des neurones avec photoconvertible (du vert au rouge) chimères de fret de la vésicule, la collecte des images brutes faiblement échantillonnées avec un système de microscopie de super-résolution, et le traitement des images brutes afin de produire une image de PALM haute résolution. Nous démontrons également l&#39;efficacité de notre approche en présentant des images exceptionnellement bien résolus de vésicules à cœur dense (VJC) dans les neurones d&#39;hippocampe en culture, qui réfute l&#39;hypothèse que le trafic extrasynaptique de VJCs est médiée principalement par les pôles de DCV.

La figure 1 montre un produit de l&#39;imagerie et le traitement de fin. Dans cette image de PALM, coordonnées latérales de fluorophores localisées sont présentés en utilisant le mode d&#39;affichage centre de gravité, et l&#39;image de super-résolution de la DCV associé est montré à l&#39;aide du mode d&#39;affichage de Gauss. La figure 2A montre grand champ analogue et images PALM du soma et processus proximaux de huit jours en neurone h...

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Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Nous décrivons comment mettre en œuvre photoactivée microscopie localisation (PALM) à base des études de vésicules dans fixes, des neurones en culture. Les éléments clés de notre protocole comprennent l&#39;étiquetage des vésicules avec des chimères photoconvertible, la collecte des images brutes faiblement échantillonnées avec un système de microscopie de super-résolution, et de traitement des images brutes afin de produire une image de super-résolution.

Super-résolution d&#39;imagerie de neurones vésicules à cœur dense

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.6K vues.  Lewis & Clark College.  Nous décrivons comment mettre en œuvre photoactivée microscopie localisation (PALM) à base des études de vésicules dans fixes, des neurones en culture. Les éléments clés de notre protocole comprennent l'étiquetage des vésicules avec des chimères photoconvertible, la collecte des images brutes faiblement échantillonnées avec un système de microscopie de super-résolution, et de traitement des images brutes afin de produire une image de super-résolution...

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In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

En imagerie calcique in vivo des neurones en C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Recherche

Neurosciences

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

Imagerie in vivo de Dauer spécifique neuronale Rénovation en C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

L&#39;incubation prolongée de aiguë Neuronal tissus pour électrophysiologie et Calcium-imagerie

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and columns to facilitate brain wiring during development and information processing in developed animals. Postsynaptic neurons elaborate dendrites in type-specific patterns in specific layers to synapse with appropriate presynaptic terminals. The fly medulla neuropil is composed of 10 layers and about 750 columns; each column is innervated by dendrites of over 38 types of medulla neurons, which match with the axonal terminals of some 7 types of afferents in a type-specific fashion. This report details the procedures to image and analyze dendrites of medulla neurons. The workflow includes three sections: (i) the dual-view imaging section combines two confocal image stacks collected at orthogonal orientations into a high-resolution 3D image of dendrites; (ii) the dendrite tracing and registration section traces dendritic arbors in 3D and registers dendritic traces to the reference column array; (iii) the dendritic analysis section analyzes dendritic patterns with respect to columns and layers, including layer-specific termination and planar projection direction of dendritic arbors, and derives estimates of dendritic branching and termination frequencies. The protocols utilize custom plugins built on the open-source MIPAV (Medical Imaging Processing, Analysis, and Visualization) platform and custom toolboxes in the matrix laboratory language. Together, these protocols provide a complete workflow to analyze the dendritic routing of Drosophila medulla neurons in layers and columns, to identify cell types, and to determine defects in mutants.

Here, we show how to analyze dendritic routing of Drosophila medulla neurons in columns and layers. The workflow includes a dual-view imaging technique to improve the image quality and computational tools for tracing, registering dendritic arbors to the reference column array and for analyzing the dendritic structures in 3D space.

Analyse dendritique Morphologie dans les colonnes et les couches

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imagerie biphotonique Calcium en Dendrites neuronales dans des tranches de cerveau

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and neurodegenerative disease across species. Although these neurotoxic challenges have long been considered to be cell-intrinsic, considerable evidence now supports that misfolded human disease proteins originating in one neuron can appear in neighboring cells, a phenomenon proposed to promote pathology spread in human neurodegenerative disease.
C. elegans adult neurons that express aggregating proteins can extrude large (~4 &#181;m) membrane-surrounded vesicles that can include the aggregated protein, mitochondria, and lysosomes. These large vesicles are called &#8220;exophers&#8221; and are distinct from exosomes (which are about 100x smaller and have different biogenesis). Throwing out cellular debris in exophers may occur by a conserved mechanism that constitutes a fundamental, but formerly unrecognized, branch of neuronal proteostasis and mitochondrial quality control, relevant to processes by which aggregates spread in human neurodegenerative diseases.
While exophers have been mostly studied in animals that express high copy transgenic mCherry within touch neurons, these protocols are equally useful in the study of exophergenesis using fluorescently tagged organelles or other proteins of interest in various classes of neurons.
Described here are the physical features of C. elegans exophers, strategies for their detection, identification criteria, optimal timing for quantitation, and animal growth protocols that control for stresses that can modulate exopher production levels. Together, details of protocols outlined here should serve to establish a standard for quantitative analysis of exophers across laboratories. This document seeks to serve as a resource in the field for laboratories seeking to elaborate molecular mechanisms by which exophers are produced and by which exophers are reacted to by neighboring and distant cells.

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

This protocol describes approaches for detection and quantitation of large aggregate and/or organelle extrusions (~4 &#181;m) produced by C. elegans cells in the form of membrane-bound exophers. We describe strains, growth conditions, scoring criteria, timing, and microscopy considerations needed to facilitate dissection of this debris expulsion mechanism.

Approches quantitatives pour la notation in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and ...

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. Imaging studies are widely used to investigate their function and plasticity in physiological and pathological conditions. Because of their size and structure, localization studies of proteins require high-resolution imaging techniques. In this protocol, we describe a procedure to study in primary neurons the co-localization of target proteins with synaptic markers at a super-resolution level using structured illumination microscopy (SIM). SIM is a patterned-light illumination technique that doubles the spatial resolution of wide-field microscopy, reaching a detail of around 100 nm. The protocol indicates the required controls and settings for robust co-localization studies and an overview of the statistical methods to analyze the imaging data properly.

This protocol shows how to employ super-resolution microscopy to study protein co-localization in primary neuronal cultures.

Imagerie super-résolution pour étudier la co-localisation des protéines et des marqueurs synaptiques dans les neurones primaires

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are optimized to minimize their impact on behavior. This is first achieved by using a holder that minimizes movement hindrances. The back of the fly&#8217;s head is glued to this holder at an angle that allows optical access to the whole brain while retaining the fly&#8217;s ability to walk, groom, smell, taste and see. The back of the head is dissected to remove tissues in the optical path and muscles responsible for head movement artefacts. The fly brain can subsequently be imaged to record brain activity, for instance using calcium or voltage indicators, during specific behaviors such as walking or grooming, and in response to different stimuli. Once the challenging dissection, which requires considerable practice, has been mastered, this technique allows to record rich data sets relating whole brain activity to behavior and stimulus responses.

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method specifically tailored to image the whole brain of adult Drosophila during behavior and in response to stimuli. The head is positioned to allow optical access to the whole brain, while the fly can move its legs and the antennae, the tip of the proboscis, and the eyes can receive sensory stimuli.

Préparation du drosophile adulte melanogaster pour l’imagerie cérébrale entière pendant les réponses au comportement et aux stimuli

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the different ROS, hydrogen peroxide (H2O2) is best characterized with respect to roles in cellular signaling. H2O2 has been implicated during the development in several species. For example, a transient increase in H2O2 has been detected in zebrafish embryos during the first days following fertilization. Furthermore, depleting an important cellular H2O2 source, NADPH oxidase (NOX), impairs nervous system development such as the differentiation, axonal growth, and guidance of retinal ganglion cells (RGCs) both in&#160;vivo and in vitro. Here, we describe a method for imaging intracellular H2O2 levels in cultured zebrafish neurons and whole larvae during development using the genetically encoded H2O2-specific biosensor, roGFP2-Orp1. This probe can be transiently or stably expressed in zebrafish larvae. Furthermore, the ratiometric readout diminishes the probability of detecting artifacts due to differential gene expression or volume effects. First, we demonstrate how to isolate and culture RGCs derived from zebrafish embryos that transiently express roGFP2-Orp1. Then, we use whole larvae to monitor H2O2 levels at the tissue level. The sensor has been validated by the addition of H2O2. Additionally, this methodology could be used to measure H2O2 levels in specific cell types and tissues by generating transgenic animals with tissue-specific biosensor expression. As zebrafish facilitate genetic and developmental manipulations, the approach demonstrated here could serve as a pipeline to test the role of H2O2 during neuronal and general embryonic development in vertebrates.

This protocol describes the use of a genetically encoded hydrogen peroxide (H2O2)-biosensor in cultured zebrafish neurons and larvae for assessing the physiological signaling roles of H2O2 during nervous system development. It can be applied to different cell types and modified with experimental treatments to study reactive oxygen species (ROS) in general development.

ROS Imagerie des cellules vivantes au cours du développement neuronal

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.