Ce travail a été soutenu par le programme de découverte du Conseil australien de la recherche (ARC) (DP150101065) et le arc Research Hub for Integrated Device for End-user Analysis at Low-levels (IDEAL) (IH150100028).

1. Préparation des électrodes tBLMs
<ol><li>Préparation du premier revêtement monocouche<ol>
<li>Immerger une lame de microscope à électrodes à motif d’or fraîchement pulvérisée dans une solution éthanolique composée d’un rapport 3 mM 1:9 de molécules « d’espacement » benzyl-disulfure-tétra-éthylèneglycol-OH (le disulfure de benzyle comprenait quatre molécules d’espacement oxygène-éthylène glycol, terminées par un groupe OH) et de benzyl-disulfure (tétra-éthylèneglycol) n=2 molécules « attachées » en C20-phytanyle. Cela crée le premier revêtement de couche auquel une bicouche peut être ancrée. REMARQUE: L’électrode en or est fabriquée en évaporant un film en polycarbonate de 100 nm, 99,9995% d’or (or 5n5) sur des lames en polycarbonate personnalisées de 25 mm x 75 mm20.</li>
		<li>Incuber les électrodes avec la première couche à température ambiante pendant au moins 1 h.</li>
		<li>Rincez les électrodes en or en les immergeant dans de grandes quantités d’éthanol pur sur 30 s.</li>
		<li>Utilisez la glissière d’électrode en or avec la première monocouche directement pour l’étape suivante ou stockez-la dans un pot rempli d’éthanol pur.</li>
		<li>REMARQUE: Pour assurer l’intégrité de la première couche, minimisez tout contact direct avec les parties dorées de la glissière</li>
	</ol></li>
	<li>Assemblage de la première glissière revêtue monocouche<ol>
<li>Retirez soigneusement une glissière d’électrode en or coplanaire de son récipient à l’aide d’une pince à épileuse, en veillant à ne pas entrer en contact avec les zones à motifs où les tBLM se formeront. REMARQUE: Veillez à identifier le côté de la glissière sur lequel l’or est déposé.</li>
		<li>Faire glisser à l’air sec pendant 1 à 2 minutes pour éliminer tout éthanol résiduel.</li>
		<li>Placez l’électrode en or sur une surface sèche, assurez-vous que l’électrode en or est correctement orientée avec une surface en or à motifs orientée vers le haut.</li>
		<li>Décollez le couvercle de la couche adhésive transparente d’un mince stratifié et placez-le sur les 6 canaux pour définir chaque puits.</li>
		<li>Utilisez un rouleau de pression pour libérer de l’air entre la glissière et la couche adhésive transparente, comme illustré à la Figure 1A. REMARQUE: Le temps requis pour cette étape devra être optimisé par le chercheur. Dans ce protocole, les temps sont allant de 2 à 3 min.</li>
		<li>Introduisez dès que possible (dans les 1 à 2 minutes) la deuxième bicouche lipidique dans la première électrode revêtue de monocouche assemblée pour l’auto-assemblage afin d’éviter d’endommager la première couche.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation de la deuxième bicouche lipidique<ol>
<li>Ajouter 6 μL de lipides d’intérêt de 3 mM au premier puits de la lame des six puits. Ne laissez pas le bord de la pointe de la micropipette toucher la surface en or, ce qui peut endommager les produits chimiques attachés à l’électrode. REMARQUE: Le mélange lipidique utilisé dans ce travail était composé de 3 mM 70% de diphytanyl-éther-glycéro-phosphatidylcholine (DPEPC) et de 30% de lipides d’éther diphytanyldiglycérides en C20 (GDPE) mélangés à 3 mM de cholestérol-PEG-biotine dans un rapport molaire de 50: 1.</li>
		<li>Introduire 6 μL du mélange lipidique dans les autres puits avec un intervalle de 10 s entre chaque addition.</li>
		<li>Incuber chaque puits pendant exactement 2 min à température ambiante avant d’échanger le mélange lipidique sur les électrodes avec un tampon tel que pbS. Espacez les temps pour l’addition et l’échange de tampon de 10 s d’intervalle afin que chaque puits soit incubé avec le lipide pendant exactement 2 min chacun.</li>
		<li>Lavez 3 fois de plus avec 50 μL de tampon PBS (pH 7,0). Assurez-vous de laisser 50 μL de tampon sur les électrodes en tout temps. Ne laissez pas les électrodes sécher. REMARQUE: Le déplacement du solvant éthanolique avec la solution aqueuse de cette manière (la méthode d’échangede solvant) permet la formation rapide d’une seule bicouche lipidique ancrée à l’électrode d’or via les chimies attachées.</li>
	</ol></li>
	<li>Test de la formation de tBLM à l’aide de mesures par spectroscopie d’impédance électrique (EIS)<ol>
<li>Insérez une glissière d’électrode préparée dans un spectromètre d’impédance CA (p. ex., téthapode). Assurez-vous que le spectromètre est connecté via un port USB à un ordinateur exécutant le logiciel.</li>
		<li>Ouvrez le logiciel, cliquez sur Configuration et ouvrez Matériel.</li>
		<li>Réglez les paramètres matériels pour utiliser une excitation AC de crête à crête de 25 mV.</li>
		<li>Réglez les fréquences entre 0,1 et 10 000 Hz avec deux étapes par décennie pour des mesures d’impédance rapides, appuyez sur ok.</li>
		<li>Cliquez sur le menu Configuration et ouvrez Modèle.</li>
		<li>Utilisez un modèle de circuit équivalent qui décrit l’électrode d’or d’attache comme un élément de phase constante en série avec une résistance décrivant le tampon électrolytique et un réseau résistance-condensateur parallèle pour décrire la bicouche lipidique, puis appuyez sur OK.</li>
		<li>Appuyez sur le bouton Démarrer pour démarrer une mesure en temps réel de la capacité membranaire (Cm)et de la conduction m (Gm). Les valeurs Cm des tBLM typiques doivent être comprises entre 12,5 nF et 15,5 nF pour les chimies attachées à 10 %21,22.</li>
		<li>Après avoir exécuté le protocole et terminé l’expérience, enregistrez les données.</li>
		<li>Répétez la mesure avec le puits suivant.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Irradiation laser
<ol><li>Configuration expérimentale REMARQUE: Le système sur mesure est configuré pour chaque puits tBLM individuellement.<ol>
<li>Effectuez des expériences dans une boîte à l’épreuve de la lumière pour minimiser la dangerité du laser.</li>
		<li>Utilisez une table optique pour configurer l’expérience afin de réduire les vibrations indésirables.</li>
		<li>Placez le lecteur d’impédance, où se trouve la glissière d’or, sur une scène XYZ et élevez-le de telle sorte qu’il se trouve sur le chemin de la source laser.</li>
		<li>Utilisez un engrenage microscopique à focalisation grossière et fine pour contrôler la hauteur de la source laser afin d’obtenir la précision appropriée.</li>
		<li>Ciblez le trajet laser le long de l’axe longitudinal de la glissière de l’électrode. ATTENTION: Portez toujours des lunettes de sécurité laser appropriées et maintenez de bons protocoles de sécurité laser.</li>
		<li>Laissez le laser réglé sélectionné se stabiliser avant de commencer l’expérience. REMARQUE : Un schéma de la configuration expérimentale est illustré à la figure 2A.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alignement des électrodes laser et or REMARQUE: Avant de commencer, évaluez toujours la puissance de sortie laser à l’aide d’un capteur de puissance pour vous assurer que seules de très faibles puissances sont fournies aux tBLM.<ol>
<li>Ajustez soit la trajectoire du laser, soit l’angle de l’électrode de telle sorte que le laser traverse le liquide recouvrant l’électrode et soit simplement visible, uniformément, à la surface de l’or.</li>
		<li>Ajustez la position de la lumière du faisceau laser pour chaque expérience en soulevant ou en abaissant la source du faisceau laser à l’aide du réglage fin tout en observant les changements de conductance de la membrane.</li>
		<li>Verrouillez le bouton pour sécuriser la position du trajet laser lorsqu’aucun changement de conductance n’est observé. REMARQUE: Des valeurs de conductance membranaire accrues seront générées lorsque le laser interagira avec l’électrode en or sous-jacente. Il est donc important d’ajuster le trajet du laser de manière à ce que de telles interactions ne soient pas possibles.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation des échantillons<ol>
<li>Préparer l’alignement de la lumière du faisceau laser (lorsqu’il n’y a pas de changement dans la conductance de la membrane), comme illustré à la Figure 2, position 3.</li>
		<li>Ajoutez des GNP d’intérêt (fonctionnalisés ou nus) au tampon PBS dans lequel les tBLM sont immergés pendant que le laser est éteint.</li>
		<li>Mélangez doucement le tampon PBS entourant les tBLM trois fois, en prenant soin de ne pas toucher l’électrode.</li>
		<li>Incuber pendant 5-10 min à température ambiante.</li>
		<li>Allumez le laser pour irradier l’échantillon, en utilisant la position correcte de la lumière du faisceau laser aligné, comme on le voit à la figure 2,position 3.</li>
		<li>Utilisez la combinaison appropriée de taille, de forme et de concentration des GNP avec la longueur d’onde de la lumière laser. REMARQUE: Le faisceau laser de longueur d’onde définie doit se coupler à la fréquence de résonance plasmonique GNP correspondante.</li>
		<li>Enregistrez le courant mesuré en continu (mesures en temps réel).</li>
		<li>Effectuer les étapes 2.2.1 à 2.3.7, en omettant l’ajout de PNB pour les expériences de contrôle.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Analyse et présentation des données statistiques
<ol><li>Exportez les données dans une feuille de calcul.</li>
	<li>Extraire le paramètre de conductance de la membrane par rapport au temps.</li>
	<li>Utilisez les données enregistrées après avoir installé une lumière de faisceau laser avec la bonne position et avant l’introduction des GNP.</li>
	<li>Normalisez les données en divisant la conductance membranaire mesurée sur la conductance membranaire de base. REMARQUE: Cela confirme que les changements relatifs dans les valeurs de conduction membranaire provoqués par l’introduction de PNB irradiés.</li>
	<li>Présentez les données sous forme de diagrammes de temps (axe des x) par rapport à la conduction membranaire normalisée (axe des y).</li>
</ol>4. Prédire la quantité de chaleur localisée générée dans les tBLM à partir de nanoparticules irradiées (modèle prédictif thermique)
<ol><li>Résoudre le problème de transfert de rayonnement selon Dombrovsky23, afin de calculer la puissance de rayonnement absorbée dans les solutions de nanoparticules irradiées.</li>
	<li>Calculez la production de chaleur en incorporant la source de chaleur due au rayonnement absorbé dans l’équation énergétique. REMARQUE: Pour une explication détaillée de l’analyse numérique de la génération de chaleur dans les tBLM à partir de nanoparticules irradiées et de l’interface nanomatériau-électrode, reportez-vous à la section 19.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Her, S., Jaffray, D. A., Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticles+for+applications+in+cancer+radiotherapy:+Mechanisms+and+recent+advancements.">Gold nanoparticles for applications in cancer radiotherapy: Mechanisms and recent advancements.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 109, 84-101 (2017).</li><li>Pissuwan, D., Valenzuela, S. M., Killingsworth, M. C., Xu, X., Cortie, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+destruction+of+murine+macrophage+cells+with+bioconjugated+gold+nanorods.">Targeted destruction of murine macrophage cells with bioconjugated gold nanorods.</a> Journal of Nanoparticle Research. 9 (6), 1109-1124 (2007).</li><li>Pissuwan, D., Valenzuela, S. M., Miller, C. M., Cortie, M. 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Les auteurs déclarent les intérêts financiers / relations personnelles suivants, qui peuvent être considérés comme des intérêts concurrents potentiels: Le professeur Bruce Cornell est directeur - Science et technologie chez Surgical Diagnostics SDx tethered membranes Pty. Ltd.

Ce protocole décrit l’utilisation du modèle tBLM avec un substrat d’électrode coplanaire en conjonction avec une configuration d’alignement laser horizontal qui permet l’enregistrement de l’impédance électrique en temps réel en réponse à l’irradiation laser de nanoparticules d’or. La méthode d’enregistrement EIS présentée ici construit une liste minimale d’expériences nécessaires pour permettre l’enregistrement des changements de courant ionique à travers...

La performance hyperthermique des nanomatériaux d’or irradiés offre une nouvelle classe de traitement mini-invasif, sélectif et ciblé pour les infections et les tumeurs1. L’utilisation de nanoparticules pouvant être chauffées par un laser a été utilisée pour détruire sélectivement les cellules malades ainsi que pour fournir un moyen d’administration sélective demédicaments 2,3. Une conséquence des phénomènes de photothermolyse des nanoparticules plasmoniques chauffées est l’endommagement des membranes cellulaires. La membrane bicouche lipidique fluide est considérée comme un site particulièrement vulnérable pour les cellules subissant de tels traitements, car la dénaturation des protéines membranaires intrinsèques ainsi que les dommages membranaires peuvent également entraîner la mort cellulaire4,car de nombreuses protéines sont là pour maintenir le gradient de potentiel ionique à travers les membranes cellulaires. Alors que la capacité de déterminer et de surveiller le transfert de chaleur à l’échelle nanométrique est d’un intérêt clé pour l’étude et l’application des GNP irradiés1,5,6,7, l’évaluation et la compréhension des interactions moléculaires entre les GNP et les bio-membranes, ainsi que les conséquences directes des phénomènes de chauffage induits par laser des GNP incorporés dans les tissus biologiques, n’ont pas encore été entièrement élucidés8. Par conséquent, une compréhension approfondie du processus d’hyperthermie des GNP irradiés reste un défi. En tant que tel, le développement d’une interface nanomatériau-électrode qui imite l’environnement naturel des cellules pourrait fournir un moyen d’entreprendre une étude approfondie des caractéristiques de transfert de chaleur des nanoparticules d’or irradiées dans les systèmes biologiques.
La complexité des membranes cellulaires natives est l’un des défis importants dans la compréhension des interactions PNB irradiés dans les cellules. Diverses plates-formes de membranes artificielles ont été développées pour fournir des versions bio-mimétiques simples de l’architecture et de la fonctionnalité des membranes lipidiques naturelles, y compris, mais sans s’y limiter, les membranes lipidiques noires9,les membranes bicouches planes supportées10,les membranes bicouches hybrides11,les membranes bicouches lipidiques amorties par polymère12 et les membranes lipidiques bicouches attachées13. Chaque modèle de membrane lipidique artificielle présente des avantages et des limites distincts en ce qui concerne l’imitation des membranes lipidiques naturelles14.
Cette étude décrit l’utilisation d’électrodes revêtues de membrane lipidique comme capteur pour évaluer les interactions entre les nanoparticules d’or et les membranes lipidiques, à l’aide du modèle tBLM. Le schéma de détection de biocapteurs basé sur le tBLM offre une stabilité et une sensibilité inhérentes13 car les membranes attachées peuvent s’auto-réparer, contrairement à d’autres systèmes (tels que les membranes formées par patch-clamp ou liposomes) dans lesquels seule une petite quantité de dommages membranaires entraîne leur effondrement15,16,17,18. De plus, comme les tBLM sont de dimensions mm2, l’impédance de fond est inférieure d’un ordre de grandeur aux techniques d’enregistrement patch-clamp, ce qui permet d’enregistrer les changements dans le flux ionique de la membrane basale dus aux interactions entre nanoparticules. En conséquence, le protocole actuel peut contraster les changements de conductance membranaire par des PNB liés qui sont excités par des lasers dont les puissances sont aussi faibles que 135 nW / μm2.
Le système présenté ici fournit une méthode sensible et reproductible pour déterminer des paramètres laser précis, la taille des particules, les revêtements de particules et la composition nécessaires à la conception et au développement de thérapies thermiques. Ceci est essentiel pour le raffinement des thérapies photothermiques émergentes, ainsi que pour offrir des informations précieuses sur les mécanismes détaillés du transfert de chaleur au sein des systèmes biologiques. Le protocole présenté est basé sur des travaux publiés précédemment19. Un aperçu du protocole est le suivant: la première section définit la formation tBLM; la deuxième section explique comment construire la configuration et aligner la source laser d’excitation; la dernière section illustre comment extraire des informations des données de spectroscopie d’impédance électrique.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30 nm diameter streptavidin-conjugated gold nanoparticles</td>
			<td>Cytodiagnostics</td>
			<td>AC-30-04-05</td>
			<td>This is a streptavidin-conjugated GNPs product ready for use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 nm diameter bare gold nanoparticles</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>753629</td>
			<td>This is a bare GNPs product ready for use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol-PEG-Biotin (MW1000)</td>
			<td>NANOCS</td>
			<td>PG2-BNCS-10k</td>
			<td>Dissolved in highly pure ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C20 Diphytanyl-Glycero-Phosphatidylcholine lipids</td>
			<td>SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.</td>
			<td>SDx-S1</td>
			<td>1 ml glass vial containing 70% C16 diphytanyl phosphatidylcholine (DPEPC) and 30% C16 diphytanyl glycerol (GDPE) in 99.9% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl-disulfide-tetra-ethyleneglycol-OH</td>
			<td>SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.</td>
			<td>SDx-S2</td>
			<td>Spacer molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl-disulfide (tetra-ethyleneglycol) n=2 C20-phytanyl&#160;</td>
			<td>SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.</td>
			<td>SDx-S2</td>
			<td>Tethered molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>532 nm green laser continuous light</td>
			<td>OBIS LS/OBIS CORE LS, China</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>The power of this laser was ~135&#160;mW&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tethaPod EIS reader</td>
			<td>SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.</td>
			<td>SDx-R1</td>
			<td>A reader of conductance and capacitance on six channels simultaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tethaPlate cartridge assembly</td>
			<td>SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.</td>
			<td>SDx-BG</td>
			<td>Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamp and slide assembly jig</td>
			<td>SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.</td>
			<td>SDx-A1</td>
			<td>Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid coated coplanar gold electrodes</td>
			<td>SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.</td>
			<td>SDx-T10</td>
			<td>Coplanar&#160; gold electrodes are made from 25 mm x 75&#160;mm x&#160;1&#160;mm polycarbonate base substrate with patterned gold arrays layout, then coated with benzyldisulphide, bis-tetraethylene glycol C16 phytanyl half membrane spanning tethers in a tether ratio of 10%&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tethaQuick software</td>
			<td>SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.</td>
			<td>SDx-B1</td>
			<td>Software for use with tethaPod to process data and display conductance, impedance and capacitance measurements from the tethaPlate electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;99.9% Pure ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>34963</td>
			<td>Absolute,&#160; 99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>pH 7</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tethered bilayer lipid membranes to monitor heat transfer between gold nanoparticles and lipid membranes

Nous rapportons ici un protocole pour étudier le transfert de chaleur entre les nanoparticules d’or irradiées (PNB) et les membranes lipidiques bicouches par électrochimie à l’aide de membranes lipidiques bicouches attachées (tBLM) assemblées sur des électrodes en or. Les GNP modifiés irradiés, tels que les GNP conjugués à la streptavidine, sont incorporés dans des tBLM contenant des molécules cibles, telles que la biotine. En utilisant cette approche, les processus de transfert de chaleur entre les PNB irradiés et la membrane lipidique bicouche modèle avec des entités d’intérêt sont médiés par un faisceau laser focalisé horizontalement. Le modèle de calcul prédictif thermique est utilisé pour confirmer les changements de conductance induits électrochimiquement dans les tBLM. Dans les conditions spécifiques utilisées, la détection des impulsions de chaleur nécessitait une fixation spécifique des nanoparticules d’or à la surface de la membrane, tandis que les nanoparticules d’or non liées ne paraissaient pas à provoquer une réponse mesurable. Cette technique sert de biocapteur de détection puissant qui peut être directement utilisé pour la conception et le développement de stratégies de thérapies thermiques qui permettent d’optimiser les paramètres laser, la taille des particules, les revêtements de particules et la composition.

Le substrat d’or sur lequel les tBLM peuvent être créés est illustré à la figure 1. Un schéma de la configuration expérimentale est présenté à la figure 2.
Les électrodes coplanaires en or, comme le montre la figure 1A,sont fabriquées à partir d’un substrat de base en polycarbonate de 25 mm x 75 mm x 1 mm avec des réseaux d’or à motifs. Une couche adhésive transparente définit les s...

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Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Ce travail décrit un protocole permettant de réaliser une surveillance dynamique et non invasive du transfert de chaleur des nanoparticules d’or irradiées au laser vers les tBLM. Le système combine la spectroscopie d’impédance pour la mesure en temps réel des changements de conductance à travers les tBLM, avec un faisceau laser focalisé horizontalement qui entraîne l’éclairage des nanoparticules d’or, pour la production de chaleur.

Membranes lipidiques bicouches attachées pour surveiller le transfert de chaleur entre les nanoparticules d’or et les membranes lipidiques

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...

tethered-bilayer-lipid-membranes-to-monitor-heat-transfer-between

Research

JoVE Journal

Biology

2.6K vues.  University of Technology Sydney. Ce travail décrit un protocole permettant de réaliser une surveillance dynamique et non invasive du transfert de chaleur des nanoparticules d’or irradiées au laser vers les tBLM. Le système combine la spectroscopie d’impédance pour la mesure en temps réel des changements de conductance à travers les tBLM, avec un faisceau laser focalisé horizontalement qui entraîne l’éclairage des nanoparticules d’or, pour la production de chaleur.

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Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

Francisella tularensis is a Gram-negative intracellular coccobacillus and the causative agent of the zoonotic disease tularemia. When compared with other bacterial pathogens, the extremely low infectious dose (&lt;10 CFU), rapid disease progression, and high morbidity and mortality rates suggest that the virulent strains of Francisella encode for novel virulence factors. Surface-exposed molecules, namely outer membrane proteins (OMPs), have been shown to promote bacterial host cell binding, entry, intracellular survival, virulence and immune evasion. The relevance for studying OMPs is further underscored by the fact that they can serve as protective vaccines against a number of bacterial diseases. Whereas OMPs can be extracted from gram-negative bacteria through bulk membrane extraction techniques, including sonication of cells followed by centrifugation and/or detergent extraction, these preparations are often contaminated with periplasmic and/or cytoplasmic (inner) membrane (IM) contaminants. For years, the "gold standard" method for the biochemical and biophysical separation of gram-negative IM and outer membranes (OM) has been to subject bacteria to spheroplasting and osmotic lysis, followed by sucrose density gradient centrifugation. Once layered on a sucrose gradient, OMs can be separated from IMs based on the differences in buoyant densities, believed to be predicated largely on the presence of lipopolysaccharide (LPS) in the OM. Here, we describe a rigorous and optimized method to extract, enrich, and isolate F. tularensis outer membranes and their associated OMPs.

Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

A protocol for separating inner and outer membranes from Francisella tularensis by spheroplasting, osmotic lysis, and sucrose density gradient ultracentrifugation.

Méthode pour l&#39;isolement de Francisella tularensis Membranes externes

Francisella tularensis is a Gram-negative intracellular coccobacillus and the causative agent of the zoonotic disease tularemia. When compared with other ...

Recherche

Biologie

Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter lipid bilayer properties. This is important because membrane proteins are energetically coupled to their host bilayer by hydrophobic interactions. Changes in bilayer properties thus alter membrane protein function, which provides an indirect way for amphiphiles to modulate protein function and a possible mechanism for "off-target" drug effects. We have previously developed an electrophysiological assay for detecting changes in lipid bilayer properties using linear gramicidin channels as probes 3,12. Gramicidin channels are mini-proteins formed by the transbilayer dimerization of two non-conducting subunits. They are sensitive to changes in their membrane environment, which makes them powerful probes for monitoring changes in lipid bilayer properties as sensed by bilayer spanning proteins. We now demonstrate a fluorescence assay for detecting changes in bilayer properties using the same channels as probes. The assay is based on measuring the time-course of fluorescence quenching from fluorophore-loaded large unilamellar vesicles due to the entry of a quencher through the gramicidin channels. We use the fluorescence indicator/quencher pair 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonate (ANTS)/Tl+ that has been successfully used in other fluorescence quenching assays 5,13. Tl+ permeates the lipid bilayer slowly 8 but passes readily through conducting gramicidin channels 1,14. The method is scalable and suitable for both mechanistic studies and high-throughput screening of small molecules for bilayer-perturbing, and potential "off-target", effects. We find that results using this method are in good agreement with previous electrophysiological results 12.

We introduce a fast fluorescence-based assay that monitors the rate of fluorescence quenching as a measure of gramicidin channel activity. The gramicidin channels are used as molecular force transducers to monitor changes in lipid bilayer properties as sensed by bilayer spanning proteins.

Gramicidine basée Assay fluorescence; pour déterminer le potentiel de petites molécules pour modifier les propriétés bicouche lipidique

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter ...

Modeling Biological Membranes with Circuit Boards and Measuring Electrical Signals in Axons: Student Laboratory Exercises

This is a demonstration of how electrical models can be used to characterize biological membranes. This exercise also introduces biophysical terminology used in electrophysiology. The same equipment is used in the membrane model as on live preparations. Some properties of an isolated nerve cord are investigated: nerve action potentials, recruitment of neurons, and responsiveness of the nerve cord to environmental factors.

This is a demonstration of how biological membranes can be understood using electrical models. We also demonstrate procedures for recording action potentials from the ventral nerve cord of the crayfish for student orientated laboratories.

Modélisation des membranes biologiques avec des cartes de circuits et la mesure des signaux électriques dans les axones: Exercices de laboratoire étudiant

This is a demonstration of how electrical models can be used to characterize biological membranes. This exercise also introduces biophysical terminology ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Chromatographie d&#39;affinité lipidique des vésicules médiée utilisant magnétique tri cellulaire activé (LIMACS): une nouvelle méthode pour analyser les interactions protéines-lipides

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

Reconstitution d&#39;un canal Kv dans les membranes lipidiques des études structurales et fonctionnelles

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely accepted as the in vivo model of dietary fat absorption, the surgical techniques involved are challenging and expensive. Genetic manipulation of the animal model is also costly and time consuming. The alternative in vitro model is arguably more affordable, timesaving, and less challenging. Importantly, the in vitro model allows investigators to examine the enterocytes as an isolated system, reducing the complexity inherent in the whole organism model. This paper describes how human colon carcinoma cells (Caco-2) can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs and vitamins. It explains the proper maintenance of Caco-2 cells and the preparation of their lipid mixture; and it further discusses the valuable option of using the permeable membrane system. Since differentiated Caco-2 cells are polarized, the main advantage of using the permeable membrane system is that it separates the apical from the basolateral compartment. Consequently, the lipid mixture can be added to the apical compartment while the lipoproteins can be collected from the basolateral compartment. In addition, the effectiveness of the lentivirus expression system in upregulating gene expression in Caco-2 cells is discussed. Lastly, this paper describes how to confirm the successful isolation of intestinal lipoproteins by transmission electron microscopy (TEM).

Caco-2 cells can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs/vitamins. The permeable membrane system separates the apical from the basolateral compartment, while the lentivirus expression system offers an effective gene overexpression method. The isolation of lipoproteins is confirmed by TEM.

Utilisation de cellules Caco-2 à étudier Lipid Transport par l&#39;intestin

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester of glycerol and modified fatty acids that constitutes the framework of the cuticle that covers aerial plant surfaces. Suberin is a related lipid polyester that is deposited on the cell walls of certain tissues, including the root endodermis and the periderm of tubers, tree bark and roots. These lipid polymers are highly variable in composition among plant species, and often differ among tissues within a single species. Here, we describe a detailed protocol to study the monomer composition of cutin in Arabidopsis thaliana leaves by sodium methoxide (NaOMe)-catalyzed depolymerisation, derivatization, and subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. This method can be used to investigate the monomers of insoluble polyesters isolated from whole delipidated plant tissues bearing either cutin or suberin. The method can by applied not only to characterize the composition of lipid polymers in species not previously analyzed, but also as an analytical tool in forward and reverse genetic approaches to assess candidate gene function.

Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

Isolement et compositionnelle Analyse des plantes cuticules lipidiques polyester monomères

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved in humans and are associated with metabolic syndrome or other diseases. Examination of lipid accumulation in this organism can be carried out by fixative dyes or label-free methods. Fixative stains like Nile red and oil red O are inexpensive, reliable ways to quantitatively measure lipid levels and to qualitatively observe lipid distribution across tissues, respectively. Moreover, these stains allow for high-throughput screening of various lipid metabolism genes and pathways. Additionally, their hydrophobic nature facilitates lipid solubility, reduces interaction with surrounding tissues, and prevents dissociation into the solvent. Though these methods are effective at examining general lipid content, they do not provide detailed information about the chemical composition and diversity of lipid deposits. For these purposes, label-free methods such as GC-MS and CARS microscopy are better suited, their costs notwithstanding.

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Nile red staining of fixed Caenorhabditis elegans is a method for quantitative measurement of neutral lipid deposits, while oil red O staining facilitates qualitative assessment of lipid distribution among tissues.

Quantification de l’abondance de lipides et évaluation de la Distribution des lipides du Nil rouge et huile rouge O coloration de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Mesure du métabolisme énergétique chez Explanté tissu rétinien en utilisant l’analyse de Flux extracellulaire

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

Dissection et coloration des gouttelettes lipidiques des oenocytes dans les larves de Drosophila

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...