Questo lavoro è stato supportato dall'Australian Research Council (ARC) Discovery Program (DP150101065) e dall'ARC Research Hub for Integrated Device for End-user Analysis at Low-levels (IDEAL) (IH150100028).

1. Preparazione degli elettrodi tBLM
<ol><li>Preparazione del primo rivestimento monostrato<ol>
<li>Immergere un vetrino per microscopio con elettrodi con schema in oro appena sputtered in una soluzione etanolica composta da un rapporto 3 mM 1:9 di molecole "distanziatore" benzil-disolfuro-tetra-etilenglicole-OH (il disolfuro di benzile comprendeva un quattro distanziatore di ossigeno-etilenglicole, terminato con un gruppo OH) e benzil-disolfuro (tetra-etilenglicole) n = 2 molecole "legate" di c20-fitanil. Questo crea il primo strato di rivestimento a cui può essere ancorato un doppio strato. NOTA: L'elettrodo d'oro è realizzato evaporando 100 nm, 99,9995% di oro (oro 5n5) su vetrini in policarbonato 25 mm x 75 mm personalizzati20.</li>
		<li>Incubare gli elettrodi con il primo strato a temperatura ambiente per almeno 1 ora.</li>
		<li>Risciacquare gli elettrodi d'oro immergendoli in abbondanti quantità di etanolo puro oltre i 30 s.</li>
		<li>Utilizzare il vetrino dell'elettrodo d'oro con il primo monostrato direttamente per il passaggio successivo o conservare in un barattolo pieno di etanolo puro.</li>
		<li>NOTA: per garantire l'integrità del primo strato, ridurre al minimo qualsiasi contatto diretto con le parti dorate della diapositiva</li>
	</ol></li>
	<li>Assemblaggio della prima slitta rivestita monostrato<ol>
<li>Togliere con attenzione un vetrino per elettrodi d'oro complanare dal suo contenitore usando una pinzetta, assicurandosi di non entrare in contatto con le aree modellate in cui si formeranno i tBLM. NOTA: Fai attenzione a identificare il lato della diapositiva su cui viene depositato l'oro.</li>
		<li>Scorrimento a secco all'aria per 1 - 2 minuti per rimuovere eventuali residui di etanolo.</li>
		<li>Posizionare l'elettrodo d'oro su una superficie asciutta, assicurarsi che l'elettrodo d'oro sia orientato correttamente con la superficie d'oro a motivi geometrici rivolta verso l'alto.</li>
		<li>Staccare il coperchio dello strato adesivo trasparente da un laminato sottile e posizionarlo sopra i 6 canali per definire ogni pozzetti.</li>
		<li>Utilizzare un rullo di pressione per rilasciare l'aria tra la slitta e lo strato adesivo trasparente, come illustrato nella Figura 1A. NOTA: il tempo necessario per questo passaggio dovrà essere ottimizzato dal ricercatore. In questo protocollo, i tempi vanno da 2-3 min.</li>
		<li>Introdurre non appena possibile (entro 1-2 minuti) il secondo doppio strato lipidico al primo elettrodo rivestito monostrato assemblato per l'autoassemblaggio per evitare di danneggiare il primo strato.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione del secondo doppio strato lipidico<ol>
<li>Aggiungere 6 μL di 3 mM lipidi di interesse al primo pozzo dei sei pozzi scorrevoli. Non lasciare che il bordo della punta della micropipetta tocchi la superficie dorata, che può danneggiare le sostanze chimiche tethered sull'elettrodo. NOTA: La miscela lipidica utilizzata in questo lavoro consisteva in 3 mM 70% zwitterionico C20 diphytanyl-ether-glycero-phosphatidylcholine (DPEPC) e 30% C20 diphytandiglyceride ether lipids (GDPE) mescolati con 3 mM colesterolo-PEG-Biotina in rapporto molare 50: 1.</li>
		<li>Introdurre 6 μL della miscela lipidica negli altri pozzeli con uno spazio di 10 s tra ogni aggiunta.</li>
		<li>Incubare ogni pozzetti per esattamente 2 minuti a temperatura ambiente prima di scambiare la miscela lipidica sugli elettrodi con un tampone come PBS. Distanziare i tempi per l'aggiunta e lo scambio tampone a 10 s di distanza in modo che ogni pozzo venga incubato con il lipide per esattamente 2 minuti ciascuno.</li>
		<li>Lavare altre 3 volte con 50 μL di tampone PBS (pH 7,0). Assicurarsi di lasciare 50 μL di tampone sopra gli elettrodi in ogni momento. Non lasciare asciugare gli elettrodi. NOTA: La sostituzione del solvente etanolo con la soluzione acquosa in questo modo (il metodo di scambiodel solvente) consente la rapida formazione di un singolo doppio strato lipidico ancorato all'elettrodo d'oro attraverso le sostanze chimiche tethered.</li>
	</ol></li>
	<li>Test della formazione di tBLM mediante misure di spettroscopia di impedenza elettrica (EIS)<ol>
<li>Inserire il vetrino dell'elettrodo preparato in uno spettrometro a impedenza CA (ad esempio, Tethapod). Assicurarsi che lo spettrometro sia collegato tramite una porta USB a un computer che esegue il software.</li>
		<li>Aprire il software, fare clic su Setup e aprire Hardware.</li>
		<li>Impostare le impostazioni hardware in modo che utilizzino l'eccitazione CA da picco a picco di 25 mV.</li>
		<li>Impostare frequenze comprese tra 0,1 e 10.000 Hz con due passaggi per decennio per misure di impedenza rapida premere ok.</li>
		<li>Fate clic sul menu Imposta (Setup) e aprite Modello (Model).</li>
		<li>Utilizzare un modello di circuito equivalente che descriva l'elettrodo d'oro di tethering come elemento di fase costante in serie con un resistore che descrive il buffer elettrolitico e una rete parallela resistore-condensatore per descrivere il doppio strato lipidico e premere OK.</li>
		<li>Premere il pulsante Start per avviare una misurazione in tempo reale della capacità della membrana (Cm)e della conduzione della membrana (Gm). I valori Cm dei tBBM tipici dovrebbero essere nell'intervallo da 12,5 nF a 15,5 nF per le sostanze chimiche tethered al 10%21,22.</li>
		<li>Dopo aver eseguito il protocollo e terminato l'esperimento, salvare i dati.</li>
		<li>Ripeti la misurazione con il prossimo pozzo.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Irradiazione laser
<ol><li>Configurazione sperimentale NOTA: Il sistema su misura è impostato per ogni tBLM bene individualmente.<ol>
<li>Esegui esperimenti in una scatola a prova di luce per ridurre al minimo il laser in modo pericoloso.</li>
		<li>Utilizzare una tabella ottica per impostare l'esperimento per ridurre le vibrazioni indesiderate.</li>
		<li>Posizionare il lettore di impedenza, dove è collegata la slitta dorata, su uno stadio XYZ ed elevarlo in modo tale che si trovi nel percorso della sorgente laser.</li>
		<li>Utilizzare ingranaggi microscopici di messa a fuoco grossolana per controllare l'altezza della sorgente laser per ottenere la precisione appropriata.</li>
		<li>Mirare al percorso laser lungo l'asse longitudinale della slitta dell'elettrodo. ATTENZIONE: Indossare sempre occhiali di sicurezza laser adatti e mantenere buoni protocolli di sicurezza laser.</li>
		<li>Consentite al laser sintonizzato selezionato di stabilizzarsi prima di iniziare l'esperimento. NOTA: uno schema della configurazione sperimentale è illustrato nella Figura 2A.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Allineamento di elettrodi laser e oro NOTA: prima di iniziare, valutare sempre la potenza erogata dal laser utilizzando un misuratore di potenza per assicurarsi che ai tBBM vengano erogati solo wattaggi molto bassi.<ol>
<li>Regolare il percorso del laser o l'angolo dell'elettrodo in modo tale che il laser passi attraverso il liquido che copre l'elettrodo ed è appena visibile, in modo uniforme, sulla superficie dorata.</li>
		<li>Regolare la posizione della luce del raggio laser per ogni esperimento alzando o abbassando la sorgente del raggio laser utilizzando la regolazione fine osservando i cambiamenti nella conduttanza della membrana.</li>
		<li>Bloccare la manopola per fissare la posizione del percorso laser quando non si osservano cambiamenti di conduttanza. NOTA: l'aumento dei valori di conduttanza della membrana verrà generato quando il laser interagisce con l'elettrodo d'oro sottostante. È quindi importante regolare il percorso laser in modo tale che tali interazioni non siano possibili.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione del campione<ol>
<li>Preparare l'allineamento della luce del fascio laser (dove non vi è alcun cambiamento nella conduttanza della membrana), come mostrato in Figura 2, posizione 3.</li>
		<li>Aggiungi GNP di interesse (funzionalizzati o nudi) al buffer PBS in cui i tBLM sono immersi mentre il laser è spento.</li>
		<li>Mescolare delicatamente il tampone PBS che circonda i tBLM tre volte, facendo attenzione a non toccare l'elettrodo.</li>
		<li>Incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Accendere il laser per irradiare il campione, utilizzando la corretta posizione di luce del fascio laser allineato come si vede nella Figura 2,posizione 3.</li>
		<li>Utilizzare la combinazione appropriata di dimensioni, forma e concentrazione dei GNP con la lunghezza d'onda della luce laser. NOTA: il raggio laser di lunghezza d'onda impostata deve accoppiarsi alla corrispondente frequenza di risonanza plasmonica PNL.</li>
		<li>Registrare continuamente la corrente misurata (misurazioni in tempo reale).</li>
		<li>Eseguire i passaggi 2.2.1 - 2.3.7, omettendo l'aggiunta di PNL per gli esperimenti di controllo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Analisi e presentazione dei dati statistici
<ol><li>Esporta i dati in un foglio di calcolo.</li>
	<li>Estrarre il parametro di conduttanza della membrana rispetto al tempo.</li>
	<li>Utilizzare i dati registrati dopo aver impostato un raggio luminoso laser con la giusta posizione e prima dell'introduzione dei GNP.</li>
	<li>Normalizzare i dati dividendo la conduttanza della membrana misurata sulla conduttanza della membrana di base. NOTA: Questo conferma che i cambiamenti relativi nei valori di conduzione della membrana provocati dall'introduzione di GNP irradiati.</li>
	<li>Presentare i dati come grafici del tempo (asse x) rispetto alla conduzione di membrana normalizzata (asse y).</li>
</ol>4. Prevedere la quantità di calore localizzato generato nei tBLM da nanoparticelle irradiate (modello predittivo termico)
<ol><li>Risolvere il problema del trasferimento delle radiazioni secondo Dombrovsky23, al fine di calcolare la potenza di radiazione assorbita in soluzioni di nanoparticelle irradiate.</li>
	<li>Calcola la generazione di calore incorporando la fonte di calore dovuta alla radiazione assorbita nell'equazione dell'energia. NOTA: Per una spiegazione dettagliata dell'analisi numerica della generazione di calore nei tBLM da nanoparticelle irradiate e dall'interfaccia nanomateriale-elettrodo, fare riferimento a 19.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Her, S., Jaffray, D. A., Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticles+for+applications+in+cancer+radiotherapy:+Mechanisms+and+recent+advancements.">Gold nanoparticles for applications in cancer radiotherapy: Mechanisms and recent advancements.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 109, 84-101 (2017).</li><li>Pissuwan, D., Valenzuela, S. M., Killingsworth, M. C., Xu, X., Cortie, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+destruction+of+murine+macrophage+cells+with+bioconjugated+gold+nanorods.">Targeted destruction of murine macrophage cells with bioconjugated gold nanorods.</a> Journal of Nanoparticle Research. 9 (6), 1109-1124 (2007).</li><li>Pissuwan, D., Valenzuela, S. M., Miller, C. M., Cortie, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+golden+bullet?+Selective+targeting+of+Toxoplasma+gondii+tachyzoites+using+antibody-functionalized+gold+nanorods.">A golden bullet? Selective targeting of Toxoplasma gondii tachyzoites using antibody-functionalized gold nanorods.</a> Nano Letters. 7 (12), 3808-3812 (2007).</li><li>Zhang, H. -. G., Mehta, K., Cohen, P., Guha, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperthermia+on+immune+regulation:+a+temperature's+story.">Hyperthermia on immune regulation: a temperature's story.</a> Cancer Letters. 271 (2), 191-204 (2008).</li><li>Gobin, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-infrared+resonant+nanoshells+for+combined+optical+imaging+and+photothermal+cancer+therapy.">Near-infrared resonant nanoshells for combined optical imaging and photothermal cancer therapy.</a> Nano Letters. 7 (7), 1929-1934 (2007).</li><li>Jackson, J. B., Halas, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-enhanced+Raman+scattering+on+tunable+plasmonic+nanoparticle+substrates.">Surface-enhanced Raman scattering on tunable plasmonic nanoparticle substrates.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (52), 17930-17935 (2004).</li><li>Emelianov, S. Y., Li, P. -. C., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoacoustics+for+molecular+imaging+and+therapy.">Photoacoustics for molecular imaging and therapy.</a> Physics Today. 62 (8), 34 (2009).</li><li>Dimitriou, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticles,+radiations+and+the+immune+system:+Current+insights+into+the+physical+mechanisms+and+the+biological+interactions+of+this+new+alliance+towards+cancer+therapy.">Gold nanoparticles, radiations and the immune system: Current insights into the physical mechanisms and the biological interactions of this new alliance towards cancer therapy.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 178, 1-17 (2017).</li><li>Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+cell+membrane+structure+in+vitro+and+its+transformation+into+an+excitable+system.">Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system.</a> Nature. 194 (4832), 979 (1962).</li><li>Tamm, L. K., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+phospholipid+bilayers.">Supported phospholipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 47 (1), 105-113 (1985).</li><li>Plant, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+hybrid+bilayer+membranes+as+rugged+cell+membrane+mimics.">Supported hybrid bilayer membranes as rugged cell membrane mimics.</a> Langmuir. 15 (15), 5128-5135 (1999).</li><li>Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+membranes:+scientific+and+practical+applications.">Supported membranes: scientific and practical applications.</a> Science. 271 (5245), 43-48 (1996).</li><li>Alghalayini, A., Garcia, A., Berry, T., Cranfield, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Tethered+Bilayer+Lipid+Membranes+to+Identify+the+Mechanisms+of+Antimicrobial+Peptide+Interactions+with+Lipid+Bilayers.">The Use of Tethered Bilayer Lipid Membranes to Identify the Mechanisms of Antimicrobial Peptide Interactions with Lipid Bilayers.</a> Antibiotics. 8 (1), 12 (2019).</li><li>Khan, M. S., Dosoky, N. S., Williams, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+lipid+bilayer+membranes+for+protein+studies.">Engineering lipid bilayer membranes for protein studies.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (11), 21561-21597 (2013).</li><li>Urban, P., Kirchner, S. R., M&#252;hlbauer, C., Lohm&#252;ller, T., Feldmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+control+of+current+across+lipid+membranes+by+local+heating.">Reversible control of current across lipid membranes by local heating.</a> Scientific Reports. 6, 22686 (2016).</li><li>Palankar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoplasmonically-induced+defects+in+lipid+membrane+monitored+by+ion+current:+transient+nanopores+versus+membrane+rupture.">Nanoplasmonically-induced defects in lipid membrane monitored by ion current: transient nanopores versus membrane rupture.</a> Nano Letters. 14 (8), 4273-4279 (2014).</li><li>Bendix, P. M., Reihani, S. N. S., Oddershede, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurements+of+heating+by+electromagnetically+trapped+gold+nanoparticles+on+supported+lipid+bilayers.">Direct measurements of heating by electromagnetically trapped gold nanoparticles on supported lipid bilayers.</a> ACS Nano. 4 (4), 2256-2262 (2010).</li><li>Plaksin, M., Shapira, E., Kimmel, E., Shoham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+transients+excite+neurons+through+universal+intramembrane+mechanoelectrical+effects.">Thermal transients excite neurons through universal intramembrane mechanoelectrical effects.</a> Physical Review X. 8 (1), 011043 (2018).</li><li>Alghalayini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+heat+transfer+between+gold+nanoparticles+and+tethered+bilayer+lipid+membranes.">Real-time monitoring of heat transfer between gold nanoparticles and tethered bilayer lipid membranes.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. , 183334 (2020).</li><li>Moradi-Monfared, S., Krishnamurthy, V., Cornell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+machine+biosensor:+construction,+predictive+models+and+experimental+studies.">A molecular machine biosensor: construction, predictive models and experimental studies.</a> Biosensors and Bioelectronics. 34 (1), 261-266 (2012).</li><li>Hoiles, W., Gupta, R., Cornell, B., Cranfield, C., Krishnamurthy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+tethers+on+artificial+cell+membranes:+A+coarse-grained+molecular+dynamics+study.">The effect of tethers on artificial cell membranes: A coarse-grained molecular dynamics study.</a> PloS One. 11 (10), 0162790 (2016).</li><li>Cranfield, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+potential+gradients+and+impedance+measures+of+tethered+bilayer+lipid+membranes:+pore-forming+peptide+insertion+and+the+effect+of+electroporation.">Transient potential gradients and impedance measures of tethered bilayer lipid membranes: pore-forming peptide insertion and the effect of electroporation.</a> Biophysical Journal. 106 (1), 182-189 (2014).</li><li>Dombrovsky, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Radiation heat transfer in disperse systems. , (1996).</li><li>Cornell, B. A., Braach-Maksvytis, V., King, L., Osman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biosensor+that+uses+ion-channel+switches.">A biosensor that uses ion-channel switches.</a> Nature. 387 (6633), 580 (1997).</li><li>Maccarini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructural+determination+of+a+lipid+bilayer+tethered+to+a+gold+substrate.">Nanostructural determination of a lipid bilayer tethered to a gold substrate.</a> The European Physical Journal E. 39 (12), 123 (2016).</li><li>Beugin-Deroo, S., Ollivon, M., Lesieur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bilayer+stability+and+impermeability+of+nonionic+surfactant+vesicles+sterically+stabilized+by+PEG-cholesterol+conjugates.">Bilayer stability and impermeability of nonionic surfactant vesicles sterically stabilized by PEG-cholesterol conjugates.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 202 (2), 324-333 (1998).</li><li>Kendall, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+Structure+of+Cholesterol-Based+Tethered+Bilayer+Lipid+Membranes+on+Ionophore+Activity.">Effect of the Structure of Cholesterol-Based Tethered Bilayer Lipid Membranes on Ionophore Activity.</a> ChemPhysChem. 11 (10), 2191-2198 (2010).</li><li>Jiang, W., Kim, B. Y., Rutka, J. T., Chan, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-mediated+cellular+response+is+size-dependent.">Nanoparticle-mediated cellular response is size-dependent.</a> Nature Nanotechnology. 3 (3), 145 (2008).</li><li>He, C., Hu, Y., Yin, L., Tang, C., Yin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+particle+size+and+surface+charge+on+cellular+uptake+and+biodistribution+of+polymeric+nanoparticles.">Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles.</a> Biomaterials. 31 (13), 3657-3666 (2010).</li><li>Wang, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+and+bulk+contributions+to+the+second-order+nonlinear+optical+response+of+a+gold+film.">Surface and bulk contributions to the second-order nonlinear optical response of a gold film.</a> Physical Review B. 80 (23), 233402 (2009).</li></ol>

Gli autori dichiarano i seguenti interessi finanziari / relazioni personali, che possono essere considerati come potenziali interessi concorrenti: Il Prof Bruce Cornell è Direttore - Scienza e Tecnologia presso Surgical Diagnostics SDx tethered membranes Pty. Ltd.

Questo protocollo descrive l'uso del modello tBLM con un substrato di elettrodo complanare in combinazione con un allineamento laser orizzontale impostato che consente la registrazione dell'impedenza elettrica in tempo reale in risposta all'irradiazione laser di nanoparticelle d'oro. Il metodo di registrazione EIS qui presentato costruisce un elenco minimo di esperimenti necessari per fornire la registrazione dei cambiamenti di corrente ionica attraverso la membrana, che corrisponde al ca...

Le prestazioni ipertermiche dei nanomateriali d'oro irradiati offrono una nuova classe di trattamento minimamente invasivo, selettivo e mirato per infezioni e tumori1. L'impiego di nanoparticelle che possono essere riscaldate da un laser è stato utilizzato per distruggere selettivamente le cellule malate e fornire un mezzo per la somministrazione selettiva di farmaci2,3. Una conseguenza dei fenomeni di fototermolisi delle nanoparticelle plasmoniche riscaldate è il danno alle membrane cellulari. La membrana a doppio strato lipidico fluido è considerata un sito particolarmente vulnerabile per le cellule sottoposte a tali trattamenti perché la denaturazione delle proteine intrinseche di membrana e il danno alla membrana possono anche portare alla morte cellulare4, poiché molte proteine sono lì per mantenere il gradiente potenziale ionico attraverso le membrane cellulari. Mentre la capacità di determinare e monitorare il trasferimento di calore su scala nanometrica è di fondamentale interesse per lo studio e l'applicazione dei GNP irradiati1,5,6,7, la valutazione e la comprensione delle interazioni molecolari tra GNP e biomemerne, nonché le conseguenze dirette dei fenomeni di riscaldamento indotti dal laser dei GNP incorporati nei tessuti biologici, devono ancora essere pienamente chiariti8. Pertanto, una conoscenza approfondita del processo di ipertermia dei GNP irradiati rimane una sfida. Pertanto, lo sviluppo di un'interfaccia nanomateriale-elettrodo che imita l'ambiente naturale delle cellule potrebbe fornire un mezzo per intraprendere un'indagine approfondita delle caratteristiche di trasferimento di calore delle nanoparticelle d'oro irradiate all'interno dei sistemi biologici.
La complessità delle membrane cellulari native è una delle sfide significative nella comprensione delle interazioni dei GNP irradiati nelle cellule. Sono state sviluppate varie piattaforme di membrana artificiale per fornire versioni bio-mimetiche semplici dell'architettura e della funzionalità della membrana lipidica naturale, tra cui, ma non solo, membrane lipidiche nere9,membrane a doppio strato planare supportate10,membrane ibride a doppio strato11,membrane a doppio strato lipidico ammortizzate con polimeri12 e membrane lipidiche a doppio strato legate13. Ogni modello di membrana lipidica artificiale presenta vantaggi e limitazioni distinti rispetto all'imitazione delle membrane lipidiche naturali14.
Questo studio descrive l'impiego di elettrodi rivestiti di membrana lipidica come sensore per valutare le interazioni tra nanoparticelle d'oro e membrana lipidica, utilizzando il modello tBLM. Lo schema di rilevamento del biosensore basato su tBLM fornisce stabilità e sensibilità intrinseche13 in quanto le membrane legate possono autoriparazione, a differenza di altri sistemi (come le membrane formate da patch-clamp o liposomi) in cui solo una piccola quantità di danni alla membrana provoca il loro collasso15,16,17,18. Inoltre, poiché i tBBM sono di dimensioni mm2, l'impedenza di fondo è di ordini di grandezza inferiore rispetto alle tecniche di registrazione patch-clamp, che consente una registrazione dei cambiamenti nel flusso ionico della membrana basale dovuti alle interazioni delle nanoparticelle. Di conseguenza, il presente protocollo può contrastare i cambiamenti nella conduttanza della membrana da parte di GNP legati che sono eccitati da laser le cui potenze sono basse come 135 nW / μm2.
Il sistema qui presentato fornisce un metodo sensibile e riproducibile per determinare precisi parametri laser, dimensione delle particelle, rivestimenti di particelle e composizione necessari per progettare e sviluppare terapie termiche. Questo è fondamentale per il perfezionamento delle terapie fototermiche emergenti, oltre a offrire preziose informazioni per meccanismi dettagliati di trasferimento di calore all'interno dei sistemi biologici. Il protocollo presentato si basa sul lavoro precedentemente pubblicato19. Uno schema del protocollo è il seguente: la prima sezione definisce la formazione di tBLM; la seconda sezione delinea come costruire il setup e allineare la sorgente laser di eccitazione; la sezione finale illustra come estrarre informazioni dai dati della spettroscopia di impedenza elettrica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30 nm diameter streptavidin-conjugated gold nanoparticles</td>
			<td>Cytodiagnostics</td>
			<td>AC-30-04-05</td>
			<td>This is a streptavidin-conjugated GNPs product ready for use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 nm diameter bare gold nanoparticles</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>753629</td>
			<td>This is a bare GNPs product ready for use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol-PEG-Biotin (MW1000)</td>
			<td>NANOCS</td>
			<td>PG2-BNCS-10k</td>
			<td>Dissolved in highly pure ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C20 Diphytanyl-Glycero-Phosphatidylcholine lipids</td>
			<td>SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.</td>
			<td>SDx-S1</td>
			<td>1 ml glass vial containing 70% C16 diphytanyl phosphatidylcholine (DPEPC) and 30% C16 diphytanyl glycerol (GDPE) in 99.9% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl-disulfide-tetra-ethyleneglycol-OH</td>
			<td>SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.</td>
			<td>SDx-S2</td>
			<td>Spacer molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl-disulfide (tetra-ethyleneglycol) n=2 C20-phytanyl&#160;</td>
			<td>SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.</td>
			<td>SDx-S2</td>
			<td>Tethered molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>532 nm green laser continuous light</td>
			<td>OBIS LS/OBIS CORE LS, China</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>The power of this laser was ~135&#160;mW&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tethaPod EIS reader</td>
			<td>SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.</td>
			<td>SDx-R1</td>
			<td>A reader of conductance and capacitance on six channels simultaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tethaPlate cartridge assembly</td>
			<td>SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.</td>
			<td>SDx-BG</td>
			<td>Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamp and slide assembly jig</td>
			<td>SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.</td>
			<td>SDx-A1</td>
			<td>Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid coated coplanar gold electrodes</td>
			<td>SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.</td>
			<td>SDx-T10</td>
			<td>Coplanar&#160; gold electrodes are made from 25 mm x 75&#160;mm x&#160;1&#160;mm polycarbonate base substrate with patterned gold arrays layout, then coated with benzyldisulphide, bis-tetraethylene glycol C16 phytanyl half membrane spanning tethers in a tether ratio of 10%&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tethaQuick software</td>
			<td>SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.</td>
			<td>SDx-B1</td>
			<td>Software for use with tethaPod to process data and display conductance, impedance and capacitance measurements from the tethaPlate electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;99.9% Pure ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>34963</td>
			<td>Absolute,&#160; 99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>pH 7</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tethered bilayer lipid membranes to monitor heat transfer between gold nanoparticles and lipid membranes

Qui riportiamo un protocollo per studiare il trasferimento di calore tra nanoparticelle d'oro irradiate (GNP) e membrane lipidiche a doppio strato mediante elettrochimica utilizzando membrane lipidiche a doppio strato (tBLM) assemblate su elettrodi d'oro. I GNP modificati irradiati, come i GNP coniugati con streptaviduina, sono incorporati in tBBM contenenti molecole bersaglio, come la biotina. Utilizzando questo approccio, i processi di trasferimento di calore tra GNP irradiati e membrana lipidica a doppio strato modello con entità di interesse sono mediati da un raggio laser focalizzato orizzontalmente. Il modello computazionale predittivo termico viene utilizzato per confermare i cambiamenti di conduttanza indotti elettrochimicamente nei tBBM. Nelle condizioni specifiche utilizzate, il rilevamento di impulsi di calore richiedeva l'attaccamento specifico delle nanoparticelle d'oro alla superficie della membrana, mentre le nanoparticelle d'oro non legate non riuscivano a suscitare una risposta misurabile. Questa tecnica funge da potente biosensore di rilevamento che può essere utilizzato direttamente per la progettazione e lo sviluppo di strategie per terapie termiche che consentono l'ottimizzazione dei parametri laser, della dimensione delle particelle, dei rivestimenti di particelle e della composizione.

Il substrato d'oro su cui è possibile creare tBBM è mostrato nella Figura 1. Uno schema dell'impostazione sperimentale è presentato nella Figura 2.
Gli elettrodi in oro complanare, come mostrato nella Figura 1A,sono costituiti da un substrato di base in policarbonato da 25 mm x 75 mm x 1 mm con matrici d'oro modellate. Uno strato adesivo trasparente definisce le sei singole camere di misura. L'elettrod...

Watch this Scientific Journal Video about Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes at JoVE.com

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Questo lavoro delinea un protocollo per ottenere un monitoraggio dinamico e non invasivo del trasferimento di calore dalle nanoparticelle d'oro irradiate al laser ai tBLM. Il sistema combina la spettroscopia di impedenza per la misurazione in tempo reale delle variazioni di conduttanza attraverso i tBBM, con un raggio laser focalizzato orizzontalmente che guida l'illuminazione delle nanoparticelle d'oro, per la produzione di calore.

Membrane lipidiche a doppio strato tethered per monitorare il trasferimento di calore tra nanoparticelle d'oro e membrane lipidiche

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...

tethered-bilayer-lipid-membranes-to-monitor-heat-transfer-between

Research

JoVE Journal

Biology

2.6K Views.  University of Technology Sydney. Questo lavoro delinea un protocollo per ottenere un monitoraggio dinamico e non invasivo del trasferimento di calore dalle nanoparticelle d'oro irradiate al laser ai tBLM. Il sistema combina la spettroscopia di impedenza per la misurazione in tempo reale delle variazioni di conduttanza attraverso i tBBM, con un raggio laser focalizzato orizzontalmente che guida l'illuminazione delle nanoparticelle d'oro, per la produzione di calore.

Video: Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

Francisella tularensis is a Gram-negative intracellular coccobacillus and the causative agent of the zoonotic disease tularemia. When compared with other bacterial pathogens, the extremely low infectious dose (&lt;10 CFU), rapid disease progression, and high morbidity and mortality rates suggest that the virulent strains of Francisella encode for novel virulence factors. Surface-exposed molecules, namely outer membrane proteins (OMPs), have been shown to promote bacterial host cell binding, entry, intracellular survival, virulence and immune evasion. The relevance for studying OMPs is further underscored by the fact that they can serve as protective vaccines against a number of bacterial diseases. Whereas OMPs can be extracted from gram-negative bacteria through bulk membrane extraction techniques, including sonication of cells followed by centrifugation and/or detergent extraction, these preparations are often contaminated with periplasmic and/or cytoplasmic (inner) membrane (IM) contaminants. For years, the "gold standard" method for the biochemical and biophysical separation of gram-negative IM and outer membranes (OM) has been to subject bacteria to spheroplasting and osmotic lysis, followed by sucrose density gradient centrifugation. Once layered on a sucrose gradient, OMs can be separated from IMs based on the differences in buoyant densities, believed to be predicated largely on the presence of lipopolysaccharide (LPS) in the OM. Here, we describe a rigorous and optimized method to extract, enrich, and isolate F. tularensis outer membranes and their associated OMPs.

Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

A protocol for separating inner and outer membranes from Francisella tularensis by spheroplasting, osmotic lysis, and sucrose density gradient ultracentrifugation.

Metodo per l&#39;isolamento di Francisella tularensis Membrane esterne

Francisella tularensis is a Gram-negative intracellular coccobacillus and the causative agent of the zoonotic disease tularemia. When compared with other ...

Ricerca

Biologia

Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter lipid bilayer properties. This is important because membrane proteins are energetically coupled to their host bilayer by hydrophobic interactions. Changes in bilayer properties thus alter membrane protein function, which provides an indirect way for amphiphiles to modulate protein function and a possible mechanism for "off-target" drug effects. We have previously developed an electrophysiological assay for detecting changes in lipid bilayer properties using linear gramicidin channels as probes 3,12. Gramicidin channels are mini-proteins formed by the transbilayer dimerization of two non-conducting subunits. They are sensitive to changes in their membrane environment, which makes them powerful probes for monitoring changes in lipid bilayer properties as sensed by bilayer spanning proteins. We now demonstrate a fluorescence assay for detecting changes in bilayer properties using the same channels as probes. The assay is based on measuring the time-course of fluorescence quenching from fluorophore-loaded large unilamellar vesicles due to the entry of a quencher through the gramicidin channels. We use the fluorescence indicator/quencher pair 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonate (ANTS)/Tl+ that has been successfully used in other fluorescence quenching assays 5,13. Tl+ permeates the lipid bilayer slowly 8 but passes readily through conducting gramicidin channels 1,14. The method is scalable and suitable for both mechanistic studies and high-throughput screening of small molecules for bilayer-perturbing, and potential "off-target", effects. We find that results using this method are in good agreement with previous electrophysiological results 12.

We introduce a fast fluorescence-based assay that monitors the rate of fluorescence quenching as a measure of gramicidin channel activity. The gramicidin channels are used as molecular force transducers to monitor changes in lipid bilayer properties as sensed by bilayer spanning proteins.

Gramicidina a base di fluorescenza di analisi, per determinare piccole molecole Potenziale Modifica delle proprietà del doppio strato lipidico

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter ...

Modeling Biological Membranes with Circuit Boards and Measuring Electrical Signals in Axons: Student Laboratory Exercises

This is a demonstration of how electrical models can be used to characterize biological membranes. This exercise also introduces biophysical terminology used in electrophysiology. The same equipment is used in the membrane model as on live preparations. Some properties of an isolated nerve cord are investigated: nerve action potentials, recruitment of neurons, and responsiveness of the nerve cord to environmental factors.

This is a demonstration of how biological membranes can be understood using electrical models. We also demonstrate procedures for recording action potentials from the ventral nerve cord of the crayfish for student orientated laboratories.

Modellazione membrane biologiche con Circuiti e misurazione dei segnali elettrici negli assoni: Esercizi di laboratorio per studenti

This is a demonstration of how electrical models can be used to characterize biological membranes. This exercise also introduces biophysical terminology ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Vescicole lipidiche-mediata Cromatografia di affinità mediante Magnetic separazione delle cellule attivate (LIMACS): un nuovo metodo per l&#39;analisi delle interazioni proteina-lipide

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

La ricostituzione di un canale Kv in membrane lipidiche per gli studi strutturali e funzionali

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely accepted as the in vivo model of dietary fat absorption, the surgical techniques involved are challenging and expensive. Genetic manipulation of the animal model is also costly and time consuming. The alternative in vitro model is arguably more affordable, timesaving, and less challenging. Importantly, the in vitro model allows investigators to examine the enterocytes as an isolated system, reducing the complexity inherent in the whole organism model. This paper describes how human colon carcinoma cells (Caco-2) can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs and vitamins. It explains the proper maintenance of Caco-2 cells and the preparation of their lipid mixture; and it further discusses the valuable option of using the permeable membrane system. Since differentiated Caco-2 cells are polarized, the main advantage of using the permeable membrane system is that it separates the apical from the basolateral compartment. Consequently, the lipid mixture can be added to the apical compartment while the lipoproteins can be collected from the basolateral compartment. In addition, the effectiveness of the lentivirus expression system in upregulating gene expression in Caco-2 cells is discussed. Lastly, this paper describes how to confirm the successful isolation of intestinal lipoproteins by transmission electron microscopy (TEM).

Caco-2 cells can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs/vitamins. The permeable membrane system separates the apical from the basolateral compartment, while the lentivirus expression system offers an effective gene overexpression method. The isolation of lipoproteins is confirmed by TEM.

Utilizzando cellule Caco-2 allo Studio Lipid Trasporto dall&#39;intestino

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester of glycerol and modified fatty acids that constitutes the framework of the cuticle that covers aerial plant surfaces. Suberin is a related lipid polyester that is deposited on the cell walls of certain tissues, including the root endodermis and the periderm of tubers, tree bark and roots. These lipid polymers are highly variable in composition among plant species, and often differ among tissues within a single species. Here, we describe a detailed protocol to study the monomer composition of cutin in Arabidopsis thaliana leaves by sodium methoxide (NaOMe)-catalyzed depolymerisation, derivatization, and subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. This method can be used to investigate the monomers of insoluble polyesters isolated from whole delipidated plant tissues bearing either cutin or suberin. The method can by applied not only to characterize the composition of lipid polymers in species not previously analyzed, but also as an analytical tool in forward and reverse genetic approaches to assess candidate gene function.

Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

Isolamento e analisi della composizione delle piante cuticola lipidi poliestere monomeri

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved in humans and are associated with metabolic syndrome or other diseases. Examination of lipid accumulation in this organism can be carried out by fixative dyes or label-free methods. Fixative stains like Nile red and oil red O are inexpensive, reliable ways to quantitatively measure lipid levels and to qualitatively observe lipid distribution across tissues, respectively. Moreover, these stains allow for high-throughput screening of various lipid metabolism genes and pathways. Additionally, their hydrophobic nature facilitates lipid solubility, reduces interaction with surrounding tissues, and prevents dissociation into the solvent. Though these methods are effective at examining general lipid content, they do not provide detailed information about the chemical composition and diversity of lipid deposits. For these purposes, label-free methods such as GC-MS and CARS microscopy are better suited, their costs notwithstanding.

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Nile red staining of fixed Caenorhabditis elegans is a method for quantitative measurement of neutral lipid deposits, while oil red O staining facilitates qualitative assessment of lipid distribution among tissues.

Quantificazione dell'abbondanza del lipido e valutazione della distribuzione del lipido in Caenorhabditis elegans Nilo rosso e macchie di olio rosso O

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Misurazione del metabolismo energetico in tessuto retinico Explanted usando l'analisi di flusso extracellulare

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

Colorazione delle goccioline per nidi e lipidi degli ovociti nelle larve di Drosophila

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...