Ce protocole permet aux chercheurs de chauffer avec précision une membrane modèle à interface gouttelettes, ou DIB, qui permet d’étudier une variété d’effets liés à la température qui se produisent dans les environnements cellulaires. L’avantage fondamental provient de la capacité de mesurer et de contrôler localement la température du bain dans un réservoir à faible volume sans obstruer l’accès pour les caractérisations électriques ou optiques du DIB. La capacité de chauffer précisément le bain de fluide ouvre la possibilité d’étudier les propriétés de transport et de signalisation dans les DIB formés à partir d’une variété beaucoup plus large de constituants de la membrane, y compris des extraits cellulaires naturels.
Il s’agit d’un protocole en plusieurs étapes tirant parti de plusieurs équipements qui doivent être suivis de près pour atteindre une précision expérimentale suffisante, de sorte que toute ambiguïté dans le processus écrit peut être clarifiée par une démonstration visuelle. Pour commencer, rassemblez deux morceaux de caoutchouc isolant d’un millimètre d’épaisseur garnis de 25 par 40 millimètres de longueur, deux morceaux d’un caoutchouc de six millimètres d’épaisseur qui mesurent également 25 par 40 millimètres, un ensemble de fixation de base en aluminium préparé et un réservoir d’huile acrylique qui s’insère dans la fenêtre d’observation du luminaire de base en aluminium. Placez les morceaux de caoutchouc les plus minces sur l’étage du microscope de sorte que le long bord de chaque pièce soit tangent à l’ouverture de l’étage.
Placez le luminaire de base en aluminium sur les coussinets isolants avec la fenêtre de visualisation du luminaire centrée au-dessus de l’objectif. Placez un morceau de caoutchouc plus épais sur chaque élément chauffant résistif, puis utilisez un clip d’étage de microscope pour le maintenir en place afin de protéger les éléments chauffants des dommages causés par les clips de l’étage et d’isoler contre le court-circuit électrique accidentel. Pliez soigneusement l’extrémité de mesure d’un thermocouple pour obtenir un angle de 90 degrés à environ quatre millimètres de l’extrémité.
Insérez la pointe pliue du thermocouple dans le coin inférieur gauche du luminaire en aluminium et fixez-le doucement avec une vis de verrouillage. Placez le réservoir acrylique dans le puits de l’appareil en aluminium avant d’ajouter de l’huile d’hexadécane au puits de l’appareil en aluminium afin de minimiser le risque de piégeage des bulles d’air entre la fenêtre d’observation et le fond du réservoir d’acrylique. Distribuez environ 1 000 microlitres d’huile d’hexadécane dans le puits de l’appareil en aluminium afin de fournir une surface maximale pour le transfert de chaleur tout en ne permettant pas à l’huile de déborder sur les bords de l’appareil sur l’étage du microscope ou la lentille de l’objectif.
Distribuer environ 1 000 microlitres d’huile d’hexadécane dans le réservoir acrylique sans le remplir trop. Mesurer la capacité nominale de la membrane tout en abaissant la température du bain d’huile à partir d’un point de réglage qui permet la formation de bicouche pour identifier les transitions de phase thermotrope des lipides dans la membrane. Cliquez avec le bouton droit sur le graphique de température sur l’interface graphique et effacez les données d’affichage pour vous assurer que suffisamment d’espace dans la mémoire tampon est disponible pour les enregistrements suivants.
À l’aide du générateur de forme d’onde connecté à l’amplificateur de serrage de raccordement, appliquez une forme d’onde de tension triangulaire à travers les électrodes de la bicouche d’interface gouttelette, ou DIB, et enregistrez la réponse de courant induite à travers la bicouche. Refroidissez la bicouche en réduisant la température de réglage par incréments de cinq degrés, en attendant un minimum de cinq minutes à la nouvelle température d’équilibre entre les changements de température jusqu’à ce que la température souhaitée soit atteinte. Après le bain d’huile et le refroidissement de la bicouche à la température minimale souhaitée, cliquez à nouveau avec le bouton droit sur le graphique de température dans l’interface graphique et exportez les données de température en fonction du temps vers un tableur.
Arrêtez l’enregistrement en cours. À partir du courant mesuré, calculer la capacité nominale de la réponse du courant d’onde carrée en fonction du temps pendant la période de refroidissement. Tracez la capacité nominale par rapport à la température pour observer comment la capacité de la membrane a changé, puis localisez les changements non monotones de la capacité par rapport à la température pour identifier la température de fusion.
De même, évaluez la capacité quasi statique spécifique de la bicouche à des températures fixes en incrémentant successivement la température du bain d’huile et de la zone bicouche. Modifiez la température de point de réglage par incréments de 10 degrés Celsius à l’aide de l’interface graphique et permettez au système de s’équilibrer à la nouvelle température. Effectuez les étapes décrites précédemment pour lancer la mesure du courant capacitif et l’enregistrement.
Modifiez la zone bicouche en ajustant soigneusement les positions des électrodes à l’aide des micro manipulateurs. Permettre au courant d’onde carré d’atteindre une amplitude stable et collecter des images du DIB pour permettre le calcul de la surface de la membrane en fonction du temps. Utilisez une caméra montée au microscope pour imager la bicouche vue de l’ouverture.
Ajoutez simultanément une balise numérique au logiciel d’enregistrement actuel pour marquer le point temporel correspondant pour la collecte d’images. Obtenez un total de cinq images DIB et des régions stables de courant bicouche, puis réinitialisez la température et répétez l’imagerie. Analyser les enregistrements actuels et les images DIB aux points de temps marqués correspondant aux zones bicouches à l’état stationnaire, extraire la capacité et la zone de la bicouche pour chaque température.
Tracez la capacité en fonction de la surface pour chaque température et calculez la pente de la régression de premier ordre, qui représente la capacité spécifique de la bicouche à chaque température. Tracez ensuite les valeurs de capacité spécifique par rapport à leurs températures respectives. Examinez les données spécifiques de capacité par rapport à la température pour les variations non monotones afin d’identifier les températures de fusion.
Évaluer la dynamique de la formation de canaux ioniques dépendant de la tension en générant une entrée de pas de tension continue à travers la bicouche. Réglez la tension initiale sur la valeur de pas souhaitée en millivolts et la tension finale et la taille de pas à une valeur supérieure à l’étape souhaitée. Définissez une durée souhaitée pour l’entrée pas à pas en secondes, puis choisissez la polarité souhaitée pour l’entrée pas à pas.
Changez l’amplificateur de serrage de patch pour envoyer la tension de commande provenant de la vue de laboratoire ou du module de sortie de tension à l’étage principal, allumez la tension et enregistrez la réponse de courant induite, ce qui devrait inhiber une réponse en forme de S à une tension critique. Obtenir séparément des relations de tension de courant dynamique pour une membrane aux températures souhaitées pour révéler les relations dépendantes de la tension telles que les comportements des canaux ioniques. Changez l’amplificateur de serrage de patch pour envoyer la tension de commande provenant du générateur de forme d’onde à l’étage principal et lancer des enregistrements de courant.
Sur le générateur de forme d’onde, extrayez une forme d’onde sinusoïdale continue avec une amplitude, un décalage et une fréquence souhaités. Enregistrez la réponse de courant induite sur un ou plusieurs cycles et répétez-la comme vous le souhaitez pour différentes amplitudes, fréquences et températures d’ondes sinusoïdales. Le système de contrôle de la température a été utilisé pour mettre en valeur la dépendance à la température d’un DIB formé à partir d’extrait lipidique total du cerveau, ou BTLE, lipides.
Les mesures du courant capacitif et de la température en fonction du temps sont montrées au cours d’un cycle de chauffage allant de la température ambiante à environ 60 degrés Celsius. Les changements de capacité nominale par rapport à la température au cours d’un cycle complet de refroidissement/chauffage, après la formation initiale de la bicouche à 60 degrés Celsius, ont été documentés. Des mesures quasi statiques de la capacité spécifique à différentes températures peuvent être utilisées pour identifier la température de fusion des lipides.
Le traçage de la capacité d’une zone bicouche par rapport à une zone bicouche permet une régression linéaire, où la pente représente la valeur de la capacité spécifique. L’image DIB montre que, lorsque la température est inférieure à la température de fusion, la membrane adopte un état hautement adhésif, même sous la tension des gouttelettes étirées causées par des électrodes bien séparées. Les traces de courant par rapport à tension montrées ont été obtenues en appliquant des tensions sinusoïdales de membrane, en mesurant le courant induit à deux températures différentes.
Les flèches et les nombres suivants aident à visualiser les quarts successifs de la tension sinusoïdale par rapport au temps. La densité de courant mesurée pour une membrane BTLE dorment à la monazomycine au même niveau de tension et à deux températures différentes est indiquée ici. Il est crucial de distribuer correctement l’huile d’hexadécane dans le puits du luminaire en aluminium.
Si cela se fait hors séquence ou pas soigneusement, des bulles d’air se formeront sous le puits acrylique, ce qui obstruera la vue ascendante du DIB. L’utilisateur doit également se rappeler d’effacer le tampon de données dans le logiciel de contrôle de la température avant chaque mesure pour assurer un enregistrement complet. Cette procédure permet de caractériser les membranes biomimétiques à travers une gamme de températures, ce qui est nécessaire pour étudier la dépendance à la température de la structure et du transport de la membrane.
En outre, cette capacité pourrait être utilisée pour révéler les effets à l’échelle nanométrique d’autres espèces membranaires actives, telles que les canaux ioniques biologiques et les nanomatériaux manufacturés.
