Notre protocole aidera les chercheurs à comprendre les effets physiologiques de trois méthodes différentes de transplantation de moelle osseuse et comment elles affectent les résultats expérimentaux dans l’hématopoïèse clonale. La transplantation de moelle osseuse par rayonnement corporel total peut avoir un impact négatif sur les organes cardiovasculaires et modifier la pathogenèse de la maladie. Ainsi, notre laboratoire a développé deux méthodes alternatives pour minimiser ou éviter les effets secondaires possibles.
La démonstration des procédures sera Eunbee Park, une étudiante diplômée, et Megan Evans, une boursière postdoctorale, toutes deux de mon laboratoire Pour le blindage du thorax et de l’abdomen, placez le plateau réglable et l’irradiateur à rayons X à la bonne distance pour obtenir une irradiation uniforme. Et placez les souris anesthésiées sur une plaque à led plate inversée les unes aux autres en décubitus dorsal. Fixez les pattes à la plaque avec du ruban adhésif et placez le blindage led de sorte que l’extrémité inférieure s’aligne avec l’os du xiphisternum et que l’extrémité supérieure du bouclier en plomb se trouve près du thymus.
Après le blindage, placez les souris dans l’irradiateur et exposez les animaux à deux fractions grises d’irradiation de 5,5 secondes séparées par un intervalle de quatre à 24 heures. Pour le blindage de la tête, collez soigneusement les quatre pattes de la souris sur l’abdomen. Placez la souris dans un dispositif de retenue conique et faites glisser le dispositif de retenue dans la fente à l’intérieur du bouclier de plomb afin que la tête et les oreilles de la souris soient complètement couvertes, laissant le reste du corps de la souris exposé à un rayonnement.
Après le blindage, placez les souris dans l’irradiateur et exposez les animaux à 5,5 fractions grises d’un rayonnement séparées par un intervalle de quatre à 24 heures. Après chaque radiothérapie, placez les souris anesthésiées dans une cage sur un tapis chauffé avec surveillance jusqu’à ce qu’elles soient complètement rétablies. Pour isoler les os, désinfectez la peau de la souris donneuse avec de l’éthanol à 70% et faites une petite incision transversale de la peau sous la cage thoracique.
Tenir la peau fermement de chaque côté de l’incision, déchirer dans des directions opposées vers la tête et les pieds et peler la peau de tous les membres. Couper sur les épaules et les articulations du coude, et utiliser une lingette de laboratoire pour enlever les muscles attachés et les tissus conjonctifs de l’huméri. Disloquer soigneusement les articulations entre le fémur et les os de la hanche.
Et utilisez des ciseaux émoussés pour couper le long des têtes fémorales pour détacher les jambes. Couper sur l’articulation du genou, pour séparer le fémur et le tibia. Et utilisez des lingettes de laboratoire pour enlever soigneusement les muscles attachés et les tissus conjonctifs des os.
Ensuite, tirez les os de souris du même génotype dans des tubes coniques individuels de 50 millilitres contenant 20 millilitres de PBS stérile glacé sur de la glace. Pour isoler les cellules de la moelle osseuse dans une armoire de classe de biosécurité deux, utilisez une aiguille de calibre 18 pour faire un petit trou dans le fond d’un microtube stérile de 500 microlitres. Et placez le tube dans un tube micro-centrifugeur stérile individuel de 1,5 millilitre contenant 100 microlitres de PBS stérile glacé.
Lorsque tous les tubes ont été préparés, retirez le PBS du tube contenant les os isolés et transférez les os sur une boîte de culture cellulaire stérile de 100 millimètres. Utilisez une pince fine et de petits ciseaux pour retirer soigneusement l’épiphyse des extrémités de chaque os, et placez jusqu’à six os dans chaque tube de microlitre 500. Lorsque tous les os ont été coupés, extrayez les cellules de la moelle osseuse par centrifugation.
Si tout le contenu de la moelle osseuse a été enlevé, les os doivent apparaître blancs et translucides avec une pastille rouge relativement grande au fond du tube micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre. Pour la greffe de cellules de moelle osseuse, diluer les cellules de moelle osseuse isolées dans des milieux RPMI sans sérum et charger 200 microlitres de la suspension cellulaire dans une seringue à insuline de 0,5 millilitre par souris à injecter. Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de pédale, injectez lentement le volume entier de cellules dans la veine rétro orbitale de chaque animal récepteur anesthésié.
Ensuite, placez une goutte de proparacaine sur l’œil pour soulager la douleur. Et permettre à la souris de reprendre conscience tout en étant surveillée. Comparer l’effet de trois méthodes de préconditionnement BMT sur l’engraftment de cellules de distributeur.
Les fractions des cellules de distributeur dans le sang périphérique et le tissu de coeur ont été analysées par l’écoulement cytometry à un mois de poteau BMT. Dans cette analyse représentative, dans le sang périphérique des souris réceptrices qui ont reçu l’irradiation totale de corps, les monocytes, les neutrophiles et les cellules de B ont été en grande partie ablated et remplacés par la progéniture des cellules dérivées de moelle de distributeur. En outre, les populations cardiaques résidentes de monocyte et de neutrophiles de destinataire ont été presque complètement remplacées par les cellules dérivées de distributeur.
Dans le groupe partiellement blindé d’irradiation, le remplacement dérivé de cellules immunitaires cardiaques de distributeur était modeste. Les cellules réceptrices de moelle osseuse de souris dans les régions blindées ont probablement contribué au niveau inférieur de reconstitution de sang périphérique comparée aux souris qui ont reçu l’irradiation totale de corps. Dans le groupe sans préconditionnement de BMT, les cellules dérivées de donateur étaient discernables dans le sang périphérique et les coeurs des souris réceptrices à quatre semaines de poteau BMT.
En outre, les cellules donneuses déficientes en Tet2 se sont progressivement développées au fil du temps. En comparaison, les souris réceptrices greffées avec le type sauvage cellules de donneur ont montré l’expansion clonale minimale des cellules de distributeur. L’optimisation de ces modèles expérimentaux permettra des études plus rigoureuses des gènes moteurs de l’hématopoïèse clonale qui contribuent à toutes les causes de mortalité telles que les maladies cardio-métaboliques et le cancer.
Nous espérons que nos protocoles permettront aux chercheurs d’étudier l’hématopoïèse clonale pour étudier comment elle contribue aux maladies cardiovasculaires et à d’autres états pathologiques.
