Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie, telles que la façon dont les globules blancs sont activés, et comment les allergies aux allergènes individuels se développent? Le principal avantage de ce modèle robuste et reproductible de souris allergiques est que moins de souris peuvent être utilisées pour produire une variance plus faible avec une population expérimentale. Les nouvelles immunothérapies pour contrôler les réponses immunitaires nécessitent des modèles muraux robustes comme moyen initial de tester l’efficacité in vivo.
Ainsi, les implications de cette technique s’étendent à l’immunothérapie d’allergie. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu des allergies, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que l’auto-immunité dans laquelle les réponses non désirables d’anticorps jouent un rôle clé dans la maladie. En général, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal en raison du manque d’expérience dans le travail avec des nanoparticules liposomiques ou une inexpérience avec les techniques requises dans le travail de la souris.
Commencez par ajouter l’équivalent molaire de 2,5 molaire du croisement heterobifunctional à la protéine et placez la réaction sur un shaker oscillant à température ambiante pendant environ une heure. Après une incubation d’une heure avec SPDP, désaltrez la protéine sur une colonne équilibrée en acétate de sodium de 100 millimlaires, et recueillez les fractions. Déterminez l’absorption de 280 nanomètres et mutualiser les fractions les plus importantes.
Lavez la colonne dans PBS, et ajoutez 25 millimolar dithiothreitol, ou DTT, aux fractions de protéine poolées pour une incubation de cinq à 10 minutes. Ensuite, mesurez les absorbances de 280 et 343 nanomètres de la protéine pour permettre le calcul du rapport de liaison basé sur la molarité de la protéine et du linker. Ensuite, exécutez les fractions mise en commun de la colonne lavée par PBS et recueillez les fractions pour mesurer le nanomètre de 280 nanomètres et la mise en commun des fractions supérieure, comme démontré.
Ajoutez le volume approprié de 100x DSPE-PEG2000-Maleimide à la protéine pour atteindre une concentration finale excédentaire 1x et 10 fois molaire avec un tourbillonnant doux. Ensuite, exécutez la réaction pendant la nuit sous l’azote dans un flacon à fond rond scellé. Le lendemain, exécutez la protéine sur une colonne de perles de gel dextran reliées entre elles et stockez les fractions finales de protéines liées aux lipides à quatre degrés Celsius jusqu’à leur utilisation.
Une fois que la quantité correcte de chaque lipide a été calculée, combinez tous les lipides dans un tube à essai en verre borosilicate de 12 millilitres, et utilisez une seringue et un tube de trois millilitres pour souffler soigneusement le chloroforme avec de l’azote. Ensuite, lyophiliser la solution avec 100 microlitres de DMSO pendant la nuit. Le lendemain matin, ajouter un millilitre de protéines liées aux lipides au tube lipidique de 12 millilitres, et sonifier la solution trois à quatre fois pendant 30 à 60 secondes par sonication dans un bain d’eau de sonication avec au moins cinq minutes de repos entre les sonications.
Après la dernière sonication, chargez l’échantillon dans l’une des seringues extrtruding placées dans l’extrème, et placez la seringue de l’extrème dans l’autre extrémité de l’extrème. La seringue vide se remplira au fur et à mesure que le lipide sera extrudé par la membrane polycarbonate de 0,8 micromètre. Placez l’extrème entièrement assemblé dans un bloc chauffant et déprimez doucement le piston pour vider la seringue.
Après la dernière extrusion, transférer les liposomes dans un flacon propre, et extruder les lipides par des membranes polycarbonate 0,2 et 0,1 micromètre comme vient de le démontrer. Ensuite, conservez les liposomes à quatre degrés Celsius. Pour surveiller la réponse des cellules B à l’activation antigénique du liposome, résuspendez 1,5 fois 10 aux septièmes splenocytes dans le tampon de chargement du flux calcique, et ajoutez 1,5 micromolaire Indo-1 aux cellules, inversant la solution dans le tube plusieurs fois pour mélanger.
Après une incubation de bain d’eau de 30 minutes à 37 degrés Celsius, à l’abri de la lumière, ajouter cinq fois le volume de mémoire tampon de chargement du flux de calcium, et centrifuger les cellules indo-1-étiquetées. Pour le gating à cellules B, tacher les cellules avec anti-CD5 et anticorps anti-B220 en 0,5 millilitres de tampon de chargement à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, laver les cellules dans un tampon de chargement de flux de calcium frais et réutiliser la pastille à une à deux fois 10 à la septième cellule par millilitre de flux de calcium frais en cours d’exécution tampon pour le stockage sur la glace, protégé de la lumière jusqu’à l’analyse.
Ensuite, ajoutez 0,5 millilitres de cellules à un tube de polystyrène plafonné de cinq millilitres, à fond rond, et réchauffez les cellules à 37 degrés Celsius dans un bain d’eau. Après trois à cinq minutes, transférer le tube dans une chambre à 37 degrés Celsius en veste d’eau reliée à un bain d’eau recirculation, et faire fonctionner le tube dans la veste d’eau sur le cytomètre d’écoulement. Après avoir recueilli de 5000 à 10 000 événements par seconde, permettre aux cellules de se stabiliser pendant 15 à 30 secondes, et relancer l’acquisition des données, en recueillant les données pendant au moins 10 secondes pour établir une lecture de fond.
À la marque de 10 secondes, retirez rapidement le tube du cytomètre d’écoulement et ajoutez la concentration expérimentale appropriée de liposomes antigéniques. Ensuite, pulsez le vortex des cellules, et lisez le tube sur le cytomètre pendant trois à cinq minutes supplémentaires. Pour sensibiliser les animaux, livrer 200 microlitres d’extrait d’arachide contenant de la toxine du choléra par gavage oral à chaque receveur de souris femelle BALB/c de quatre à cinq semaines une fois par semaine pendant trois semaines et 300 microlitres d’extrait dilué d’arachide au cours de la quatrième semaine.
Le jour 28, préparer l’extrait d’arachide à une concentration finale d’un milligramme par millilitre dans PBS, et utiliser un thermomètre rectal pour mesurer la température corporelle de base de chaque animal sensibilisé. Lorsque toutes les températures ont été mesurées, administrer 200 microlitres d’extrait d’arachide à chaque receveur par injection intraperitoneal, et mesurer la température corporelle avec le thermomètre rectal toutes les 15 minutes pendant une heure après l’injection. Une baisse de la température corporelle indique une allergie à l’arachide.
Après avoir isolé les splenocytes des souris allergiques aux arachides, utilisez une seringue d’insuline d’un millilitre munie d’une aiguille de 27 jauges et de 5/8 pouces pour injecter par voie intraveineuse 1,5 fois 10 à la septième des splenocytes allergiques extraits dans les veines de la queue d’animaux naïfs et non sensibilisés. Un jour après le transfert adoptif, injectez par voie intraveineuse 200 microlitres d’Ara h 2 liposomes antigéniques dans la veine arrière de chaque souris BALB/c qui a reçu les splenocytes allergiques. Deux semaines après l’injection liposome, stimuler les souris avec un i.p.
injection de soluble Ara h 2, suivie d’un défi Ara h 2 de 200 microlitres le jour 61. Ensuite, mesurez la température corporelle avec la sonde rectale toutes les 15 minutes comme démontré. La conjugaison des protéines peut être démontrée par l’exécution d’un gel réductur montrant une augmentation du poids moléculaire par rapport à la protéine non convaincue.
Pour évaluer le flux de calcium antigénique à cellules B stimulé par le liposome, portez les cellules individuelles vivantes pour permettre la sélection des cellules B cd5-négatives positives B220. Le rapport entre la violette indo-1 et la fluorescence bleue Indo-1 au fil du temps peut ensuite être analysé pour évaluer la quantité d’activation des cellules B induite par la liposome. La quantification d’Ara h 2-spécifique IgE et IgG1 dans le sérum des souris sensibilisées à l’extrait d’arachide par ELISA indique que les souris avec la sensibilité conférée qui sont stimulées avec Ara h 2 montrent mesurable Ara h 2-spécifique IgE et IgG1 dans leur sérum.
Les températures corporelles enregistrées lors du défi Ara h 2 révèlent que les souris allergiques démontrent une diminution de la température corporelle à la suite du défi, tandis que les températures corporelles chez les souris naïves demeurent constantes. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de garder soigneusement une trace de la quantité de protéines liées aux lipides étant incorporés dans les liposomes, car trop de protéines peuvent rendre l’extrusion difficile. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes comme le suivi et le tri des cellules B et T spécifiques aux allergènes peuvent être effectuées pour répondre à d’autres questions sur la façon dont ces cellules spécifiques aux allergènes réagissent aux thérapies.
Cette technique ouvrira la voie à des chercheurs dans le domaine des allergies pour explorer de nouvelles immunothérapies qui combattent les maladies allergiques à l’aide de ce modèle de souris. N’oubliez pas que travailler avec la toxine du choléra peut être dangereux et que les lignes directrices pour son utilisation doivent être suivies selon vos normes de sécurité biologique institutionnelles locales.
