Ce protocole dans les plantes mesure continue des circuits génétiques dans E.coli et le calcul de la variabilité du signal et le rapport signal-bruit dans les cellules bactériennes individuelles pour évaluer les performances du circuit. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est facilement adaptable à différentes souches et laboratoires, nécessite une formation minimale et pas d’équipement spécial, et est relativement peu coûteux. Le bruit joue un rôle important dans la détermination de la fonctionnalité des systèmes biologiques.
À l’heure actuelle, il y a un intérêt à construire des circuits génétiques à grande échelle. Ces systèmes peuvent être inhibés par le bruit Assurez-vous de bien sécher les échantillons, de garder ces plaquettes froides à quatre degrés Celsius aussi longtemps que possible, et de couper et de diviser les pièces patiemment et doucement. Pour préparer les bactéries à l’analyse inoculer une seule colonie à partir d’une culture transfected E.coli.
Par exemple, un circuit avec un journaliste GFP. Dans un tube de verre contenant cinq millilitres de bouillon LB, complétons-le avec les antibiotiques pertinents. Faire pousser les cellules à 37 degrés Celsius et 250 révolutions par minute dans un incubateur de secousses pendant deux heures jusqu’à ce que le bouillon soit nuageux.
À la fin de l’incubation, faites tourner un millilitre de solution de dilution dans une mini centrifugeuse de deux millilitres et transférez 30 microlitres de bactéries et tout le volume de la solution de dilution dans un nouveau tube de deux millilitres. Ensuite, incuber la culture pendant une heure en secouant avant d’ensemencer 40 à 60 microlitres de cette suspension sur les plaques de culture M9. Pour préparer les bactéries à l’analyse, inoculer une seule colonie à partir d’une culture transfectée d’E.Coli.
Par exemple, un circuit avec un journaliste GFP dans un tube de verre contenant cinq millilitres de bouillon LB complété par les antibiotiques pertinents. Faire pousser les cellules à 37 degrés Celsius et 250 révolutions par minute dans un incubateur de secousses pendant deux heures jusqu’à ce que le bouillon soit nuageux. À la fin de l’incubation, faites tourner un millilitre de solution de dilution dans un mini tube de micro centrifugeuse de deux millilitres et transférez 30 microlitres de bactéries et tout le volume de la solution de dilution dans un nouveau tube de deux millilitres.
Puis incuber la culture pendant une heure avec des secousses. Pour préparer des plaques de microscope, mélanger 112,5 milligrammes d’agar à faible fusion avec 40 milligrammes d’agar, et un millilitre d’acide casamino de 2% dans un flacon Erlenmeyer de 25 millilitres. Ensuite, ajoutez 8,92 millilitres de milieu minimal sur les lèvres intérieures d’une fiole Erlenmeyer de 25 millilitres et micro-ondes la solution résultante en rafales courtes, de deux à trois secondes.
Ensuite, réglez le bain d’eau à 55 degrés Celsius. Lorsque la solution est claire, placez le flacon Erlenmeyer de 25 millilitres dans un bain d’eau de 60 degrés Celsius et laissez refroidir la solution d’agar jusqu’à ce que sa température tombe à environ 45 à 50 degrés Celsius. Pendant le refroidissement de l’agar, nettoyez le banc de laboratoire avec 70 % d’éthanol et lissez un morceau de ruban adhésif de laboratoire sur le banc nettoyé.
Placez une feuille de couvercle en verre sur la bande et placez un deuxième bordereau de couverture à proximité. Ajouter la solution d’agar refroidie aux antibiotiques et à la solution appropriés. Verser 1,5 millilitres de solution fraîchement préparée pour geler sur le bordereau de couverture placé sur la bande et placer le deuxième bordereau de couverture sur le gel, en prenant soin d’éviter les bulles.
Remettre l’Erlenmeyer au bain d’eau chaude et couvrir les glissades de couverture pendant 20 minutes. Retournez les feuillets de couverture pendant une incubation d’une heure à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, retirer les feuillets de couverture du gel sec et couper un petit tampon de l’agarose.
Pendant l’incubation, ajouter six gouttelettes de microlitre de la suspension bactérienne préparée dans un plat de 35 millimètres et laisser sécher les gouttes pendant au moins 15 à 30 minutes. Ensuite, placez soigneusement le tampon à la fois sur une gouttelette de bactéries et laissez les échantillons se fixer pendant 20 minutes à température ambiante. Pour placer le lit d’agar sans salir l’échantillon, placez soigneusement la garniture fraîche sur la gouttelette avec le tapotage doux.
Pour l’image des échantillons, retirez le flacon de l’eau et laissez refroidir la solution gel à la température corporelle. Verser trois millimètres de gel sur le périmètre de la plaque d’échantillonnage. Lorsque l’agarose s’est solidifiée, sceller la plaque avec du ruban adhésif et utiliser une aiguille de calibre 25 pour percer plusieurs trous dans la bande.
Placez ensuite la plaque à l’envers à quatre degrés Celsius pendant au moins 30 minutes pour permettre à l’agarose de se solidifier complètement, tout en empêchant la mitose cellulaire. Dans les 24 heures, utilisez un microscope confocal de fluorescence pour localiser l’échantillon au grossissement le plus bas et engager le système de focalisation automatique du microscope. Appliquez de l’huile sur l’objectif approprié et utilisez le contrôleur de plate-forme pour déplacer la plaque pour étendre soigneusement l’huile.
Ensuite, engagez à nouveau la mise au point automatique et suivez la suggestion par défaut pour les sections transversales z step pour l’image de l’échantillon. L’E.coli doit apparaître sous forme de formes oblongues noires sur un fond blanc éteint. Et la plage dynamique de la luminance devrait montrer un pic en son centre.
Les événements de mitose peuvent d’abord être détectés par microscopie de fluorescence après 30 minutes. Bien que les cellules individuelles peuvent être difficiles à détecter à faible grossissement. Les cultures de cellules bactériennes préparées à un rapport de dilution incorrect peuvent démontrer un nombre immuable de cellules, et les échantillons préparés sans scellement des plaques peuvent présenter un rétrécissement excessif, entraînant une perte de concentration.
Les cellules peuvent également indent le gel dans leur recherche de nutriments, résultant en empilement des cellules bactériennes les uns sur les autres et compromettre le monocouche cellulaire, empêchant efficacement la détection cellulaire et la mesure fiable du signal fluorescent. Comme le suggèrent ces données, l’étape cellulaire du cycle de division n’affecte pas le niveau de bruit, car différentes plages de surface démontrent la même tendance. En outre, aucun changement substantiel dans le rapport signal-bruit n’est observé entre GFP et superfold GFP, comme l’illustrent ces données représentatives.
Lors de l’exécution de cette procédure, prenez soin de déterminer le rapport de dilution correct pour la souche bactérienne utilisée pour l’expérience. La comparaison du rapport signal-bruit de chaque circuit réglementé à cette ligne de base permet de choisir le meilleur circuit de performance et peut révéler des phénomènes intéressants
