Cette technique préserve toutes les couches rétiniennes et tous les types de cellules in situ, ce qui la rend plus pertinente sur le plan clinique par rapport aux modèles animaux et in vitro. Le principal avantage de ce protocole est qu’il minimise la perturbation de l’intégrité rétinienne lors de la manipulation des tissus, ce qui est essentiel pour comparer la rétine saine et malade. Les maladies de la rétine peuvent être imitées en cultivant le tissu dans des conditions spécifiques.
Cela permet de tester de nouvelles thérapies médicamenteuses. Les procédures de dissection et de prélèvement d’échantillons sont complexes. Par conséquent, la démonstration visuelle est essentielle pour aider les lecteurs à comprendre le protocole écrit et à mener la procédure avec succès.
Charisse Kuo, doctorante de deuxième année de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Préparer le milieu de culture contenant le mélange modifié Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 de Dulbecco et un mélange unique d’antibiotiques et d’antimycotiques. Tout d’abord, placez 500 microlitres de milieu dans une plaque de 24 puits et équilibrez-la dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Avoir le milieu prêt avant l’extraction de l’explantation évite le délogement de la rétine lors de l’ajout ultérieur. Pour extraire les explantes rétiniennes, commencez par placer l’œillet sur une boîte de Petri avec l’iris et le cristallin tournés vers le haut et l’ONH en contact avec la boîte de Petri. Maintenez l’œillet stable au niveau du limbe à l’aide d’une pince et détachez l’iris et le cristallin en faisant de petites coupures circonférentielles le long du bord externe du limbe.
Retirez soigneusement l’iris et le cristallin, en veillant à éviter de perturber la rétine. Identifiez l’ONH à l’aide d’une source de lumière blanche brillante et incisez aux quatre quadrants vers l’ONH en faisant pivoter la boîte de Petri pour une manipulation plus facile. Étalez et aplatissez soigneusement l’oculaire.
Appliquez la pince sur la sclérotique au lieu de la rétine pour éviter de perturber l’intégrité de la rétine. Retirez la plaque contenant le support préparé de l’incubateur. Placez une tréphine chirurgicale sur la rétine dans une région sans plis rétiniens et appuyez fort pour pénétrer dans la sclérotique, ce qui devrait générer un son de craquement lorsque vous percez la boîte de Pétri.
Faites pivoter la tréphine pour vous assurer que la sclérotique a été complètement pénétrée de sorte que l’explante rétinienne soit maintenant séparée du reste de l’échantillon. Appliquez la pince au niveau de la sclérotique et transférez l’explant rétinienne sandwich dans le milieu de culture. Culturez les explantes rétiniennes sandwich collectées à 37 degrés Celsius pendant 72 heures dans un incubateur de dioxyde de carbone humidifié à 5%.
La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine a montré que les explantes rétiniennes sandwich préservaient l’intégrité et une structure distincte des lamelles du GCL à l’ONL avec des noyaux compacts dans les couches nucléaires internes et externes. Une intégrité rétinienne perturbée a été trouvée sur les bords du même échantillon où la rétine s’était détachée de la choroïde et de la sclérotique RPE sous-jacentes, ce qui a entraîné une réduction de l’épaisseur de la rétine et une perte de noyaux dans l’INL et l’ONL. Aucun noyau cellulaire TUNEL positif, qui marque l’apoptose cellulaire, n’a été trouvé dans les explants rétiniens cultivés dans des conditions basales, démontrant une vitalité cellulaire soutenue même après 72 heures.
Le label GFAP était limité au GCL et à l’IPL sans fibrose gliale, un signe de pathologie qui serait identifié comme une expression étendue du GFAP dans l’ONL. La vimentine a été fortement exprimée de la couche de cellules ganglionnaires à la couche nucléaire externe, montrant une intégrité cellulaire de Mueller préservée telle que observée dans les tissus rétiniens normaux. Le test magnétique Luminex a montré que les niveaux d’IL-18, DE VEGF, d’IL-6 et d’IL-8 augmentaient significativement au-dessus de la ligne de base dans les cultures d’explants rétiniens sandwich dans des cytokines à forte teneur en glucose et pro-inflammatoires après 24 heures.
Après 72 heures, les niveaux d’IL-18 et de VEGF sont restés significativement augmentés, mais aucune différence significative n’a été trouvée dans les niveaux d’IL-6 et d’IL-8. Lors de cette procédure, laissez suffisamment de vitré résiduel, ce qui alourdiront la rétine afin qu’elle ne se détache pas de la choroïde RP et ne flotte pas dans le milieu de culture. La rétine cultivée peut être caractérisée davantage à l’aide de l’immunohistochimie et de l’histologie, tandis que les cytokines inflammatoires libérées dans le milieu cultivé peuvent être mesurées à l’aide d’un test magnétique Luminex.
Ce modèle est plus traduisible cliniquement que les modèles animaux et in vitro, ce qui rend plus approprié pour tester l’efficacité de nouveaux médicaments thérapeutiques pour les maladies de la rétine.
