이 기술은 모든 망막 층과 세포 유형을 앉아서 보존하여 동물 및 체외 모델에 비해 임상적으로 더 관련성이 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 건강하고 병들인 망막을 비교할 때 필수적인 조직 취급 도중 망막 무결성 중단을 최소화한다는 것입니다. 망막 질환은 특정 조건하에서 조직을 배양하여 모방 될 수 있습니다.
이것은 새로운 약 치료의 시험을 허용합니다. 해부 및 샘플 수집 절차는 복잡합니다. 따라서 시각적 데모는 독자가 서면 프로토콜을 이해하고 절차를 성공적으로 수행하는 데 매우 중요합니다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 2 학년 박사 과정 학생 인 Charisse Kuo가 될 것입니다. 덜벡코의 변형된 이글 중간/영양 혼합물 F-12및 항생제 및 항균제 혼합물을 1회 포함하는 배양 배지를 준비한다. 첫째, 500 마이크로리터의 매질을 24웰 플레이트에 놓고 가습된 인큐베이터에서 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 상응한다.
엑셀추출 전에 미디어를 준비하면 후속 첨가 시 망막이 해소되는 것을 방지할 수 있습니다. 망막 이출을 추출하기 위해, 아이리스와 렌즈가 위쪽으로 향하고 ONH가 페트리 접시에 닿는 페트리 접시에 안컵을 놓는 것으로 시작합니다. 집게를 사용하여 림푸스에서 안컵을 안정적으로 잡고 홍채와 렌즈를 분리하여 팔다리의 바깥쪽 가장자리를 따라 둘레작은 상처를 줄수 있습니다.
홍채와 렌즈를 조심스럽게 제거하여 망막을 방해하지 않도록하십시오. 밝은 백색 광원을 사용하여 ONH를 식별하고 4개의 사분면에서 페트리 접시를 회전시키는 ONH를 향해 절개하여 취급이 용이합니다. 조심스럽게 안컵을 펴고 평평하게 펴주세요.
망막 무결성을 방해하지 않도록 망막 대신 에 집게를 적용합니다. 인큐베이터에서 준비된 미디어를 포함하는 플레이트를 제거합니다. 망막 주름없이 지역의 망막에 외과 트레핀을 놓고 페트리 접시를 돌파할 때 균열 소리를 생성해야하는 clera를 관통하기 위해 열심히 누르는다.
트레핀을 회전하여 망막 퇴치가 시료의 나머지 부분과 분리되도록 스클레라가 완전히 침투되었는지 확인합니다. 클era에서 집게를 적용하고 샌드위치 망막 을 배양 매체로 옮기. 수집된 샌드위치 망막은 가습된 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 최대 72시간 동안 섭씨 37도에서 이출됩니다.
헤마톡슬린과 에신 염색은 샌드위치 망막 이절이 GCL에서 ONL에 이르는 뚜렷한 라멜라 구조와 내부 및 외부 핵 층의 소형 핵을 가진 뚜렷한 라멜라 구조를 보존하는 것으로 나타났다. 망막 무결성을 중단한 망막 무결성은 INL 및 ONL에서 감소된 망막 두께 및 핵 손실을 보여주는 근본적인 RPE choroid 및 clera에서 분리된 동일한 견본의 가장자리에서 찾아냈습니다. 세포 세포 세포 멸망증을 표시하는 TUNEL 양성 세포 핵은 기초 조건에서 배양된 망막 이병에서 발견되지 않았으며 72시간 후에도 지속적인 세포 활력을 입증했습니다.
GFAP 라벨링은 신경교 섬유증없이 GCL및 IPL로 제한되었다, ONL로 GFAP의 확장 된 발현으로 식별 될 병리학의 표시. Vimentin은 신경절 세포 층에서 외부 핵 층으로 높게 표현되었으며, 정상적인 망막 조직에서 볼 수 있듯이 보존된 뮬러 세포 무결성을 보여 주었습니다. 루미넥스 자기 분석은 IL-18, VEGF, IL-6 및 IL-8 수준이 24시간 후에 높은 포도당 및 프로 염증성 사이토카인에서 샌드위치 망막 박종 배양에서 기준선보다 현저히 증가하는 것으로 나타났다.
후 72 시간, IL-18 및 VEGF 수준 크게 증가 남아, 하지만 IL-6 및 IL-8 수준에서 중요 한 차이 발견 되었다. 이 절차를 수행 할 때, 충분한 잔류 유리체를 두고, 이는 RP choroid에서 분리하고 문화 매체에 떠 있지 않도록 아래로 망막의 무게를 둡니다. 배양된 망막은 면역히스토케와 히스토론을 사용하여 더욱 특징지어질 수 있으며, 배양 배지로 방출되는 염증성 사이토카인은 루미넥스 자기 분석기를 사용하여 측정될 수 있다.
이 모델은 동물 및 체외 모델에 비해 임상적으로 더 이상 번역할 수 있으며, 이는 망막 질환에 대한 새로운 치료 약물의 효능을 테스트하는 데 더 적합합니다.
