Le modèle rétinien primate établi dans cette étude nous offre l’étude du mécanisme complet et du développement thérapeutique de la détérioration rétinienne dépendante cGMP-PKG. Ce modèle individuel de primate non humain réserve la confirmation des tissus rétiniens et les interactions intercellulaires, ce qui permet une meilleure simulation des conditions in vivo. Il réduit également l’utilisation des animaux et raccourcit la durée expérimentale.
Fournir une approche expérimentale de contrôle pour étudier le développement ou la dégénérescence de la rétine. Commencez la préparation des explants rétiniens en lavant les globes oculaires isolés de macaques de type sauvage avec 10 millilitres d’iode à 5% de povidone pendant 30 secondes. Pour éviter la contamination bactérienne, trempez les globes oculaires dans une solution de PBS de streptomycine à 5% de pénicilline pendant une minute avant l’incubation dans 10 millilitres de milieu R16 pendant cinq minutes.
Ensuite, plongez les globes oculaires dans 10 millilitres de solution de protéine Ace-K préchauffée à 37 degrés Celsius et incubée pendant deux minutes. Effectuer l’incubation suivante dans 10 millilitres d’une solution de sérum fœtal bovin R16 plus un à un pendant cinq minutes. Donner un lavage final dans 10 millilitres de R16 frais.
Une fois cela fait, séparez la sclérotique, la cornée, l’iris, le cristallin et le corps vitré. Ensuite, coupez la rétine de quatre côtés avec une pince à épiler et des ciseaux. Ensuite, utilisez une lame fine de quatre millilitres pour couper l’explant rétinien à 1,5 millimètre du côté nasal, quatre millimètres du côté temporal et deux millimètres des côtés supérieur et inférieur de la tête du nerf optique.
Ensuite, à l’aide d’une lame fine d’arbre de six millimètres, coupez le côté central de l’explant rétinien contenant le disque optique et la macula. À l’aide d’une pipette large, tirez l’explant de rétine contenant la rétine et la choroïde et placez-le au milieu de l’insert avec le côté photorécepteur vers le haut. Immergez complètement la rétine dans un millilitre du milieu complet sur la plaque sous la membrane.
Cultivez les explants rétiniens et placez-les dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec du dioxyde de carbone humidifié à 5%. Donnez le traitement de concentration de médicament approprié aux explants pendant quatre jours. Utilisez au moins trois explants par condition de traitement et utilisez les explants sans le médicament comme témoin positif.
Pour la fixation et la cryosection, traiter les explants rétiniens avec un millilitre d’aldéhyde paraforme pendant 45 minutes. Après un bref rinçage avec un millilitre de PBS, incuber en série les explants dans 10% saccharose pendant 10 minutes, 20% saccharose pendant 20 minutes et 30% saccharose pendant 30 minutes. Couper les explants rétiniens uniformément avec quatre quadrants à la périphérie et six millimètres au centre.
Ensuite, transférez les explants rétiniens dans une boîte en fer blanc d’environ 1,5 par 1,5 par 1,5 centimètres avec un milieu d’enrobage de composé à température de coupe optimale recouvrant l’explant. Immédiatement, congelez les sections de tissu dans de l’azote liquide et placez-les dans un réfrigérateur à 20 degrés pour les conserver. Ensuite, coupez la gélose en un petit bloc contenant l’échantillon de tissu.
Coupez les blocs en blocs de 10 micromètres et placez les sections sur des lames de microscope à adhérence à l’aide d’une brosse douce. Ensuite, séchez les sections pendant 45 minutes à 40 degrés Celsius et stockez-les à moins 80 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Pour la coloration cyclique à la guanosine monophosphate ou au GMPc, dessiner un anneau hydrophobe autour des sections rétiniennes séchées avec un stylo bloqueur de liquide et couvrir les échantillons.
Plongez les lames dans 200 microlitres de 0,3% PBS et Triton-X100 ou PBST pendant 10 minutes, suivi d’un traitement d’une heure dans 200 microlitres de solution bloquante à température ambiante. Ensuite, incuber la lame d’échantillon pendant la nuit avec les 200 microlitres d’anticorps primaires préparés dans la solution de blocage à quatre degrés Celsius et rincer trois fois avec du PBS pendant 10 minutes. Incuber la lame dans 200 microlitres d’anticorps secondaire pendant une heure à température ambiante.
Après trois lavages de PBS pendant 10 minutes, couvrir les échantillons avec un support de montage antidécoloration contenant du DAPI et conserver à quatre degrés Celsius pendant au moins 30 minutes avant l’imagerie. Sécher la lame à température ambiante pendant 15 minutes et dessiner un anneau barrière hydrofuge autour de l’échantillon de tissu rétinien à l’aide d’un stylo bloqueur de liquide. Après incubation avec 40 millilitres de PBS pendant 15 minutes, traiter les sections avec 42 millilitres de 0,05 molaire tris-tampon ou TBS à 37 degrés Celsius.
Aspirer le TBS, incuber les échantillons avec six microlitres de protéinase K pendant cinq minutes et laver les lames trois fois avec du PBS pendant cinq minutes chacune. Exposez les lames à 40 millilitres de solution d’acide acétique éthanol dans le chaplin. Couvrez-le d’une feuille transparente et incuber à moins 20 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Lavez les lames trois fois avec TBS pendant cinq minutes à chaque fois. Exposez les lames à 200 à 300 microlitres de solution bloquante ou 1% BSA et incuberez-les dans une chambre d’humidité pendant une heure. À environ 130 microlitres de solution rouge TMR par lame et après une heure, donner deux lavages de 200 microlitres de PBS pendant cinq minutes chacun.
Placez des lames de couvercle contenant une à deux gouttes de support de montage anti-décoloration avec DAPI sur les échantillons et incuber les lames à quatre degrés Celsius pendant au moins 30 minutes avant l’imagerie. Après coloration séquentielle avec tunnel et cGMP, passez à la microscopie à lumière et à fluorescence en ajustant les paramètres de la caméra. Capturez les images de quatre champs de chaque section à l’aide du logiciel avec un appareil photo numérique à un grossissement de 20x.
Obtenez des images représentatives des zones centrales de la rétine en utilisant DAPI, EGFP et TMR avec balayage z-stack et un intervalle d’un micromètre et facultatif à 1,251 micromètres. Dans les explants rétiniens traités avec différentes concentrations des inhibiteurs de la PDE6 Zaprinast, le nombre de cellules tunnelles et GMPc positives a été fortement augmenté dans la couche nucléaire externe par rapport au groupe témoin. La forte proportion de cellules tunnel-positives suggère que l’augmentation de l’activité cGMP peut améliorer la dégénérescence des cellules rétiniennes induite avant le nid et que l’accumulation de GMPc joue un rôle dans la dégénérescence des photorécepteurs.
La préparation explant doit être effectuée dès que possible. Op animal disperse cinq et toute accumulation parce qu’il améliore la survie cellulaire et améliore l’état de la fibre de la série de piles en vrac. Dans la plus grande mesure visible, le vitré doit être nettoyé avec des stéroïdes.
Évitez de contacter les couches de fibres nerveuses rétiniennes lors du transfert d’explants rétiniens pour éviter les lésions cellulaires mécaniques. Veuillez prendre note, pour émettre un transfert en douceur des explants rétiniens vers des inserts de culture, l’animal peut être pré-trempé dans quelque chose pour le garder humide avant de transférer les tissus rétiniens. De plus, l’ensemble du processus doit être effectué dans l’atmosphère stéroïde pour éviter la contamination pendant le processus.
