Esta técnica preserva todas as camadas de retina e tipos de células in situ, tornando-a mais clinicamente relevante em comparação com modelos animais e in vitro. A principal vantagem deste protocolo é que ele minimiza a interrupção da integridade da retina durante o manuseio do tecido, o que é essencial na comparação da retina saudável e doente. Doenças da retina podem ser imitadas por cultura do tecido em condições específicas.
Isso permite testar novas terapias medicamentosas. Os procedimentos de dissecção e coleta de amostras são complexos. Portanto, a demonstração visual é fundamental para ajudar os leitores a entender o protocolo escrito e conduzir o procedimento com sucesso.
Demonstrando o procedimento estará Charisse Kuo, aluna do segundo ano de doutorado do meu laboratório. Prepare o meio de cultura contendo a mistura de médio/nutriente modificado da Águia Modificada de Dulbecco F-12 e uma mistura de antibióticos e antimícticos uma vez. Primeiro, coloque 500 microliters de médio em uma placa de 24 poços e equilibre-o em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Ter a mídia pronta antes da extração de explant evita o desalojar da retina após a adição subsequente. Para extrair explanações de retina, comece colocando a xícara ocular em uma placa de Petri com a íris e a lente voltadas para cima e o ONH entrando em contato com a placa de Petri. Segure a xícara ocular firme no limbus usando fórceps e desprende a íris e a lente fazendo pequenos cortes circunferencialmente ao longo da borda externa do limbus.
Remova a íris e a lente cuidadosamente, certificando-se de evitar perturbar a retina. Identifique o ONH usando uma fonte de luz branca brilhante e inciso nos quatro quadrantes em direção ao ONH girando a placa de Petri para facilitar o manuseio. Espalhe e achate a opaia cuidadosamente.
Aplique as fórceps na esclera em vez da retina para evitar interromper a integridade da retina. Remova a placa que contém a mídia preparada da incubadora. Coloque uma trefina cirúrgica na retina em uma região sem dobras de retina e pressione fortemente para penetrar a esclera, o que deve gerar um som de rachaduras à medida que você rompe a placa de Petri.
Gire a trefina para garantir que a esclera tenha sido penetrada totalmente de tal forma que a explanta da retina esteja agora separada do resto da amostra. Aplique as fórceps na esclera e transfira a explanta de retina sanduíche para o meio de cultura. Cultura o sanduíche coletado explanta retina a 37 graus Celsius por até 72 horas em uma incubadora umidificada de 5% de dióxido de carbono.
A hematoxilina e a coloração de eosina mostraram que as explanações de retina do sanduíche preservavam a integridade e uma estrutura lamellae distinta do GCL ao ONL com núcleos compactos nas camadas nucleares internas e externas. A integridade da retina interrompida foi encontrada nas bordas da mesma amostra onde a retina se desprendeu do coroide e esclera rpe subjacente mostrando redução da espessura da retina e perda de núcleos no INL e ONL. Nenhum núcleo celular tunel positivo, que marca a apoptose celular, foram encontrados em explanações de retina cultivadas em condições basais, demonstrando vitalidade celular sustentada mesmo após 72 horas.
A rotulagem GFAP foi restrita à GCL e ao IPL sem fibrose gliana, um sinal de patologia que seria identificada como expressão estendida de GFAP no ONL. Vimentina foi altamente expressa da camada de células gânglios para a camada nuclear externa, mostrando a integridade celular de Mueller preservada como visto em tecidos normais da retina. O ensaio magnético luminex mostrou que os níveis IL-18, VEGF, IL-6 e IL-8 aumentaram significativamente acima da linha de base nas culturas de explante de retina sanduíche em alta glicose e citocinas pró-inflamatórias após 24 horas.
Após 72 horas, os níveis IL-18 e VEGF permaneceram significativamente aumentados, mas nenhuma diferença significativa foi encontrada nos níveis IL-6 e IL-8. Ao realizar este procedimento, deixe o suficiente de vítreo residual suficiente, que pesará a retina para baixo para que não se desprende do RP choroide e flutue na mídia cultural. A retina cultivada pode ser ainda caracterizada usando imunestoquímica e histologia, enquanto as citocinas inflamatórias liberadas no meio cultivado podem ser medidas usando um ensaio magnético Luminex.
Este modelo é mais clinicamente traduzível em comparação com modelos animais e in vitro, o que torna mais adequado para testar a eficácia de novos fármacos terapêuticos para doenças da retina.
