Esta técnica preserva todas las capas de retina y los tipos de células in situ, lo que la hace clínicamente más relevante en comparación con los modelos animales e in vitro. La principal ventaja de este protocolo es que minimiza la interrupción de la integridad de la retina durante el manejo de los tejidos, lo cual es esencial cuando se compara retina sana y enferma. Las enfermedades de la retina se pueden imitar cultivando el tejido en condiciones específicas.
Esto permite probar nuevas terapias farmacológicas. Los procedimientos de disección y recolección de muestras son complejos. Por lo tanto, la demostración visual es fundamental para ayudar a los lectores a comprender el protocolo escrito y llevar a cabo el procedimiento con éxito.
Demostrando el procedimiento estará Charisse Kuo, una estudiante de doctorado de segundo año de mi laboratorio. Prepare el medio de cultivo que contenga la mezcla F-12 de medio/nutriente Modified Eagle de Dulbecco y una mezcla de antibióticos y antimicóticos una vez. Primero, coloque 500 microlitros de medio en una placa de 24 pozos y equilibre en una incubadora humidificada a 37 grados Centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Tener el medio listo antes de la extracción del explante evita el desalojo de la retina tras la posterior adición. Para extraer explantes de retina, comience colocando el ocular en una placa de Petri con el iris y la lente hacia arriba y el ONH en contacto con la placa de Petri. Mantenga el ocular firme en el limbo con confórceps y separe el iris y el cristalino haciendo pequeños cortes circunferenciales a lo largo del borde externo del limbo.
Retire el iris y la lente con cuidado, asegurándose de evitar perturbar la retina. Identifique el ONH utilizando una fuente de luz blanca brillante e incise en los cuatro cuadrantes hacia el ONH girando la placa de Petri para facilitar su manejo. Extienda y aplane el ocular con cuidado.
Aplique los pórceps a la esclerótica en lugar de a la retina para evitar interrumpir la integridad de la retina. Retire la placa que contiene el medio preparado de la incubadora. Coloque una trefina quirúrgica en la retina en una región sin pliegues retinianas y presione con fuerza para penetrar la esclerótica, lo que debería generar un sonido de agrietamiento a medida que atraviesa la placa de Petri.
Gire la trefina para asegurarse de que la esclerótica ha sido penetrada completamente de tal manera que el explante de retina ahora está separado del resto de la muestra. Aplique los forrórceps en la esclerótica y transfiera el explante retiniana sándwich al medio de cultivo. Culta los explantes de retina sándwich recolectados a 37 grados centígrados durante un total de 72 horas en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5%.
La tinción de hematoxilina y eosina mostró que los explantes retinianas sándwich preservaron la integridad y una estructura de láminas distinta desde el GCL hasta el ONL con núcleos compactos en las capas nucleares internas y externas. Se encontró integridad retiniana alterada en los bordes de la misma muestra donde la retina se había desprendido de la coroides y la esclerótica subyacentes de RPE mostrando un grosor retiniana reducido y pérdida de núcleos en el INL y ONL. No se encontraron núcleos celulares TUNEL positivos, que marcan la apoptosis celular, en explantes retinianas cultivados en condiciones basales, demostrando una vitalidad celular sostenida incluso después de 72 horas.
El etiquetado GFAP se restringió al GCL y al IPL sin fibrosis glial, un signo de patología que se identificaría como la expresión extendida de GFAP en el ONL. La vimentina se expresó altamente desde la capa celular ganglionar hasta la capa nuclear externa, mostrando la integridad de la célula Mueller preservada como se ve en los tejidos normales de la retina. El ensayo magnético luminex mostró que los niveles de IL-18, VEGF, IL-6 e IL-8 aumentaron significativamente por encima del valor basal en los cultivos de explante retiniana sándwich en citoquinas proinflamatorias y de glucosa alta después de 24 horas.
Después de 72 horas, los niveles de IL-18 y VEGF permanecieron significativamente aumentados, pero no se encontraron diferencias significativas en los niveles de IL-6 e IL-8. Al realizar este procedimiento, deje suficiente vítreo residual, que pesará la retina hacia abajo para que no se desprenda de la coroides RP y flote en el medio de cultivo. La retina cultivada se puede caracterizar aún más mediante inmunohistoquímica e histología, mientras que las citoquinas inflamatorias liberadas en el medio cultivado se pueden medir mediante un ensayo magnético Luminex.
Este modelo es más traducible clínicamente en comparación con los modelos animales e in vitro, lo que lo hace más adecuado para probar la eficacia de nuevos fármacos terapéuticos para las enfermedades de la retina.
