Ce protocole décrit la préparation et l’utilisation d’embryons de poulet entre le cinquième et le huitième jour d’incubation pour l’imagerie par ultrasons à contraste amélioré et les études d’administration de médicaments médiées par microbulles. Les trois méthodes pour retirer le contenu de la coquille d’œuf du cinquième au huitième jour permettent son développement dans la coquille et ne nécessitent que des outils de laboratoire de base. Ce modèle convient pour étudier différents aspects de l’échographie et de la recherche vasculaire tels que l’imagerie du flux sanguin, l’administration de médicaments et de nouveaux agents de contraste et transducteurs ultrasonores. Pour préparer un embryon de cinq jours, placez un œuf fécondé incubé de cinq jours dans un porte-œuf préchauffé avec l’œuf dans la même orientation que dans l’incubateur et utilisez l’extrémité pointue d’une pointe de pince à épiler pour faire une petite indentation sur le dessus de l’œuf.
Utilisez la pince à épiler pour faire une deuxième indentation sur le côté de l’œuf à environ 2/3 de la longueur de l’œuf et utilisez une paire de pincettes plus grandes pour retirer un petit morceau de coquille d’œuf de la zone dentelée au sommet de l’œuf, en veillant à ce que le sac d’air entre en contact avec l’air ambiant sans pénétrer trop profondément dans la coquille. À l’aide d’une seringue de cinq millilitres équipée d’une aiguille de calibre 19, pénétrez dans la coquille par la deuxième indentation avec l’aiguille pointée vers le bas et retirez environ deux millilitres d’albumine. Lorsque l’albumine a été recueillie, utilisez du ruban adhésif pour sceller la perforation et distribuez l’albumine dans un bateau de pesée.
Utilisez la grande pince à épiler pour agrandir la petite ouverture sur le dessus de l’œuf jusqu’à ce que l’embryon et la membrane chorio-allantoïdienne soient entièrement visibles sans enlever la coquille sous la membrane chorio-allantoïdienne ni pénétrer dans la membrane interne. Lorsqu’une ouverture suffisante a été créée, tournez l’œuf de 180 degrés à l’intérieur du support de sorte que l’ouverture en haut de l’œuf soit maintenant tournée vers le bas. Après une à deux minutes, l’embryon flottera vers le haut, devenant invisible par le bas.
Lorsque l’embryon entier et la membrane chorio-allantoïdienne ont disparu de la vue et que seul le jaune est visible, retirez le ruban de l’ouverture latérale. L’intérieur de l’œuf devrait sortir de l’ouverture. Tout en tenant le fond de l’œuf près du bateau de pesage dans le porte-bateau de pesage en métal, utilisez les pointes tranchantes des petites pinces à épiler pour faire une rayure horizontale doucement mais rapidement dans la membrane sur toute la largeur de l’ouverture et déposez doucement le contenu de l’œuf dans le bateau de pesée.
Vérifiez si le rythme cardiaque est toujours présent pour confirmer que l’embryon est toujours en vie, que les vaisseaux de la membrane chorio-allantoïdienne sont intacts et qu’il n’y a pas de fuite de sang ou de vitellin. Placez l’embryon viable à 37 degrés Celsius avec l’administration régulière de gouttes de 30 microlitres de PBS de 37 degrés Celsius à l’embryon et à la membrane chorio-allantoïdienne. Pour récolter un embryon de six à sept jours et une membrane chorio-allantoïdienne, préparez l’œuf comme démontré pour un embryon de cinq jours et utilisez une nouvelle seringue de cinq millilitres équipée d’une aiguille de calibre 19 pour pénétrer la coquille à travers la deuxième indentation avec l’aiguille pointée vers le bas pour retirer cinq à six millilitres d’albumine en une seule pénétration.
Lorsque l’albumine a été recueillie, insérer l’aiguille d’une seringue de 10 millilitres contenant environ un millilitre de PBS de 37 degrés Celsius, plus que le volume retiré, dans le côté de la coquille avec l’aiguille pointée vers le bas pour remplacer l’albumine récoltée. Ensuite, refermez rapidement l’espace avec un morceau de ruban adhésif et terminez le traitement de l’œuf comme démontré. Pour récolter l’embryon et la membrane chorio-allantoïdienne d’un œuf fécondé âgé de huit jours, tenez l’œuf horizontalement, utilisez l’extrémité arrière d’une paire de grosses pinces à épiler et faites une petite indentation à peu près à mi-hauteur de la longueur de l’œuf.
Faites de petites empreintes dans un motif d’anneau à 360 degrés autour de l’espace de la coquille d’œuf à environ 10 millimètres l’un de l’autre. Lorsque toutes les empreintes ont été créées, utilisez l’extrémité pointue de la pince à épiler pour fissurer la coquille entre deux des indentations et immergez complètement l’œuf dans un PBS de 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. À la fin de l’incubation, déplacez l’œuf sur un bateau de pesée dans le PBS et placez les deux pouces dans le grand trou pour ouvrir doucement l’œuf, qui devrait se fissurer le long des petites indentations.
Lorsque la fissure s’est formée autour de la coquille de l’œuf, écartez doucement les deux côtés, tout en déplaçant doucement les morceaux d’avant en arrière jusqu’à ce que le contenu de l’œuf soit séparé de la coquille et déposez le contenu dans le bateau de pesée. Soulevez lentement le bateau de pesée contenant le contenu de l’œuf du PBS, en inclinant légèrement le bateau pour éliminer tout excès de PBS. Ensuite, placez le bateau de pesage dans un support de pesage en métal.
À ce stade, un cœur battant peut être vu dans l’embryon. Pour préparer un échantillon d’embryon et de membrane chorio-allantoïdienne pour l’imagerie microscopique, placez un support avec une membrane acoustique avec agarose sur le fond d’une boîte de Petri contenant environ 500 millilitres de PBS à 37 degrés Celsius avec la couche d’agarose tournée vers le haut. Utilisez de petits ciseaux pour couper rapidement la membrane vitellus en six à sept coupes autour de toute la membrane chorio-allantoïdienne tout en faisant tourner le bateau de pesage pour une meilleure précision et vitesse.
Utilisez une cuillère à soupe pour ramasser la membrane découpée contenant l’embryon et la membrane chorio-allantoïdienne et soulevez lentement la cuillère pour permettre une inspection visuelle de la membrane découpée contenant l’embryon et la membrane chorio-allantoïdienne est toujours attachée au reste de la membrane du sac vitellin. Inclinez légèrement la cuillère pour éliminer autant de jaune que possible sans dessécher le tissu et immergez la membrane découpée dans le PBS dans la boîte de Petri d’un litre. À l’aide d’une petite pince à épiler, saisissez et faites tourner doucement un bord de la membrane pour enlever tout jaune qui est encore attaché avant de déplacer la membrane sur le support avec la membrane acoustique.
Utilisez une épingle d’échantillon d’insecte pour fixer la membrane aux coins opposés du support et éviter de percer les vaisseaux de la membrane chorio-allantoïdienne. Lorsque les deux coins ont été fixés, soulevez et inclinez légèrement le support pour jeter la majeure partie du PBS et utilisez la petite pince à épiler pour étirer et répartir uniformément la membrane sur le support pour permettre au reste de la membrane d’être épinglé à plat sur le support. Lorsque l’embryon a été fixé, placer le support dans une installation de microscopie à 37 degrés Celsius et placer une membrane acoustiquement et optiquement transparente sur la région d’intérêt sur l’échantillon pour permettre la visualisation optique des vaisseaux.
Dans cette analyse représentative, des embryons et des membranes chorio-allantoïdiennes âgés de cinq, six, sept et huit jours ont été prélevés comme démontré. Aucun saignement ou dommage aux embryons ou aux membranes chorio-allantoïdiennes ne peut être observé, ce qui indique que ces méthodes peuvent être utilisées pour récolter en toute sécurité la teneur en œufs sans endommager l’embryon ou les vaisseaux de la membrane chorio-allantoïdienne. De multiples complications peuvent survenir lors de l’extraction, il est donc important de suivre attentivement le protocole et de jeter tous les échantillons de tissus endommagés.
Comme démontré, l’embryon peut être injecté, par exemple, avec des agents de contraste ultrasonores tels que des microbulles. Lors de l’accouchement, les microbulles peuvent être observées circulant dans la lumière du vaisseau sanguin injecté et circulant dans le sang périphérique pendant plusieurs heures. Avant l’injection de microbulles, le contraste peut déjà être observé à l’intérieur du cœur embryonnaire par mode B, mais pas par imagerie sous-harmonique par ultrasons à haute fréquence.
L’ajout de microbulles augmente le contraste et la visibilité de l’embryon dans les deux types d’images. Des images sous-harmoniques 3D à haute fréquence peuvent également être obtenues après l’injection d’agent de contraste pour visualiser les réseaux de vaisseaux dans l’embryon et la membrane chorio-allantoïdienne. L’embryon de poulet et les vaisseaux de la membrane chorio-allantoïdienne peuvent également être utilisés pour étudier l’administration de médicaments par ultrasons.
Lorsque vous tentez cette procédure, il est très important de toujours garder l’embryon et la MCA à 37 degrés Celsius et de ne pas le laisser sécher. Après cette procédure, l’embryon de poulet peut être placé dans différentes configurations, telles qu’un réservoir d’eau ou un microscope pour effectuer une imagerie par ultrasons à contraste amélioré ou des études d’administration de médicaments médiées par microbulles. Cette méthode et cette préparation conviennent aux études d’agents de contraste par ultrasons et peuvent également être utilisées pour la recherche sur le cancer et les virus.
