Nous allons vous montrer comment préparer la culture ex ovo de caille japonaise et comment utiliser la membrane chorio-allantoïdienne ou CAM en bref pour le diagnostic photodynamique et le traitement du cancer ou des infections microbiennes. Les avantages de cette méthode sont une croissance rapide du développement, une petite taille, un bon accès aux tissus et une manipulation facile. De plus, il respecte les principes de la règle des 3R pour la conduite de la recherche animale.
En raison de sa similitude structurelle avec les muqueuses telles que la vessie, les poumons ou le placenta, il convient aux tests in vivo de médicaments potentiels, aux tests de toxicité ou aux études de transplantation. La procédure sera présentée par Barbora Kundekova et Majlinda Meta, doctorantes de mon laboratoire. Pour commencer, utilisez des œufs de caille fécondés, frais ou entreposés à une température de 10 à 15 degrés Celsius pendant un maximum de 4 à 5 jours avant le début de l’incubation.
N’utilisez que des œufs propres et intacts, puis incuber les œufs dans un incubateur à tirage forcé à 50 à 60% d’humidité et 37,5 degrés Celsius pendant environ 54 heures placé horizontalement avec les rotations d’œufs désactivées. Désinfectez la surface de l’œuf avec de l’éthanol à 70 % sans le faire pivoter. Ensuite, dans une armoire à flux laminaire stérile tout en portant des gants, ouvrez la coquille d’œuf à l’aide de petits ciseaux chirurgicaux stériles et transférez le contenu dans une plaque de culture à 6 puits.
Après chaque œuf, désinfectez les ciseaux avec de l’éthanol à 70%. Ajoutez environ 5 millilitres d’eau stérile dans les espaces de la plaque à 6 puits, car l’humidité est essentielle pour empêcher le CAM de se dessécher. Ensuite, aspirez les embryons mal inclinés ou les œufs non fécondés avec un aspirateur sous vide, puis placez les embryons dans un incubateur jusqu’à d’autres expériences tout en maintenant une température de 37 degrés Celsius dans 80 à 90% d’humidité.
Lorsque la MCP est suffisamment développée, généralement à partir du jour embryonnaire 7, placez un anneau en silicone stérilisé sur la surface du CAM le long des petits capillaires tout en évitant les principaux vaisseaux sanguins. Dans des conditions stériles, appliquez un volume approprié de solution d’hypéricine de 30 microlitres sur l’anneau de silicone et conservez les embryons dans un incubateur à 37 degrés Celsius dans 80 à 90% d’humidité. Pour effectuer un diagnostic photodynamique, illuminez le CAM à l’aide d’une lumière d’excitation violette et enregistrez la fluorescence de l’hypéricine et des tissus CAM et des cellules tumorales avec un appareil photo numérique à différents intervalles de temps après l’administration d’hypéricine.
Si la recherche nécessite une image de la MCP en lumière blanche, notez la MCA avant l’administration d’hypéricine et à la fin de l’expérience peu avant la fixation des tissus, car la lumière déclenche la photoactivation de l’hypéricine. Pour effectuer la thérapie photodynamique après l’application d’hypéricine, placez le CAM sous la fibre optique pour que le faisceau laser couvre toute la zone de l’anneau en silicone. Après avoir effectué une irradiation in vivo, dans ce cas particulier avec une lumière laser de 405 nanomètres à un taux de fluence de 285 milliwatts par centimètre carré, enregistrer la FAO en utilisant la lumière blanche et / ou la lumière fluorescente avant et après le traitement photodynamique.
Fixez le tissu CAM dans une plaque de culture avec 4% de paraformaldéhyde dans du PBS pendant un minimum de 2 heures et une nuit maximum, puis retirez le paraformaldéhyde et découpez soigneusement du CAM une partie du tissu dans l’anneau de silicone. Toutes ces étapes doivent être effectuées dans une hotte. Laver la partie coupée du tissu CAM dans l’eau pendant 10 minutes, puis déshydrater dans la série ascendante d’alcool en plaçant le tissu CAM dans de l’éthanol à 70% pendant 3 minutes, une solution d’éosine pendant 2 minutes, de la throcine à 96% d’éthanol pendant 5 minutes, 100% d’éthanol pendant 5 minutes et deux fois dans du xylène pendant 10 minutes dans une nouvelle boîte de Pétri.
Ensuite, transférer les échantillons le plus rapidement possible dans la paraffine dissoute dans des boîtes de Petri à l’aide d’une spatule ou d’une brosse fine. Après 24 heures, placez le tissu dans un moule histologique, remplissez-le d’un milieu d’enrobage à la paraffine et laissez-le se solidifier au réfrigérateur, puis coupez le CAM solidifié du milieu d’enrobage, retournez-le dans le plateau de 90 degrés, remplissez-le à nouveau avec le milieu d’enrobage et laissez-le se solidifier. Préparer des coupes de 5 à 10 micromètres sur un microtome pour l’analyse histopathologique afin de déterminer les dommages induits par la PDT.
Pour préparer les sections CAM congelées pour l’histologie, montez soigneusement la FAO fixe native ou paraformaldéhyde à 4% sur la lame de verre, remplissez le moule d’encastrement à moitié avec de l’OCT et congelez dans de l’azote liquide ou un mélange de glace sèche et d’éthanol. Après la congélation, inclinez délicatement et faites glisser le CAM de la lame en verre sur le dessus du milieu OCT congelé. Placer à nouveau dans le moule, le couvrir de milieu OCT et congeler comme décrit précédemment.
Pour l’analyse du système vasculaire CAM, des échantillons entiers de CAM sont nécessaires. Dans l’armoire à flux laminaire, faire repleuvoir CAM avec une solution de fixation préchauffée d’aldéhyde paraforme à 4% et de glutaraldéhyde à 2% dans du PBS, puis retirer la solution de fixation après 48 heures. Ensuite, séparez soigneusement le CAM de l’embryon avec des micro-ciseaux et une brosse fine et lavez-le dans du PBS, puis montez le CAM lavé sur une lame de verre et laissez-le sécher lentement.
Ensuite, photographiez la diapositive à l’aide d’un appareil photo numérique dans un transilluminateur comme source de lumière blanche homogène. L’emplacement de la tumeur sur la surface CAM a été visualisé sous lumière blanche et lumière fluorescente lors de l’ajout d’hypéricine. L’analyse histologique a montré des structures concentriques de cellules malpighiennes anormales envahissant les tissus sains accompagnées d’œdème et d’épaississement de la membrane.
Après traitement par PDT, une nette différence dans la densité des vaisseaux à l’intérieur de l’anneau et de la zone environnante a été observée. Le rayonnement laser sans la présence de photosensibilisateur n’a causé aucun dommage comparable au témoin sans aucun traitement. Après 3 heures d’incubation avec l’hypéricine, l’irradiation laser a entraîné une fluorescence causée par la monomérisation de l’hypéricine agrégée avec des dommages importants au système vasculaire.
L’analyse histologique a révélé que la MCP témoin non traitée avait une épaisseur relativement uniforme. Cependant, le traitement PDT a rendu la MCP plus mince et plus fragile. Nous venons de démontrer comment préparer le test CAM ex ovo de caille et comment l’utiliser.
Tout en maintenant les lignes directrices, cette méthodologie est facile à maîtriser et peut s’avérer rapide.
