Le protocole vise à simuler des conditions in vivo de dégénérescence discale intervertébrale pour étudier sa physiopathologie sans avoir besoin de modèles animaux. Par rapport à la culture cellulaire in vitro, la technique de culture d’organes bioréacteurs maintient les cellules dans leur microenvironnement biologique et biomécanique natif en plus de fournir une condition de culture contrôlable et reproductible. Commencez par rincer soigneusement toute la queue bovine avec de l’eau du robinet pour enlever la saleté et les poils à la surface, puis plongez la queue dans une solution de bétadine à 1% pendant 10 minutes pour désinfecter la surface.
Utilisez un scalpel numéro 20 pour enlever les tissus mous de la colonne caudale afin de faciliter l’identification des disques intervertébraux, ou IDIV. Retirez les processus épineux et transversaux des vertèbres avec un plier d’élimination osseuse. Couper transversalement avec une pince osseuse au milieu de chaque corps vertébral pour obtenir des segments de mouvement individuels, puis mettre les segments de mouvement collectés dans une boîte de Petri avec une gaze mouillée dans la solution de Ringer.
Localisez l’IVD dans les vertèbres en déplaçant doucement les segments de mouvement, puis identifiez l’emplacement de la plaque de croissance en touchant et en trouvant le côté convexe de la plaque d’extrémité osseuse. Refroidissez la lame de la scie à ruban avec la solution de Ringer et utilisez-la pour faire deux coupes parallèles dans la plaque de croissance des IDIV, une de chaque côté. Transférer les IDIV dans une boîte de Petri propre avec de la gaze propre mouillée avec la solution de Ringer.
Gratter le corps vertébral et la plaque de croissance à l’aide de la lame du scalpel, en laissant la plaque d’extrémité intacte. Placez les deux surfaces plates et parallèles pour la procédure de chargement et transférez les IVD grattés dans une boîte de Petri fraîche avec de la gaze mouillée avec la solution de Ringer. Mesurez la hauteur et le diamètre du disque avec un étrier, puis nettoyez les caillots sanguins dans l’os des vertèbres avec la solution de Ringer à l’aide d’un système de lavage au jet.
Désinfecter les IDIV dans du PBS et 10 % de streptomycine à la pénicilline en secouant pendant 15 minutes. Rincez les antibiotiques à haute concentration avec du PBS et de la streptomycine à 1% de pénicilline. Transférer les disques dans des chambres IVD contenant cinq millilitres de milieu de culture IVD et les placer dans le système bioréacteur avec un incubateur à 37 degrés Celsius avec 85% d’humidité et 5% de dioxyde de carbone.
Culturer les disques pendant quatre jours au sein d’un système de bioréacteur en maintenant différentes conditions de charge selon les groupes expérimentaux. Dans le groupe témoin physiologique, culture des IDIV avec un milieu à haute teneur en glucose en utilisant un protocole de charge de 0,02 à 0,2 mégapascals et 0,2 hertz pendant deux heures par jour. Dans le groupe pathologique, culturez les IDIV avec un milieu à faible teneur en glucose en utilisant un protocole de chargement de 0,32 à 0,5 mégapascals et cinq hertz pendant deux heures par jour.
Entre les procédures de chargement, placez les IDIV dans des plaques de six puits avec sept millilitres de milieu de culture IVD pour une récupération de gonflement libre. Mesurer la hauteur du disque quotidiennement avec un étrier après la période de gonflement libre et après la charge dynamique pendant la durée expérimentale. Après le premier cycle de chargement dynamique le premier jour, placez directement les IDIV dans une boîte de Petri en position verticale et stabilisez-les avec une pince à épiler.
Injectez le TNF-alpha recombinant avec une aiguille d’insuline de calibre 30 lentement à une vitesse d’approximativement 70 microlitres par minute dans les IVDs du groupe pathologique. Après l’injection, tirez la seringue à mi-chemin et tirez sur le piston pour créer un vide qui empêche la solution injectée de fuir, puis retirez complètement la seringue de l’IVD. La charge dégénérative combinée avec l’approvisionnement nutritionnel limité et une injection de TNF-alpha a causé une augmentation significative de l’expression génique de l’interleukine six pro-inflammatoire de marqueurs et de l’interleukine huit dans le tissu de NP après quatre jours de culture.
La libération de la protéine d’interleukin huit dans le milieu conditionné a montré une augmentation marquée du groupe pathologique le jour deux et le jour quatre. La réduction de la hauteur du disque après le chargement était plus élevée dans le groupe pathologique par rapport au groupe physiologique, et les différences étaient plus prononcées après les deuxième et troisième jours comparés au premier jour, indiquant un effet progressif des conditions dégénératives et inflammatoires. Une technique normalisée de dissection est importante pour les modèles reproductibles de culture d’IVD entier-organe.
Un bioréacteur est nécessaire pour appliquer des charges physiologiques et dégénératives sur les IDIV afin de simuler diverses conditions biomécaniques in vivo. Cette technique peut être appliquée sur les explants humains d’IVD qui est d’une pertinence clinique élevée. Il s’agit d’un nouveau modèle préclinique pour développer des traitements efficaces sur la dégénérescence discale à un stade précoce.
