Cet article a décrit une méthode simple pour apaiser la blessure dans un système tridimensionnel et multicellulaire de culture d’organe. Nous le faisons en utilisant des yeux de porc, mais même si vous n’êtes pas familier avec les yeux, vous pouvez faire ce test. Comme vue d’ensemble, nous avons reçu des yeux de porc, découpé les globes, faire une blessure circulaire dans la cornée qui passe par l’épithélium et environ un tiers du stroma.
Nous avons découpé la cornée, et la monter sur une base d’agar, et mettre cette construction dans l’incubateur. Le tissu se remplira en créant une cicatrice dans la cornée. Vous n’avez pas besoin d’ajouter des facteurs de croissance, ni même du sérum.
Ceci est fait dans les médias sans sérum. Bien que cela soit effectué dans la cornée, il peut être utilisé comme un système modèle pour la guérison fibrotique en général. Comme beaucoup de voies cellulaires qui sont activées pendant la cicatrisation sont similaires entre les systèmes.
Dans une hotte de biosécurité, utilisez une lame chirurgicale à bord droit pour retirer le globe du couvercle sur une planche à découper nettoyée à l’éthanol et enlever l’excès de tissu adipeux de chaque œil. Tenir le globe nettoyé postérieurement avec des forceps plongent immédiatement l’oeil dans PBS suivi de trois immersions rapides dans 10% d’iode, et deux immersions rapides dans PBS. Enveloppez ensuite l’œil circonférentiellement avec un tissu de laboratoire propre pour envelopper avec suffisamment de pression pour atteindre une surface cornéenne tendue sans entrer en contact avec la cornée.
À l’aide d’une tréphine de six millimètres, pénétrer l’épithélium dans le stroma antérieur au centre de la cornée sans faire une plaie d’épaisseur complète à travers toute la cornée, et faire pivoter la tréphine 180 degrés dans le sens des aiguilles d’une montre et dans le sens inverse des aiguilles d’une montre cinq fois tout en appliquant une légère pression pour approfondir la plaie. Lorsque la plaie est suffisamment profonde pour permettre à un rabat de tissu d’être soulevé avec des forceps, utilisez une lame chirurgicale pour couper le rabat parallèle au globe tout en continuant à soulever la cornée antérieure dans la marge de la plaie. Lorsque l’aileron entier a été enlevé, une plaie circulaire doit être située au centre de la cornée.
Pour récolter la cornée saisir l’œil avec le tissu de laboratoire, et utiliser une lame chirurgicale pour faire une petite incision à un millimètre du bord de la cornée pour inclure le limbus et la collecte des tissus. À l’aide de petits ciseaux pointus, continuer l’incision autour du globe en gardant une marge millimétrique à travers la cornée pour maintenir les limbes en tact. Placez ensuite la cornée, côté enroulé vers le bas, dans un plat de 60 millimètres ou de 100 millimètres contenant un millilitre de PBS.
Pour monter la cornée, utilisez deux paires de forceps pour maintenir le côté épithélial de la cornée vers le haut pour créer une tasse, et utilisez une pipette de transfert stérile pour ajouter la solution d’agar réchauffée dans la cornée jusqu’à ce que la tasse soit pleine. Après que l’agar durcit, placez soigneusement la cornée dans une nouvelle plaque de 60 millimètres côté agar vers le bas et couvrez la plaque avec un couvercle. Ajoutez ensuite quatre millilitres de milieu complété sans sérum à chaque assiette de cornées qui maintiennent les cornées à une interface air-liquide à la frontière limbale dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone à 5 %, et mouillant les surfaces cornéennes une fois par jour avec une goutte de milieu complété sans sérum à partir du milieu conditionné dans le plat pour garder les tissus hydratés.
Pour le knockdown de gène, mélangez cinq microlitres de petite interférence ou de siRNa avec 50 microlitres du milieu essentiel minimum réduit de sérum et deux microlitres du réagent de transfection. Avec 50 microlitres de sérum réduit moyen par cornée. Après cinq minutes, mélanger les deux mélanges et ajouter 200 microlitres de sérum réduit minimum moyen à chaque mélange de siRNA.
Ensuite pipette les solutions siRNA tomber sage sur chaque blessure. Ensuite, mettez les cornées dans l’incubateur. Après trois heures, utiliser le milieu dans chaque plat pour laver le siRNA des surfaces cornéeennes, et remplacer le milieu conditionné dans chaque plat par un milieu frais complété sans sérum plus des antibiotiques.
Retournez ensuite les cultures cornéeennes à l’incubateur de culture cellulaire et incubez pendant deux semaines. Six heures après la blessure, l’épithélium cornéen est absent. Six jours après la blessure, l’épithélium repousse.
La coloration d’aminé de fluorescence avec l’actine lisse d’alpha de muscle indique un gradient des myofibroblastes actifs le long de la marge de blessure du stroma antérieur au stroma postérieur. La coloration immuno-histochimique pour l’actine lisse d’alpha de muscle indique une augmentation dramatique de l’expression lisse d’actine de muscle alpha dans les cornées blessées plus de contrôle de siRNA. Comparé aux siRNA de protéine non tissés et cibles traités, cornées blessées.
De même, la fibronectine extra domaine A est régulée dans les cornées blessées traitées par siRNA par rapport aux cornées blessées non réveillées et cibles traitées par siRNA. Démonstration d’un renversement réussi de la protéine cible. En outre, le traitement des cornées blessées avec la toxine qui cible non spécifiquement la protéine cible empêche la rééthélialisation et entraîne la mort qualitative des cellules, une matrice désorganisée, et des vacuoles stromales suggérant que la toxine ne favorise pas la guérison à la concentration assayed.
En conclusion, tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de garder la lame parallèle au tissu tout en coupant, de sorte qu’il ne pénètre pas dans le globe. Différentes techniques de blessure peuvent être employées avec cet essai, y compris la brûlure chimique ou la éraflure épithéliale. Il peut également être utilisé pour les tests de toxicité des médicaments pour déterminer si l’épithélium guérit et à quel rythme.
Il s’agit d’un système de modèle de culture d’organes ex vivo qui peut précéder vos études in vivo sur la cicatrisation des plaies.
