L’implantation de cellules d’ostéosarcome à l’intérieur du microenvironnement du tibia favorise les métastases pulmonaires. Ce modèle peut également être utile pour étudier les mécanismes des métastases pulmonaires ou de nouvelles thérapies contre le cancer qui nécessitent un système immunitaire intact. Une fois la tumeur établie, l’amputation est nécessaire pour contrôler le taux de métastases dans les études de survie à long terme.
Nous utilisons les injections jugulaires pour permettre la visualisation de l’administration intraveineuse de médicaments. L’injection de veine jugulaire est utile pour de nombreux autres modèles de maladies pour lesquels une administration précise de médicaments est nécessaire. Nous avons utilisé cette méthode pour fournir des nanoparticules et des ligans radiomarqués pour l’imagerie in vivo.
Nous conseillons aux nouveaux utilisateurs de s’entraîner à retirer un membre de cinq à 10 rats euthanasiés avant de tenter une expérience pour maîtriser la mécanique de l’amputation d’un membre sans perte de sang. Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe pénien, fixez le rat anesthésié dans un cône nasal sur un coussin chauffant à faible température en position couchée. Enlevez les poils de la jambe droite, jusqu’au bas-ventre ventral et dorsal.
Utilisez de la gaze ou un spray pour désinfecter la zone chirurgicale avec de l’éthanol à 70% et un antiseptique dilué approprié et appliquez une pommade sur les yeux de l’animal. À l’aide d’un mouvement semblable à une perceuse pour faire une ouverture, insérez une aiguille de calibre 22 marquée à 10 millimètres de la pointe 10 millimètres dans la diaphyse du tibia au milieu du plateau tibial, étendant l’aiguille à travers la métaphyse dans la diaphyse. Après avoir retiré l’aiguille, mélanger doucement la suspension de cellules tumorales d’intérêt pour obtenir une suspension cellulaire homogène et charger 7,5 x 10 à la quatrième des cellules dans 20 microlitres de PBS dans une seringue Hamilton.
Marquez la seringue Hamilton avec des cellules situées à 10 millimètres de l’extrémité de l’aiguille et insérez l’aiguille à la marque de 10 millimètres dans le trou fait par l’aiguille de calibre 22. Ensuite, déchargez doucement tout le volume de cellules dans la cavité de la moelle et placez le rat dans une cage sur un coussin chauffant avec surveillance jusqu’à ce qu’il soit couché complètement. Pour l’administration intraveineuse de doxorubicine, après confirmation de l’anesthésie, utilisez une dissection minutieuse pour visualiser la veine jugulaire droite ou gauche et insérez l’aiguille dans le tissu musculaire sus-jacent.
Dirigez l’aiguille vers la tête dans la lumière de la veine jugulaire, telle qu’elle est visualisée dans la veine jugulaire antérieure au muscle pectoral, et aspirez un petit volume de sang dans la pointe de l’aiguille pour confirmer une insertion précise. Lorsque l’aiguille est en place, injecter lentement 100 à 150 microlitres de deux milligrammes par kilogramme de doxorubicine pendant une minute. La solution doit être visible dans la veine pendant l’accouchement.
Lorsque toute la solution a été administrée, utilisez de la gaze stérile pour appliquer une légère pression sur la veine et utilisez trois à quatre clips de plaie pour fermer l’incision. Après avoir confirmé la sédation, retirez les poils de la jambe droite, jusqu’au bas-ventre ventral et dorsal, et placez le rat en position couchée sur un coussin chauffant. Frottez la peau du milieu du mollet jusqu’à juste au-dessus de l’articulation de la hanche du bas-ventre droit comme démontré et appliquez une pommade sur les yeux de l’animal.
À l’aide de gants et d’instruments stériles, tirez la jambe à travers l’évent du drap chirurgical stérile et faites une incision cutanée circonférentielle juste proximale à l’étouffement. Dégraissez le membre postérieur pour exposer l’artère fémorale et la veine sur la surface ventrale-médiale du membre postérieur, et utilisez des sutures résorbables 4-0 pour plaider les vaisseaux au niveau du fémur moyen et transect distalement. Serrez la veine distalement pour réduire les fuites pendant la dissection musculaire et utilisez la dissection émoussée pour enlever l’articulation de la hanche avec une rotation latérale vers l’extérieur.
Localisez et désarticulez la tête du fémur de l’acétabulum et retirez tout tissu restant, en gardant la jambe attachée au corps. Administrer un bloc d’éclaboussures à l’acétabulum et au nerf sciatique avec environ six milligrammes par kilogramme de ropivacaïne, et utiliser une simple suture résorbable interrompue 4-0 pour fermer la musculature sur l’acétabulum. Utilisez ensuite des clips de plaie placés de cinq à 10 millimètres pour fermer les bords de la peau.
L’imagerie par rayons X pour la surveillance tumorale permet la confirmation de l’invasion de la tumeur osseuse et peut être effectuée sur des membres récemment amputés ou fixés au formol. L’imagerie par rayons X permet également d’évaluer la morphologie radiographique des poumons avec et sans métastases, fournissant une méthode rapide et facile pour déterminer la nécessité de l’euthanasie afin de prévenir les décès spontanés inutiles. Dans l’ostéosarcome du rat, la morphologie tumorale ostéolytique et ostéoblastique peut être confirmée par l’histopathologie du membre amputé.
Notez que l’os cortical est absent dans cet exemple et que l’os adjacent a été remplacé ou enrichi par un nouvel os tissé orienté perpendiculairement à la tige existante du cortex. Des îlots d’ostéoïdes immatures peuvent également être identifiés dans la tumeur. Dans ces images, on peut observer la morphologie microscopique de métastases pulmonaires représentatives, certaines avec des embolies osseuses et vasculaires tumorales minéralisées.
L’immunocoloration des tumeurs primaires de l’ostéosarcome peut révéler une infiltration des tumeurs par des populations de cellules immunitaires, telles que les macrophages CD68 positifs ou les lymphocytes T CD3 positifs. Le transfert western des lysats de protéines des cellules tumorales peut être utilisé pour déterminer l’expression des protéines kinases, des récepteurs des protéines kinases et d’autres protéines qui interagissent avec ces voies. Pour l’implantation tibiale, une fois que le premier trou tibial a été fait, continuez à tenir la jambe dans votre main non dominante au même angle pour garder la peau et les trous osseux alignés pour faciliter l’insertion de l’aiguille Hamilton.
Pour l’injection jugulaire, insérez l’aiguille dans le muscle, mais n’inclinez pas trop l’aiguille pour éviter de manquer la veine. Pour l’amputation, pratiquez d’abord la désarticulation sur des rats euthanasiés.
