Ce protocole tient compte de la recherche de la morphologie fine des neurones rétiniennes et peut donner la perspicacité dans les changements morphologiques cellulaires et subcellulaires qui se produisent dans des états de la maladie. Cette méthode améliore considérablement la transparence optique de la rétine et permet une imagerie tridimensionnelle à haute résolution, un câblage de circuit et des structures sous-cellulaires fines des neurones rétinins dans la préparation de la rétine hormonale. Enucleate les yeux de souris avec des pinces incurvées et les transférer dans une petite boîte de Petri avec 0,1 M PBS.
Creusez un petit trou le long de la jonction de la sclérotique avec l’aiguille sous le microscope de dissection, puis transférez l’œil dans du formaldéhyde à 4% pendant une heure. Recarz l’œil dans un plat avec du PBS. Sous un microscope de dissection, utilisez des ciseaux de dissection pour couper tout autour de la jonction cornéenne.
Retirez la cornée et le cristallin. Ensuite, coupez-le à la base du nerf optique et décollez soigneusement la sclérotique avec une pince pour isoler la rétine. Faites quatre petites coupes uniformément autour de la rétine et utilisez une brosse à pointe fine trempée dans du PBS pour la déposer à plat côté GCL en forme de trèfle sur une petite coupe carrée de papier filtre à base de nitrocellulose.
Ramassez le coin du papier nitrocellulose avec une pince et placez-le dans une plaque de 48 puits avec du formaldéhyde à 4% pendant une heure, puis transférez le papier filtre et la rétine dans un puits avec du PBS et lavez trois fois pendant cinq minutes chacun. Décongeler la solution A4P0 sur la glace. Ensuite, transférez la rétine dans la solution A4P0 et incuber pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec une agitation douce.
Ajoutez de l’huile végétale dans le puits pour couvrir complètement la solution A4P0. Incuber dans un bain-marie à 40 degrés Celsius pendant trois heures sans secouer. Ensuite, lavez trois fois en PBS pendant cinq minutes par lavage.
Incuber la rétine dans 10% de sulfate de dodécyle de sodium à 40 degrés Celsius pendant deux jours avec une légère secousse, puis transférer le papier filtre et la rétine au PBS avec Triton X-100 et laver cinq fois pendant 90 minutes par lavage. Après le lavage final, conservez la rétine à quatre degrés Celsius dans du PBS-T avec de l’azide de sodium à 0,01 % ou passez directement à l’immuno-coloration. Retirez la rétine du papier filtre en la décollant doucement avec une brosse à pointe fine dans PBS-T.
Incubé dans l’anticorps primaire dilué dans la solution de blocage pendant deux jours à 40 degrés Celsius avec des secousses douces. Après l’incubation, laver cinq fois pendant 90 minutes dans pbs-t. Incuber la rétine avec des anticorps secondaires appropriés dilués dans une solution bloquante pendant deux jours à 40 degrés Celsius avec une légère secousse.
Protégez les échantillons de la lumière tout au long du reste de la procédure. Laver la rétine cinq fois pendant 90 minutes dans un tampon phosphate de 0,02 M. Enfin, incuber la rétine dans une solution d’appariement de l’indice de réfraction à base de sorbitol à 40 degrés Celsius pendant la nuit avec de douces secousses.
Décrivez un glissement de couvercle en verre avec un marqueur permanent à pointe fine pour marquer une limite carrée à l’arrière d’une lame de microscope en verre. Retournez la glissière et utilisez une seringue pour tracer la limite avec une fine ligne de graisse de silicone sur le devant de la lame. Laissez un petit espace dans un coin pour que la solution de montage excédentaire s’échappe.
Transférez la rétine au centre de la zone délimitée et positionnez-la avec une brosse à pointe fine de sorte qu’elle se trouve à plat avec le côté photorécepteur contre la lame de verre. Pipetter environ 60 microlitres de sRIMS de sorte qu’il couvre la rétine aplati et s’étend à un coin de l’enceinte. Assurez-vous que la rétine reste plate et en place.
Appliquez le glissement du couvercle, en commençant par le coin avec le sRIMS et abaissez-le lentement jusqu’à ce qu’il touche la graisse de tous les côtés. Placez une pile de trois glissements de couverture de chaque côté de la rétine montée comme entretoise. Utilisez le bord long d’une autre diapositive pour appuyer sur le glissement du couvercle afin que le support soit plat et uniforme.
Conservez les diapositives à quatre degrés Celsius jusqu’à l’imagerie. Commencez par placer la lame sur l’étage du microscope et localiser l’échantillon. Pour obtenir des images empilées Z d’échantillons, concentrez-vous d’abord sur le signal dans chaque canal individuellement et définissez le temps d’exposition ou la vitesse de balayage pour les microscopes à fluorescence ou confocaux respectivement.
Définissez la plage de la pile Z en définissant manuellement le plan focal en haut et en bas de la plage souhaitée ou en définissant le milieu, puis en spécifiant une plage autour du milieu. Ajustez la taille de l’étape ou le nombre de tranches comme vous le souhaitez. Capturez l’image et enregistrez le fichier d’origine.
Ensuite, exporté en tant que fichier TIF ou un autre format souhaité. Utilisez l’analyse d’image, un logiciel de choix pour ajuster la luminosité et le contraste dans chaque canal jusqu’à ce qu’une clarté optimale soit atteinte à la fois dans les images uniques et dans le rendu tridimensionnel de la pile Z. Une fois traité avec le protocole clarity modifié transparence optique complète dans toute l’épaisseur de la rétine a été observée comparée aux rétines de contrôle non-traitées.
Les images empilées Z pour les cônes étiquetés Arrestin dans ONL, les DAC étiquetés TH dans INL et les RGCs marqués RBPMS dans GCL sont affichées ici. On a observé l’emplacement relatif des neurones dans toute l’épaisseur de la rétine dans l’image de superposition. La coloration TH et la clarté ont traité les rétines entières de mont ont été comparées aux images obtenues à partir de la préparation standard.
Dendrites et axon-comme des processus de DAC ont été plus clairement indiqués dans une rétine traitée de clarté que dans une rétine standard. Axon-comme des processus de DAC ont montré des structures complètes en forme d’anneau dans une rétine de clarté comparée à une rétine standard. Ring-comme des structures de la rétine de CLARTÉ prises utilisant la microscopie de fluorescence étaient presque identiques à ceux observés utilisant la microscopie confocale.
Les processus axon-comme ont également couru vers la rétine externe. La souillure d’Immuno contre GluA2 et PSD-95 a montré le puncta distinct, indiquant GluA2 individu contenant des récepteurs d’AMPA et les emplacements synaptiques putatifs de poteau, respectivement. Une image de superposition a montré quelques puncta sur les processus DAC.
Les points de la co-localisation putative ont été présentés dans des plans de XZ, de YZ, et de X/Y et TH Co-localisé clairement avec GluA2 et PSD-95. Il est important que la rétine reste plate pendant le processus de polymérisation de l’hydrogel afin que la rétine dégagée puisse être à plat pour le processus de montage et d’imagerie.
