Ce protocole permettra aux chercheurs de répondre à des questions importantes sur les modèles neuronaux de connectivité et d’organisation spatiale qui sous-tendent la fonction au sein d’un circuit. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de visualiser les morphologies neuronales situées profondément dans des tissus tridimensionnels intacts. Cette méthode est simple et donc facilement reproductible.
Les expérimentateurs pour la première fois devraient être à l’aise d’exécuter cette technique. Il est impératif d’avoir un échantillon de tissu clair afin d’obtenir des données de haute qualité. La démonstration visuelle de la clarté tissulaire appropriée et des techniques de nettoyage permettra des résultats facilement reproductibles.
Pour commencer, placez le tissu cérébral immergé dans l’hydrogel dans un incubateur à vide pendant trois heures à 37 degrés Celsius avec moins 90 kilopascal de vide. Laissez le dessus du tube dévissé pour permettre au vide de se former correctement. Lavez le mouchoir avec du PBS pendant 10 minutes à température ambiante en agitant doucement.
Placez l’échantillon de tissu polymérisé dans la chambre d’électrophorèse, en gardant une trace de l’orientation du tissu dans la chambre. Remplissez la chambre et le réservoir avec le tampon SDS d’électrophorèse fourni. Exécutez l’échantillon à 70 volts, un ampère et 35 degrés Celsius avec un courant constant pendant environ deux heures par millilitre de tissu.
Vérifiez périodiquement l’échantillon pour un dégagement suffisant du tissu cérébral en le retirant de la chambre et en le remplaçant dans la même orientation. Une fois que l’échantillon a fini de se nettoyer, lavez-le dans du PBS pendant la nuit à température ambiante, en remplaçant le PBS par du PBS frais aussi souvent que possible. Après le lavage final dans pbS, lavez le tissu pendant cinq minutes dans de l’eau désionisée à température ambiante trois fois.
Le tissu deviendra opaque et pourra se dilater. Incuber le tissu dans la solution correspondant à l’indice de réfraction pendant au moins quatre heures à température ambiante. Pendant l’incubation, construisez une chambre de logement appropriée pour imager l’échantillon.
Commencez par utiliser une glissière en verre comme base de montage, puis posez des entretoises en caoutchouc ou en plastique et fixez-les avec de la super colle, en vous assurant qu’il n’y a pas de trous. Placez le tissu clair dans la chambre de montage préremplie avec une solution d’appariement de l’indice de réfraction. Montez solidement le tissu en plaçant un couvercle en verre sur le dessus et en le scellant avec du vernis à ongles.
Imagez ce tissu en ajoutant une goutte de solution de montage correspondant à l’indice de réfraction directement sur le verre. Pour construire une grande chambre d’imagerie tissulaire pour les tissus de plus de cinq millimètres d’épaisseur, utilisez un plat en verre de 10 centimètres avec une paroi haute. Placez un tube conique de 50 millilitres au centre, en vous assurant que le diamètre du tube est suffisamment grand pour accepter le canon de l’objectif utilisé.
Faites 3% d’agarose dans l’eau et versez-la dans l’espace entre le plat en verre et le tube conique, puis laissez-la refroidir pendant une heure. Cela formera un anneau d’agarose solide. Collez solidement le tissu au fond de la chambre à l’aide de super colle et remplissez la chambre avec une solution correspondant à l’indice de réfraction, qui peut commencer à polymériser à moins d’être préservée de l’air et stockée à quatre degrés Celsius.
Acquérir l’image à l’aide d’un microscope confocal. Rallumez tous les équipements d’imagerie appropriés. Placez l’échantillon sur la scène.
Approchez soigneusement les médias d’immersion avec l’objectif et formez une colonne continue de médias. En utilisant l’épifluorescence, trouvez un champ d’imagerie approprié. Commencez par définir les paramètres de résolution et de vitesse d’analyse.
Si vous imaginez à l’aide d’un microscope confocal, fermez complètement le sténopé pour obtenir la plus petite section optique et donc la meilleure résolution Z. Augmentez progressivement la puissance du laser ou le gain du capteur jusqu’à ce qu’une image appropriée soit obtenue avec un rapport signal/bruit élevé. Si vous utilisez l’imagerie bicolore EGFP ou tdTomato standard, définissez les paramètres de collecte de lumière.
Définissez les paramètres de la pile Z en fonction des points de départ et d’extrémité observés du tissu. Définissez la taille du pas en fonction de la résolution Z souhaitée. Des tailles d’étape plus petites donneront une plus grande résolution Z, mais peuvent entraîner un blanchiment de l’échantillon.
Lorsque vous êtes satisfait des paramètres d’acquisition d’image, acquérez l’image. Assurez-vous que l’image a un rapport signal/bruit élevé et montre des limites distinctes des structures. Après l’acquisition de l’image, la morphologie cellulaire représentative a été analysée à l’aide de statistiques intégrées et de scripts de classification dans le logiciel d’analyse.
Les données recueillies reflètent que le neurone 2 a une structure plus grande que dendritique avec une densité d’épines plus élevée que le neurone 1. Pour étayer ce résultat, une analyse scholl standard a été effectuée, qui affirme que le neurone 2 est plus complexe dendritiquement que le neurone 1, comme en témoigne le nombre accru d’intersections de Scholl à 50 à 100 micromètres du soma. Le neurone 1 contient une plus grande proportion d’épines avec des formes plus filopodia et est un sous-type de colonne vertébrale immature.
Les épines avec des têtes définies, appelées épines de champignons, contiennent probablement des synapses plus développées et matures. Ainsi, le neurone 2 est plus mature avec une densité plus élevée d’épines matures. Après nettoyage, les morceaux de tissu peuvent être colorés en utilisant l’immunohistochimie traditionnelle.
