L’intérêt croissant pour l’étude de grandes structures multicellulaires a conduit au développement de cette technique de compensation optique qui permet une visualisation tridimensionnelle et la quantification de grandes structures au sein d’organes transparents. Ce protocole fournit un outil simple, bon marché, facile à mettre en place et complet pour étudier les tissus en trois dimensions. La nature à plusieurs couches d’une maladie ne peut pas toujours être simulée par des techniques bidimensionnelles traditionnelles.
L’analyse tridimensionnelle des tissus peut aider à mieux diagnostiquer et surveiller la maladie. Cette méthode n’est pas limitée aux tissus rénaux et peut être appliquée à n’importe quel tissu normal et diseaseé. Ce protocole simple est facile à suivre pour tout scientifique ayant une certaine expérience dans la manipulation des animaux.
Il est important de tester différents anticorps en cas de mauvaise étiquetage des anticorps, et d’effectuer des contrôles secondaires anticorps seulement. Commencez par préparer de l’héparine contenant du PBS et du paraformaldéhyde de 3,0 % en 1X PBS selon les directives manuscrites et transférez les solutions dans des seringues en plastique séparées de 50 mL. Le paraformaldéhyde est toxique et doit être préparé dans le capot des fumées.
Recueillir et profuser le rein selon les instructions manuscrites. Ensuite, retirez la capsule et coupez le rein en tranches coronale d’un mm d’épaisseur. Immerger les tranches de rein avec la solution de paraformaldéhyde préparée dans un tube conique de 15 mL.
Après fixation, laver la tranche de rein deux fois avec 1X tampon de lavage pendant une heure sur un rocker horizontal, puis procéder à la récupération des antigènes. Chauffer 300 mL de solution de démasquage d’antigène 1X dans un bécher de 500 mL. Ensuite, enfermez une tranche de rein dans une cassette d’intégration perméable au tampon chauffé et remuez-la pendant une heure à 92 à 98 degrés Celsius.
Il est important de maintenir la température stable entre 92 et 98 degrés Celsius pour cette étape de récupération des antigènes. Ensuite, transférer la tranche dans 10 mL de tampon de lavage 1X avec 0,1%Triton X-100 et la bercer pendant la nuit. Le lendemain, lavez la tranche deux fois avec 10 mL de tampon de lavage 1X frais pendant une heure.
Diluer l’anticorps primaire dans 500 microlitres de diluant normal d’anticorps. Bercer doucement la tranche de rein dans l’anticorps primaire dilué pendant quatre jours à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, laver la tranche de rein dans 10 mL de tampon de lavage 1X pendant la nuit à température ambiante, en changeant le tampon une fois après huit heures.
Diluer les anticorps secondaires dans 500 microlitres diluants d’anticorps normaux et incuber avec la tranche de rein pendant quatre jours à 37 degrés Celsius. Veuillez noter qu’à partir de ce pas en avant, la tranche de rein doit être protégée de la lumière. Après incubation avec des anticorps secondaires, laver la tranche de rein dans 10 mL de tampon de lavage 1X pendant la nuit à température ambiante.
Pour déshydrater la tranche de rein, transférez-la à cinq mL d’éthanol de haute teneur à 100 % et secouez-la pendant deux heures à température ambiante, en rafraichissant l’éthanol au bout d’une heure. Plonger la tranche de rein dans deux mL de cinnamate éthylique et verser doucement toute la nuit. Lorsque vous êtes prêt à l’image du tissu, ajouter 600 à 1000 microlitres de cinnamate éthylique dans un plat à fond de verre et transférer la tranche de rein dans le plat.
Déposer une feuille de couverture ronde sur la tranche de rein et sceller le plat avec du film de paraffine. Placez le plat sur la plate-forme d’imagerie au microscope et imagez le tissu selon les instructions manuscrites. Ce protocole a été utilisé pour effectuer avec succès l’analyse 3D sur le tissu rénal et évaluer les fonctions cellulaires et les interactions.
La méthode peut causer l’assaisinage fluorescent de journaliste mais d’autres protéines fluorescentes fortes peuvent résister à l’assaisinage de signal. La profusion aortique abdominale peut améliorer la diffusion d’anticorps. Dans certains cas, une mauvaise pénétration des anticorps entraîne un signal superficiel.
Ceci peut être corrigé avec des concentrations plus élevées ou le réapprovisionnement de l’anticorps. L’accouchement intravasculaire doit être envisagé si l’antigène d’intérêt est exprimé dans la vascularisation rénale. Cependant, les anticorps ciblant les protéines dans la membrane apical des cellules épithéliales tubules ne traversent pas la barrière de filtration glomerular et causent des signaux non spécifiques.
Le tissu peut être étiqueté avec les anticorps pour détecter une population cellulaire spécifique ou pour visualiser des segments entiers de tubules. En outre, la colocalisation des protéines en 3D peut être réalisée en combinant plusieurs anticorps. Il est important de se rappeler que l’étiquetage d’anticorps peut être amélioré avec une bonne profusion rénale, l’utilisation de l’étape de récupération d’antigène, et la concentration élevée d’anticorps.
Certaines protéines fortes de journaliste peuvent résister à l’assaisinage du signal fluorescent suivant ce protocole. Pour tester cela, sautez les étapes d’étiquetage de l’antigène et de l’anticorps. Cette technique respecte la nature tridimensionnelle des structures et ouvre de nombreux nouveaux domaines de recherche.
Il élimine les hypothèses et les interférences requises associées à l’analyse bidimensionnelle traditionnelle.
