Ce protocole peut être utilisé pour évaluer l’impact des mutations génétiques sur la fonction des fibres musculaires. En outre, il peut être utilisé pour des études de dépistage de médicaments visant à améliorer la santé musculaire. Cette technique peut être utilisée pour isoler et mesurer la contractilité dans un grand nombre de fibres musculaires dans un laps de temps relativement court sans avoir besoin d’entraînement avancé.
La composition des hydrogels peut être modifiée afin d’attester de l’effet des signaux environnementaux dans les muscles sains et malades. La partie la plus difficile de la procédure est la dissection initiale du muscle. Si suffisamment de soins ne sont pas pris, les dommages au muscle peuvent entraîner une diminution de la viabilité des fibres musculaires.
Leander Vonk, technicien de recherche, et Osman Esen, candidat au doctorat dans mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Commencez par couper la patte postérieure inférieure de la souris euthanasiée juste au-dessus de la cheville. Faites une incision sur la peau du côté dorsal du pied vers les orteils.
Pelez soigneusement la peau vers les orteils en prenant soin de ne pas endommager le muscle. Placez le pied disséqué dans un plat de protection d’étanchéité contenant 10 millilitres de milieu de dissection préchauffé à 37 degrés Celsius. Épinglez le pied à travers la peau encore attachée aux orteils.
Épinglez la jambe au-delà de la cheville et excisez soigneusement le tissu conjonctif sur le dessus du muscle. Coupez le tendon au talon et soulevez le muscle. Couper le long et sous le muscle à travers le tissu conjonctif jusqu’à ce que les tendons des orteils soient exposés.
Coupez les tendons lorsque la moitié de la longueur de trois tendons est exposée. Relâchez le muscle du pied et épinglez les tendons des muscles FDB. Retirez tout tissu conjonctif restant du muscle.
Transférer le tissu musculaire propre dans un tube contenant un milieu de dissection préchauffé. Utilisez une pipette sérologique pour transférer le muscle brevis dans un tube contenant le milieu de digestion musculaire. Placez le tissu dans un incubateur à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone pendant 80 minutes.
Transférer le muscle dans un tube de 15 millilitres contenant trois millilitres de milieu de dissection. À l’aide d’embouts de trituration préparés, pipeter le muscle du plus grand au plus petit et continuer la trituration jusqu’à ce que les fibres musculaires se soient détachées du tendon. Les tendons peuvent être enlevés avec une pointe P200.
Transférer les fibres musculaires dissociées dans un tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres de milieu de dissection. Laissez les fibres se déposer dans l’incubateur pendant 20 minutes jusqu’à ce qu’une pastille se forme. Pipeter soigneusement tout le milieu du haut de la pastille de fibre.
Sur la glace, remettre les cellules en suspension dans 875 microlitres de mélange cellulaire par muscle. Ajouter 125 microlitres de mélange de cellules matricielles dans des tubes contenant 125 microlitres de suspension cellulaire aliquote. Mélanger par pipetage doux, en évitant la formation de bulles.
Transférer immédiatement le mélange final dans un puits. Vérifiez la viabilité des fibres musculaires au microscope. Placez les gels dans un incubateur pendant 30 à 45 minutes pour favoriser la solidification.
Une fois cela fait, ajoutez soigneusement 500 microlitres de milieu de culture dans chaque puits. Allumez le système de mesure contractile optique, la lampe fluorescente, le stimulateur de cellule électrique et l’ordinateur. Réglez le stimulateur électrique à 1,0 hertz à 10 volts avec une durée d’impulsion de cinq millisecondes pour stimuler les fibres musculaires isolées.
Insérez la plaque dans le système de mesure. Connectez le pacer à l’insert et insérez-le dans la plaque de culture. Ouvrez le programme IonWizard.
Cliquez sur OK. Ouvrez un nouveau fichier en cliquant sur l’icône Fichier, puis cliquez sur Nouveau. Sélectionnez Collecter l’expérience pour vérifier si le programme est sur le bon sarcomère squelettique expérimental. Pour modifier l’expérience, cliquez sur l’expérience souhaitée, puis appuyez sur Ajouter.
Appliquez les paramètres SARC 20X, lignes moyennes, FFT unique, taux d’échantillonnage de 250 hertz et temps d’acquisition de 10 secondes. Changez la température du système de mesure à 25 degrés Celsius. Cliquez sur le chercheur de cellules ouvertes pour créer une nouvelle fenêtre contextuelle d’écran.
Sélectionnez Type de plaque et Puits actifs. Concentrez les fibres en ajustant la barre de défilement de mise au point. Permettre à la stimulation d’induire une stimulation électrique et d’observer les contractions des fibres.
En gardant les sarcomères au point, assurez-vous que la zone de mesure est fixée sur l’extrémité de la fibre de sorte que les sarcomères courent verticalement. Lorsque les sarcomères sont focalisés, un seul pic est visible dans la barre d’outils qui se déplacera vers la droite lors de la contraction. Mesurez les fibres sur le système de mesure.
Cliquez sur Démarrer pour commencer l’expérience. Appuyez sur la touche Q pour commencer à mesurer 10 transitoires de contraction. Si plus de quatre transitoires semblent sans bruit, acceptez la mesure en appuyant sur la touche Z.
Si les transitoires contiennent trop de bruit, rejetez les mesures. Appuyez sur Arrêter pour fermer la fenêtre du chercheur de cellules une fois l’expérience terminée. Enregistrez le fichier et créez un nouveau fichier.
Ouvrez le bureau du programme CytoSolver, puis cliquez sur Importer et sélectionnez les fichiers à analyser. Une fois l’analyse terminée, identifiez les pics bleu, rouge et gris. Cliquez sur Exporter.
Cochez les cases intitulées Données moyennes à données transitoires et exportez vers Excel. Un pourcentage plus élevé de mesures utilisables du muscle contractile a été obtenu dans l’hydrogel de fibrine 3D, car il empêchait les mouvements latéraux et d’autres facteurs d’influence. L’incorporation de fibres n’a pas eu d’effet significatif sur la vitesse de contraction maximale ou le raccourcissement du sarcomère.
Une contraction réduite dans la matrice basale pure a été observée, probablement en raison de la rigidité du gel ou de l’interaction accrue de la matrice cellulaire. De même, l’incorporation de la matrice basale a également réduit le raccourcissement du sarcomère par rapport à l’hydrogel de fibrine. Il est important de se rappeler que les fibres musculaires isolées sont assez fragiles et qu’il faut prendre des précautions supplémentaires pour ne pas les endommager pendant le pipetage.
Après la procédure d’isolement, des méthodes telles que l’immunomarquage, l’isolement des protéines et de l’ARN peuvent également être effectuées. Le développement de cette technique a ouvert de nouvelles possibilités pour étudier la fonction des fibres musculaires matures de manière à haut débit.
