Le maintien de la viabilité potentielle des ovocytes après le stockage à long terme représente un outil de grande opportunité, car il améliorerait l’élevage d’animaux domestiques par des programmes de sélection génétique, contribuerait à préserver la biodiversité grâce à la conservation des espèces sauvages et augmenterait la recherche en biotechnologie. La vitrification des ovocytes juvéniles était beaucoup plus courte dans l’intervalle de génération dans les programmes de reproduction. La vitrifaction par refroidissement et réchauffement ultrarapides est considérée comme une approche standard dans la préservation des ovocytes du bétail.
Cependant, chez les moutons, cette procédure est encore considérée comme relativement nouvelle et une méthode standard fait défaut. Dans ce vidéo, nous décrivons un protocole pour la vitrification de l’ovocyte de mouton, recueilli des donateurs juvéniles et adultes, et in vitro mûri avant cryopreservation. Le protocole comprend toutes les procédures de maturation in vitro, de vitrification, de réchauffement et de culture post-réchauffement.
Après avoir récupéré le complexe d’ovocytes Cumulus, où mûri in vitro pendant 24 heures dans un état statique qui comprennent pour les ovocytes juvéniles, la supplémentation avec une centaine de micromolaires de tréhalose dans le milieu de maturation. Après maturation in vitro, les ovocytes ont été dénudés des cellules de Cumulus mécaniquement par pipetting doucement et examinés au microscope stéréo, avec le grossissement de 60x. La sélection des ovocytes à soumettre aux procédures de vitrification représente la première étape importante pour garantir l’application réussie de cette procédure.
Seuls ceux avec le cytoplasme uniforme, avec une distribution homogène des gouttelettes lipidiques, l’intégrité de l’ensemble Emma large et continu pivot dans l’espace, zone compacte pellucida le diamètre extérieur d’environ 19 micromètres et montrant l’extrusion du premier corps polaire, et donc à la M2, stade doivent être sélectionnés. La vitrification a été réalisée en utilisant la méthode du volume essentiel minimum, avec un dispositif Cryotops. Après sélection, un groupe de cinq ovocytes juvéniles ont été conditionnés à 38.5 degrés Celsius dans le milieu de base pendant deux minutes.
Les ovocytes ont ensuite été déshydratés par une exposition de trois minutes à une solution d’étalonnage. Le chargement de l’ovocyte dans le dispositif de vitrification utilisé est une étape importante et critique. Cryotop utilise une bande de polypropylène fixée à un support.
Dans cette méthode, les ovocytes de la solution de vitrification, moins de 0 point millilitre, sont rapidement chargés d’un capillaire en verre sur le dessus de la bande de film. Ensuite, la solution doit être retirée, laissant derrière elle une fine couche suffisante pour couvrir les cellules à cryoconserver. Avant d’être chargé dans l’appareil Cryotop et directement plongé dans l’azote liquide dans les 30 secondes.
Pour la température biologique intérieure chaude, la teneur de chaque dispositif de vitrification a été transférée de l’azote liquide dans 200 gouttes microlitres de solution de tréhalose décroissante. Les ovocytes ont été transférés ensemble était, traînant les ovocytes avec une mince, pipette de verre, pour favoriser l’élimination des cryoprotectants intracelulaires. Enfin, les ovocytes ont été pré-reproduits dans un milieu de base en incubateur dans 5% de dioxyde de carbone.
Immédiatement après le réchauffement, et pour chaque point temporel de la culture post-réchauffement, les ovocytes ont été morphologiquement évalués à l’aide d’un microscope inversé avec un grossissement de 100x. La tolérance cryo des ovocytes des donneurs juvéniles est plus faible comparée à ceux altérés avec l’intégrité inférieure de membrane après réchauffement. L’utilisation de tréhalose dans le milieu de maturation induite dans les ovocytes juvéniles une intégrité membranaire plus élevée, augmentant les taux de survie après vitrification.
Cependant le clivage, la fertilisation, et les taux de développement des ovocytes juvéniles n’ont pas été augmentés par la supplémentation de tréhalose. L’utilisation de milieux avec une concentration en calcium égale à 2,2 milligrammes de décilitre pour la vitrification des ovocytes juvéniles, devrait des taux de fécondation plus élevés par rapport aux ovocytes vitrifiés avec la concentration de calcium, mais aucune différence n’a été trouvée permettant la production. En comparant la culture post-réchauffement sur différentes durées, nous avons montré qu’après quatre heures de culture, les ovocytes collectés auprès de deux personnes âgées sont capables de récupérer les liaisons énergétiques et la configuration microtubulaire, et de restaurer la compétence développementale avec un clivage plus élevé et des déchets de blastocytes.
L’activité mitochondriale était plus élevée dans les ovocytes juvéniles chauds vitrifiés après quatre heures de culture poteau-réchauffante, comparé à d’autres points de temps. La répartition mitochondriale a également changé pendant six heures de culture post-réchauffement. D’ailleurs, les niveaux intracellulaires réactifs d’espèces de l’oxygène étaient sensiblement inférieurs dans les ovocytes juvéniles à deux heures de culture poteau-chaude comparée à 0, 4, et 6 heures.
Cependant, et contrairement à ce qui a été trouvé dans d’autres ovocytes, les taux d’activation parthenogentic spontanée ont augmenté pendant la culture de poteau-réchauffement dans les ovocytes juvéniles. L’un des principaux avantages de la méthode proposée est qu’elle comprend toutes les étapes de la collecte des ovocytes à la maturation in vitro, à la vitrification et au réchauffement. De plus, il comprend une période de culture post-réchauffement pour permettre la récupération des ovocytes des dommages subis lors de la procédure de vitrification.
Choisir le moment optimal pour la fertilisation est difficile, et cela peut avoir un impact sur le résultat du programme de vitrification. Il faut également considérer que, contrairement à la congélation lente, la vitrification est une technique manuelle, et dépend donc de l’opérateur. Pour cette raison, un défi majeur est le besoin de techniciens et de chercheurs qualifiés qui tiennent compte de l’effet de l’opérateur dans l’évaluation des résultats du programme de vitrification.
D’autres études de notre laboratoire permettront de tenter de normaliser la procédure de vitrification et la sélection des ovocytes, et de mieux adapter la composition des milieux aux besoins de l’ovocyte juvénile. Un mépris sur l’utilisation de la culture et du caractère et antioxydant nous offrons des opportunités prometteuses.
