Dans ce protocole vidéo, nous démontrons en détail un système de culture pour la culture des ovocytes bovins. Le système prend en charge la viabilité des ovocytes en culture jusqu’à cinq jours et permet leur différenciation. En utilisant ce système de culture, les ovocytes prélevés dans de petits follicules antrals, qui ne sont normalement pas utilisés dans les protocoles standard pour la production in vitro, peuvent être cultivés pour augmenter la disponibilité des gamètes fertilisables.
Cette exploitation de la réserve plus large peut offrir de nouvelles options pour le sauvetage génétique d’espèces menacées, de la famille bovine ou de races locales menacées d’érosion génétique. Pour commencer, préparez 15 millilitres de culture de base et complétez-le selon les directives manuscrites. Ensuite, préparez trois millilitres de milieu de détention en ajoutant cinq micromolaires cilostamide au milieu de culture de base et versez-le dans une boîte de Pétri de 35 millimètres.
Préparez un long support IVCO en complétant le milieu culturel de base selon les directives manuscrites. Ajouter 200 microlitres de long milieu IVCO à chaque puits d’une plaque bien enrobée de 96 puits. Remplissez ensuite les quatre bords d’eau stérile pour compenser l’évaporation et maintenir une humidité appropriée pendant la culture.
Incuber la plaque de 96 puits et le milieu de détention à 38,5 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone avec une humidité maximale. Laver les ovaires quatre fois en solution saline stérile, maintenu à 26 degrés Celsius. Aspirez ensuite tous les follicules de plus de deux millimètres de diamètre, avec une aiguille de calibre 18 reliée à une pompe d’aspiration.
Dentelle les ovaires aspirés dans un bécher avec salin stérile maintenu à 26 degrés Celsius. Placez un ovaire à la fois sur une planche à découper PTFE stérile et utilisez une lame chirurgicale numéro 22 pour couper des tranches de cortex ovarien de 1,5 à 2 millimètres d’épaisseur, et parallèles à l’axe principal de l’organe. Dentelle les tranches de cortex ovarien dans une boîte de Pétri en verre stérile, avec milieu disséquant sur une plaque chaude, à 38,5 degrés Celsius.
Dentelle une tranche de cortex ovarien dans une boîte de Pétri en verre de 60 millimètres, avec deux à trois millilitres de M199D sous un microscope à dissection, sélectionnez les follicules qui sont entre 5 et deux millimètres. Identifiez les follicules non atrétiques sains sous le microscope stéréo, en observant des paramètres morphologiques, tels qu’un aspect translucide uniformément lumineux, une vascularisation étendue, et une couche régulière de granulosa. Tandis que les follicules atretic ont un aspect opaque gris, et sont mal vascularisés, avec un COC foncé à l’intérieur.
Jetez les follicules atrétiques et traiter tous les autres. Utilisez la lame chirurgicale pour enlever le tissu ovarien entourant le follicule d’un côté, jusqu’à ce qu’il soit exposé. Ensuite, utilisez une aiguille de calibre 26 pour faire soigneusement une fente dans la paroi du follicule exposé, qui libérera la teneur folliculaire comprenant le COC, le liquide folliculaire, et les touffes de cellules.
Identifiez le COC et examinez-le pour l’intégrité du cumulus, l’intégrité de la zona pellucida et l’homogénéité du cytoplasme. Si ces critères sont remplis, aspirez le COC avec une pipette P20. Lacez le COC isolé dans le cilostamide M199D, et continuez la procédure d’isolement pendant 30 minutes.
Après avoir sélectionné les COC, comme décrit précédemment, préparer 16 gouttes avec 20 microlitres de cilostamide M199D dans une boîte de Pétri de 60 millimètres, et placer un COC sain dans chaque goutte. Utilisez un microscope inversé attaché à une caméra pour mesurer le diamètre des ovocytes, à l’exclusion de la zona pellucida. Avec une visualisation claire de l’ovocyte, faire deux mesures perpendiculaires, assurer que la moyenne des deux mesures est dans une gamme de 100 à 110 micromètres.
Il peut être difficile de mesurer avec précision le diamètre des ovocytes, en raison des cellules cumulus compagnon. Les COC qui ont des ovocytes de diamètre plus petit ou plus grand, ou qui n’ont pas d’ovocyte arrondi, ou ceux avec des ovocytes qui ne sont pas mesurables, devraient être jetés. Transférez les COC sélectionnés dans un plat de 35 millimètres contenant du M199H moyen, et gardez-les dans l’incubateur à 38,5 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone avec une humidité maximale, assurez-vous que le temps de travail global ne dépasse pas deux heures.
Une fois les procédures de sélection et de collecte terminées, transférez un COC au centre de chaque puits de la plaque de 96 puits préparée précédemment. Incuber la plaque pendant cinq jours à 38,5 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone avec une humidité maximale, rafraîchir le milieu tous les deux jours. Pour renouveler le milieu, remplacer 100 microlitres de vieux médium par 100 microlitres de long milieu IVCO frais, le faire au microscope stéréo pour éviter de déplacer les COC.
À la fin du long IVCO, analyser la morphologie des COC. S’ils ont un investissement compact de cellules de cumulus sans signe d’expansion de cumulus, ou de dégénérescence cellulaire, classez-les comme classe un. Si les COC ont un investissement compact de cellules cumulus sans aucun signe d’expansion cumulus ou de dégénérescence cellulaire, et avec une ou plusieurs formations antrum-like, classez-les comme classe deux.
Les COC de classe trois, montrent plusieurs couches de cellules cumulus sans aucun signe d’expansion cumulus, certaines cellules désagrégées dans la couche externe des cellules cumulus et aucune formation antrum-like. Classer les COC comme classe quatre s’ils montrent une perte abondante de cellules cumulus s’étendant sur plus de 50% de la surface des ovocytes, ainsi que des signes de dégénérescence cellulaire et de débris cellulaires. À la fin du long IVCO, la morphologie brute du COC est modifiée.
Et quatre classes ont été identifiées basées sur l’aspect des cellules de cumulus. Dans l’ensemble, 74 ovocytes dans cinq répliques biologiques ont été analysés, dont 9,45 % ont été écartés d’une évaluation plus poussée. Les classes un, deux et trois ont été jugées saines, tandis que la classe quatre a montré des signes clairs de dégénérescence, tels que l’absence de couches complètes de cellules cumulus entourant les ovocytes.
Ces COC ont été jugés inappropriés pour subir des procédures en aval dans un cadre ivp potentiel. L’évaluation du stade méiotique à la fin de la longue IVCO a montré qu’un pourcentage significativement plus élevé des ovocytes sont restés arrêtés au stade immature, avec la chromatine encore enfermée dans le GV. Lorsque la condensation de la chromatine dans le GV a été étudiée comme marqueur de gain de compétence, la transition de la configuration chromatine vers des stades plus condensés, à savoir gv deux et GV trois, a été observée dans 59% des ovocytes. Un petit pourcentage a repris la méiose atteignant la métaphe à un stade, ou dégénérescence.
Ces résultats démontrent que la culture de L-IVCO soutient la viabilité d’ovocyte, tout en empêchant la reprise méiotique pendant cinq jours. À la fin du long IVCO, les COC peuvent être utilisés dans les procédures en aval de la production in vitro d’embryons, à savoir la maturation in vitro, la fécondation et la culture embryonnaire. Ces étapes sont nécessaires pour fournir la preuve de concept que l’ovocyte ont acquis une compétence de développement plus élevée.
En plus de détenir le potentiel d’augmenter la quantité d’ovocytes fertilisables, le long système de culture IVCO est un outil pour les scientifiques qui sont intéressés à disséquer les processus cellulaires et moléculaires qui régulent la formation d’un gamete compétent.
