The work was supported by grants from the Universit&#233; catholique de Louvain (Action de recherch&#233; concert&#233;es) and the Fund for Scientific Medical Research (F.R.S.-FNRS, Belgium). A.-S.D. is a doctoral fellow from T&#233;l&#233;vie, A.-C.H. held a fellowship from the Fonds pour la formation &#224; la Recherche dans l'Industrie et dans l'Agriculture (Belgium), M.V. is supported by the de Duve Institute and C.E.P. is a senior research associate of the F.R.S.-FNRS (Belgium).

Les souris ont été soulevées et traitées selon les principes de protection des animaux de laboratoire du Comité de protection des animaux de l&#39;Université. Toutes les procédures et protocoles ont été approuvés par le Comité. 1. Revêtement de microscopie en plastique Culture Chambers REMARQUE: Effectuer toutes les étapes suivantes dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire. Les deux types de revêtement sont fonctionnellement équivalents. <ol><li> Manteau plastique chambres de culture avec de la fibronectine un jour avant l&#39;isolement des tissus de la thyroïde: <ol><li> Diluer la fibronectine stérile à une concentration finale de 50 pg / ml dans du milieu M199 supplémenté avec 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 0,25 pg / ml de fungizone et 12 2 mM de glutamine. </li><li> Couvrir les puits avec 200 ul de fibronectine dilué et incuber pendant une nuit dans un réfrigérateur à 4 C °. </li><li> Le jour de la dissection, la fibronectine aspirer, rincer les puits une fois avec M199 et ajouter un volume minimum de 200 pi de M199 supplémenté avec des antibiotiques, de la glutamine et 10% de sérum de veau foetal. </li><li> Laissez les chambres revêtues dans l&#39;incubateur jusqu&#39;à ce que prêt à plaquer les explants. </li></ol></li><li> Manteau de plastique avec des chambres de culture collagène de type I de 2 heures avant l&#39;isolement des tissus de la thyroïde: <ol><li> Diluer le type collagène stérile à une concentration finale de 50 pg / ml dans du HCl 10 mM. NOTE: Gardez collagène solution stock sur la glace. </li><li> Couvrir les puits avec 200 pi de Type dilué collagène et incuber pendant 2 heures à température ambiante (RT). </li><li> Aspirer la solution de collagène de type I, rincer les puits une fois avec M199 et ajouter un volume minimum de 200 pi de M199 supplémenté avec des antibiotiques, de la glutamine et 10% de sérum de veau foetal. </li><li> Laissez les chambres revêtues dans l&#39;incubateur jusqu&#39;à ce que prêt à plaquer les explants. </li></ol></li></ol> 2. Dissection de la thyroïde Anlagen contenant des tissus (E12.5) ou de la thyroïde lobes (E13.5-e14.5) REMARQUE: Utiliser des outils de dissection et des assiettes propres Petri / culture. Les étapes générales et des incisions décrites ci-dessous sont les mêmes pour E12.5 et E14.5 embryons. <ol><li> Sacrifier les souris femelles expiré enceinte à l&#39;embryon désiré (e) d&#39;une journée (à partir de E12.5 E14.5 à) et enlever l&#39;utérus à l&#39;aide d&#39;instruments de dissection. </li><li> Placez l&#39;utérus disséqué dans une plaque de 10 cm contenant HBSS. </li><li> Tenir une extrémité de l&#39;utérus avec une pince et ouvrir l&#39;utérus avec de petits ciseaux pour libérer progressivement tous les embryons. </li><li> Séparez les embryons du placenta avec des ciseaux et de transférer les embryons avec leurs membranes extra-embryonnaires dans une nouvelle plaque de 10 cm contenant HBSS. </li><li> Retirer le sac jaune et l&#39;amnios. NOTE: De ce point, travailler sous une loupe binoculaire avec transillumination par le bas; augmentant le grossissement avec des étapes de dissection. Utiliser des aiguilles de tungstène dans les capillaires de verre comme des outils de dissection. </li><li> En utilisant les aiguilles commeun couteau et une fourchette, retirer la partie supérieure de la tête, y compris la mâchoire supérieure et les oreilles (figure 1A, couper le long d&#39;une). </li><li> Maintenez l&#39;embryon sur le dos et retirez d&#39;abord une pièce supplémentaire du tube neural (figure 1A, couper le long de b), puis la partie inférieure de l&#39;embryon, juste sous les membres antérieurs et au-dessus du coeur (figure 1B). </li><li> Transférer la tranche d&#39;embryon contenant la langue (pour orienter le tissu) et la région du cou dans une nouvelle plaque de 10 cm contenant HBSS. </li><li> Retirez le tube neural et les tissus postérieurs à l&#39;oesophage / trachée (figure 1C, couper le long d&#39;une). </li><li> Doucement la section tranche de tissu le long des deux côtés de la langue (figure 1C, couper le long de b et b &#39;). </li><li> Localiser l&#39;oesophage et de la trachée, dans le prolongement de la langue, et disséquer la langue, laissant le aryténoïde gonflement (figure 1D, couper le long d&#39;une), et le tissu sur both côtés de l&#39;œsophage / trachée (figure 1D, couper le long de b et b &#39;). </li><li> Retirer l&#39;œsophage, la trachée et les placer avec sa face ventrale vers le haut. </li><li> Disséquer les tissus non désirés tels que le thymus (Figure 1E) et tous les tissus situés latéralement par rapport aux artères des arcs branchiaux. Pour E13.5 ou des embryons E14.5, visualiser les lobes de la glande thyroïde de chaque côté de la trachée (figure 1F; lignes pointillées de rouge) et disséquer en outre les lobes de la trachée. </li><li> Transférer la région de la trachée isolée E12.5, ou les lobes de la glande thyroïde E13.5-E14.5 dans une plaque de culture de 35 mm contenant du milieu M199 préchauffé additionné d&#39;antibiotiques, de la glutamine et 10% de sérum de veau foetal. Transfert explants en utilisant une pointe de filtre préalablement mouillée sur une micropipette P-200. Pour explants de E12.5, couper l&#39;extrémité de la pointe pour élargir l&#39;ouverture. NOTE: En routine, et si les embryons ont le même génotype, effectuez les étapes 6 et 7 sur tous les embryons, lan 9-11, et enfin 12 et 13. </li></ol> 3. Placage et de la Culture de la thyroïde explants <ol><li> Laver les explants par transferts successifs dans trois puits d&#39;une plaque à 24 puits contenant 1 ml de milieu de culture préchauffé (= M199 supplémenté avec des antibiotiques, de la glutamine et 10% de sérum de veau foetal). </li><li> Placage de lobes thyroïdiens sur enrobés microscopie chambres de culture en plastique: <ol><li> Aspirer le milieu de culture M199 à partir des chambres revêtues. </li><li> Soigneusement, transférer les explants de la thyroïde dans les chambres de culture à l&#39;aide d&#39;une micropipette et pointes à filtre. Placez une explantation dans le centre de chaque chambre. </li><li> Retirer l&#39;excès de milieu et placer la chambre de culture dans un incubateur de culture tissulaire (37 ° C, 5% CO 2) pendant 2 heures pour laisser les explants attachent à la matrice. </li><li> Ajouter lentement de 200 à 300 ul de milieu de culture préchauffé à chaque puits. </li><li> Incuber la culture à long terme dans l&#39;incubateur de culture tissulaire. </li></ol></li><li> Plaquage orégion de la trachée de f ou de la thyroïde lobes sur les filtres semi-poreux: <ol><li> Remplissez le nombre de puits d&#39;une plaque de 24 puits avec 330 pi nécessaire de milieu de culture préchauffé. </li><li> filtres de place (par exemple 0,4 um filtre Millipore) sur le support, en prenant soin d&#39;éviter le piégeage de bulles d&#39;air au-dessous du filtre de la culture. </li><li> Soigneusement, en utilisant une micropipette et pointes à filtre, transférer les explants de la thyroïde avec un volume minimal de support sur le centre des filtres (de 4/filter maximum). </li><li> Éliminer l&#39;excès de fluide et de l&#39;espace sur les explants avec une aiguille de tungstène. </li><li> Incuber la culture à long terme dans l&#39;incubateur de culture tissulaire. REMARQUE: les changements du milieu de culture tous les deux jours sous la hotte à flux laminaire. Culture des explants jusqu&#39;à 7 jours. </li></ol></li></ol> 4. Tout le montage immunofluorescence protocole de coloration pour la thyroïde explants Déloger explants cultivés sur des filtres (après l&#39;étape 2 ci-dessous) à l&#39;aide d&#39;aiguilles ou de tungstènepinces fines et transfert dans une plaque de 24 puits pour toutes les étapes, sauf pour le primaire (étape 5) et secondaire (étape 7) incubations d&#39;anticorps (plaque 96 puits). Pour explants adhérentes en culture sur des chambres de plastique de microscopie, effectuer toutes les étapes dans les chambres de culture. <ol><li> Aspirer M199 milieu de culture et fixer l&#39;expiant avec glacée paraformaldéhyde 4% (PFA) pour 20 min (500 pi dans un plat de 24 puits et 300 pi dans des lames de microscopie). </li><li> Laver 2x 10 min dans une solution saline tamponnée de Tris avec du Triton (TBST, 50 mM Tris HCl pH 7,5, 150 mM de NaCl, 0,1% de Triton X-100) à la température ambiante. </li><li> Traiter les explants immédiatement ou conserver à -20 ° C. NOTE: Pour le stockage à long terme à -20 ° C, déshydrater les explants dans du methanol, en augmentant progressivement la concentration de methanol dans du TBST pour atteindre 100% de methanol. Lorsque vous êtes prêt à continuer avec l&#39;immunomarquage (étape 4), réhydrater les explants en ajoutant progressivement TBST au méthanol. </li><li> Remplacer TBST avec la solution de blocage (10% de sérum de chèvre normal dans du TBST) Et incuber sur une bascule mer-scie pendant 30-60 min à température ambiante. </li><li> Diluer l&#39;anticorps primaire dans la solution de blocage (100-200 pi par l&#39;état). Transférer les explants de «filtre» à partir d&#39;une plaque de 24 puits à une plaque de 96 puits. Incuber les explants avec des anticorps primaires sur une bascule mer en dents de scie durant la nuit à 4 ° C. </li><li> Le lendemain, jeter la solution d&#39;anticorps primaire, transférer les explants de &quot;filtre&quot; de retour dans une plaque de 24 puits et laver au moins cinq fois avec TBST sur une bascule mer-scie pendant 45-60 min chacun à température ambiante. </li><li> Diluer l&#39;anticorps secondaire (par exemple de chèvre anti-X-Alexa Fluor à 1:2000 dilution) dans du TBST contenant 1% de sérum de chèvre normal et incuber les explants avec cette dilution pendant une nuit sur ​​une bascule de mer scie à 4 ° C et dans l&#39;obscurité. Pour contre-coloration nucléaire, inclure une ug / ml de bis-benzimide (Hoechst) conjointement avec la solution d&#39;anticorps secondaire. </li><li> Le lendemain, jeter la solution d&#39;anticorps secondaire et laver 5x avec TBST sur une mer-scierocker pendant 45-60 min chacun à température ambiante. Au cours des lavages, garder les explants dans l&#39;obscurité. </li><li> Effectuer un lavage supplémentaire dans TBST remuant doucement pendant une nuit à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Postfix Les explants immunocolorées dans 4% PFA à 4 ° C pendant 10 min. </li><li> Laver 2x 10 min avec du TBST. </li><li> Transférer les explants soit progressivement dans le methanol à 100% pour le stockage à long terme à -20 ° C, ou à analyser immédiatement. Pour explants cultivés sur les filtres, et immunocolorées dans une plaque de 24 puits, transfert dans une chambre de microscopie (par exemple LabTek ou Ibidi) avec TBST ou mieux un milieu de montage fluorescent avant l&#39;analyse avec un multiphotonique ou microscope confocal. </li></ol> 5. Extraction d&#39;ARN à partir de la thyroïde Travailler dans un environnement exempt de RNase. Par conséquent, utiliser de l&#39;acide nucléique et la nucléase libre embouts de pipette et nettoyer les deux banc et de l&#39;équipement de contaminants et RNases. Ce protocole est basé sur un mélange phénol / chloroforme, effectuer la première étapes (1 à 7) sous une hotte chimique. <ol><li> Homogénéiser un explant de la thyroïde ou deux lobes de la glande thyroïde avec 300 ul de solution d&#39;extraction d&#39;ARN à l&#39;aide d&#39;un pilon jetable pour 1,5 ml tube. Entre échantillons, laver le pilon dans 2% de SDS, puis de l&#39;eau, puis de l&#39;éthanol. </li><li> Ajouter 100 ul de solution d&#39;extraction d&#39;ARN, vortex 10 sec et incuber à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Vortex pendant 30 secondes et ajouter 20 ng d&#39;ARNt pour chaque échantillon. </li><li> Vortex pendant 1 min et ajouter 80 ul de chloroforme. </li><li> Vortex vigoureusement pendant 30 secondes et incuber 15 min à température ambiante. </li><li> Spin pendant 15 min à 19 000 xg dans un (4 ° C) centrifugeuse réfrigérée. </li><li> Transférer soigneusement la phase aqueuse supérieure incolore dans un nouveau tube contenant 20 pg de glycogène coprécipitant. </li><li> Vortex et ajouter 200 ul d&#39;alcool à 100% de l&#39;isopropanol. </li><li> Vortex vigoureusement pendant 15-30 secondes et laisser ARN précipité à -20 ° C pendant 2-3 heures ou à -80 ° C pendant 1 heure. </li><li> Spin pendant 30 min à 19 000xg à 4 ° C, et éliminer le surnageant. </li><li> Laver le culot avec 450 pi de froid de 75% d&#39;éthanol et vortex pour déloger le culot. </li><li> Spin pendant 10 min à 19 000 xg à 4 ° C, et éliminer le surnageant. </li><li> Sécher le culot sous le capot pendant 5 min. </li><li> Reprendre le culot avec 10 ul d&#39;eau exempte de RNase et incuber 10 min à température ambiante. </li><li> Essai concentration d&#39;ARN, conserver à -80 ° C ou transcription inverse de l&#39;analyse de l&#39;expression des gènes. </li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

Ce document décrit une méthode pour disséquer et de culture des explants de la thyroïde (E12.5) ou lobes (E14.5) afin d&#39;étudier et de mieux comprendre les événements complexes conduisant à la formation de la thyroïde. En raison de la double origine de la ébauches de la thyroïde (le bourgeon de la ligne médiane et les deux corps ultimo-latérales), et leur petite taille, un fragment de tissu de E12.5 rostrale localisée aux artères du pharynx arc, et contenant la trachée, mais pas l&#39;œsophage est mi...

La glande thyroïde est une collection de sphères épithéliales indépendants, appelés follicules, entouré par un réseau dense de capillaires endothéliales. Cette organisation permet la fonction thyroïdienne: capillaires endothéliales fournissent thyrocytes avec de l&#39;iode, nécessaires à la synthèse des hormones T3 et T4, et de distribuer ces derniers à l&#39;ensemble du corps. Dispersés entre les follicules capillaires et, C-cellules produisent l&#39;hormone calcitonine hypocalcémique 1. Bien que l&#39;architecture et les fonctions de la thyroïde adulte sont bien connus, les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement embryonnaire de la thyroïde (formation du follicule et la différenciation) sont loin d&#39;être compris. Au cours de l&#39;embryogenèse, les thyrocytes progéniteur origine comme un épaississement (l&#39;ébauche de la ligne médiane) de la paroi ventrale de l&#39;endoderme de l&#39;intestin antérieur au jour embryonnaire (e) de 8,5 dans l&#39;embryon de souris, tandis que les cellules C progéniteurs sont créés à E11.5 sous forme de saillies en forme de goutte d&#39;eau ( le bo ultimobranchialematrices) de la quatrième poches pharyngées 2-6. Le bourgeon de la ligne médiane se détache alors de l&#39;endoderme, élargit bilatéral de fusionner à E13.5 avec les organismes ultimobranchiaux de chaque côté de la trachée. Enfin, thyrocytes organisent dans les follicules et C-cellules se différencient. Les connaissances actuelles sur la formation de la thyroïde provient principalement de l&#39;analyse histologique des tissus fixés, mais les événements morphogénétiques impliqués dans la formation de la thyroïde sont très dynamique et impliquer les communications et les interactions entre les différents types de cellules et avec la matrice extracellulaire. Des travaux récents ont montré que les progéniteurs de thyrocyte produisent des niveaux élevés de VEGF pour recruter des cellules endothéliales de la thyroïde en développement, et, à son tour, recrutent les cellules endothéliales favorisent la formation de follicules et de la différenciation des cellules C 7. La plupart des études ex vivo sur la thyroïde ont été effectués sur des cellules de la thyroïde dérivé adultes isolés, cultivés soit sur ​​culture de tissus 2D plastique dparoisses ou dans des matrices 3D. L&#39;utilisation de ces types de cultures, les cellules folliculaires différenciées soit rester polarisé et organisées en follicules ou réacquérir une organisation 3D 8-10. Cependant, ces cellules épithéliales purs, explantées à partir de leur environnement physiologique, et cultivées en 2D, ne tiennent pas compte des interactions avec la matrice extracellulaire, les cytokines, les facteurs de croissance et d&#39;autres types cellulaires tels que les cellules endotheliales ou les nerfs qu&#39;ils rencontrent normalement in vivo. Une étude très agréable a récemment décrit un protocole de différenciation des cellules ES en utilisant des follicules thyroïdiens une étape finale de la culture en 3D matrigel 11. Cependant, ces cultures 3D manquent de contact avec d&#39;autres types cellulaires. Sur la base de l&#39;expertise précédente sur le pancréas et les glandes salivaires culture d&#39;organes 12 à 14, un procédé pour la dissection de souris embryonnaire thyroïde anlagen et mise en culture des explants sur les filtres semi-poreuses ou sur des lames de microscope en plastique a été développé. Quandtravailler avec des embryons E12.5, la double origine de la anlagen de la thyroïde (ébauche de la ligne médiane et les deux organes latéraux ultimobranchiaux) a imposé la microdissection d&#39;un grand fragment de tissu. Celui-ci contenait la trachée, mais pas l&#39;œsophage, et s&#39;étendait des artères du pharynx arc jusqu&#39;à l&#39;enflure aryténoïde. Lorsqu&#39;elle est cultivée sur les filtres, l&#39;ébauche de la ligne médiane s&#39;étend latéralement de chaque côté de la trachée, où ils fusionnent avec les organes ultimobranchiaux pour former les deux lobes de la glande thyroïde, toujours reliés par un isthme. En culture, les cellules épithéliales prolifèrent, organisent dans les follicules et se différencient en thyrocytes et les cellules C, en fonction de leur origine. Les cellules endothéliales contenues dans le tissu microdisséquée prolifèrent et envahissent les lobes de la glande thyroïde pour enfin associer étroitement à la structure épithéliale folliculaire, indépendamment de la circulation sanguine ou des facteurs circulants également. Comme le développement des explants récapitule fidèlement in vivo développerment, ce système de culture est optimale pour étudier les événements morphogénétiques et de différenciation qui se produisent au cours du développement de la glande thyroïde. tissus de la thyroïde peuvent être obtenus auprès de type sauvage, KO ou embryons transgéniques fluorescents, et le système de culture est prête à perte et expériences de gain de fonction. Enfin, imagerie time-lapse d&#39;explants de la thyroïde marqués par fluorescence sur des plats en plastique de microscopie pourrait être exploitée afin de mieux étudier la cinétique et la continuité des mouvements morphogénétiques qui se produisent in vivo. Imagerie time-lapse a déjà été utilisée pour étudier la morphogenèse de ramification du pancréas 15,16 ou le bourgeon urétéral 17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="698">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">&#181;-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile</td>
			<td style="width:85px;">proxylab</td>
			<td style="width:119px;">80826</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen Type I, rat tail</td>
			<td style="width:85px;">Millipore</td>
			<td>08-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td># 33010-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">M199</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>31150-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">HBSS</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>14025-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Tungsten wire</td>
			<td style="width:85px;">Goodfellow</td>
			<td style="width:119px;">LS237450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">culture plate insert (12 mm diameter)</td>
			<td style="width:85px;">Millipore</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">GlycoBlue</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">E-cadherin</td>
			<td style="width:85px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">610182</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">Ezrin</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MS-661-P1</td>
			<td>1/400</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">PECAM</td>
			<td style="width:85px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">550274</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Hoechst</td>
			<td style="width:85px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo culture system to study thyroid development

La thyroïde est une glande endocrine bilobated localisée à la base du cou, la production des hormones thyroïdiennes T3, T4, et la calcitonine. T3 et T4 sont produites par des thyrocytes différenciés, organisés en sphères fermées appelées follicules, tandis que la calcitonine est synthétisée par les cellules C, intercalés entre les follicules et un réseau dense de capillaires sanguins. Bien que l&#39;architecture et les fonctions de la thyroïde adultes ont été abondamment décrits et étudiés, la formation des unités de &quot;angio-folliculaires&quot;, la répartition des cellules C dans le parenchyme et les communications paracrines entre les cellules epitheliales et endotheliales est loin d&#39;être compris. Cette méthode décrit les étapes successives de la souris thyroïde embryonnaire ébauches dissection et de sa culture sur des filtres semi-poreuses ou sur des lames de microscopie en plastique. Dans un délai de quatre jours de ce système de culture récapitule fidèlement dans le développement de la thyroïde vivo. En effet, (i) milliardsobation de l&#39;organe se produit (pour les explants de E12.5), (ii) les précurseurs thyrocytes organiser dans les follicules et polarisent, (iii) thyrocytes et C-cellules se différencient, et (iv) les cellules endothéliales présentes dans le tissu microdisséquée prolifèrent, migrent dans l&#39; lobes de la glande thyroïde, et associer étroitement avec les cellules épithéliales, comme ils le font in vivo. tissus de la thyroïde peuvent être obtenus auprès de type sauvage, KO ou embryons transgéniques fluorescents. En outre, des explants de la culture peut être manipulé par l&#39;addition d&#39;inhibiteurs, des anticorps bloquants, des facteurs de croissance, ou même des cellules ou du milieu conditionné. Développement ex vivo peut être analysée en temps réel, ou à n&#39;importe quel moment de la culture par immunocoloration et RT-qPCR. En conclusion, la culture de la thyroïde des explants combiné avec l&#39;aval l&#39;ensemble du montage ou sur des sections d&#39;imagerie et de profil d&#39;expression génique offre un système puissant pour manipuler et étudier morphogénétiques et de différenciation des événements de la thyroïde organogenesis.

anlages de la thyroïde (de la ligne médiane et UB, avec les tissus environnants), et des lobes de la glande thyroïde sont disséqués à partir d&#39;embryons de souris à E12.5 et e13.5/e14.5, respectivement (figure 1). Au bout d&#39;une journée dans la culture sur filtre, l&#39;ébauche de la ligne médiane est visible (Figure 2A) en tant que tissu allongé s&#39;étendant au-dessus de la trachée. Il se forme progressivement deux lobes de chaque côté de la trachée. Si lobes th...

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An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Système de culture à étudier la thyroïde développement

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

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An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The Endocrine System

SCIENTISTS IN ACTION

11.4K vues.  Université catholique de Louvain & de Duve Institute. This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Vidéo: An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Méthode pour la culture d&#39;embryons de poulet Early ex vivo (Nouvelle Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

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Biologie

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Une Ex-ovo- Poulet embryonnaire du système de culture approprié pour les applications d&#39;imagerie et de microchirurgie

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice. HYPERStack vessels allow closed system scale up from the current stacked plate products and delivers >2.5X more cells in the same volumetric footprint. The HYPERStack vessels function via gas permeable material which allows gas exchange to occur, therefore eliminating the need for internal headspace within a vessel. The elimination of headspace allows the compartment where cell growth occurs to be minimized to reduce space, allowing more layers of cell growth surface area within the same volumetric footprint.
For many applications such as cell therapy or vaccine production, a closed system is required for cell growth and harvesting. The HYPERStack vessel allows cell and reagent addition and removal via tubing from media bags or other methods.
This protocol will explain the technology behind the gas permeable material used in the HYPERStack vessels, gas diffusion results to meet the metabolic needs of cells, closed system cell growth protocols, and various harvesting methods.

An Introduction into the technology, protocol and handling of the Corning HYPERStack Vessels and accessories used for high yield adherent cell culture. The protocol will show how to use the closed system vessels for increasing cell harvesting over current stacked plate products.

Fermé protocole Culture Cell System utilisant des navires HyperStack avec la technologie des matériaux perméables au gaz

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and uterine carcinomas, where death rates have fallen in recent years, ovarian cancer cure rates have remained relatively unchanged over the past two decades 1. This is largely due to the lack of appropriate screening tools for detection of early stage disease where surgery and chemotherapy are most effective 2, 3. As a result, most patients present with advanced stage disease and diffuse abdominal involvement. This is further complicated by the fact that ovarian cancer is a heterogeneous disease with multiple histologic subtypes 4, 5. Serous ovarian carcinoma (SOC) is the most common and aggressive subtype and the form most often associated with mutations in the BRCA genes. Current experimental models in this field involve the use of cancer cell lines and mouse models to better understand the initiating genetic events and pathogenesis of disease 6, 7. Recently, the fallopian tube has emerged as a novel site for the origin of SOC, with the fallopian tube (FT) secretory epithelial cell (FTSEC) as the proposed cell of origin 8, 9. There are currently no cell lines or culture systems available to study the FT epithelium or the FTSEC. Here we describe a novel ex vivo culture system where primary human FT epithelial cells are cultured in a manner that preserves their architecture, polarity, immunophenotype, and response to physiologic and genotoxic stressors. This ex vivo model provides a useful tool for the study of SOC, allowing a better understanding of how tumors can arise from this tissue, and the mechanisms involved in tumor initiation and progression.

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

The fallopian tube (FT) is emerging as an alternative site of origin for serous ovarian carcinoma (SOC). This protocol describes a novel method for the isolation and ex vivo culture of fallopian tube epithelial cells. This system recapitulates the in vivo epithelium and allows the study of SOC pathogenesis.

Culture ex vivo des cellules humaines primaires épithéliales des trompes de Fallope

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Un système d&#39;<em&gt; Ex vivo</emLa culture&gt; de pancréas embryonnaire

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Méthode de la culture pour le embryonnaire Souris Coeur

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Souris développement embryonnaire dans tout un système de culture d&#39;embryons sans sérum

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Souris foetal entier Intestin Système de culture pour<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Manipulation des voies de signalisation et d&#39;imagerie en direct en trois dimensions du développement des villosités

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Développement d&#39;un système d&#39;insertion Co-culture de deux types cellulaires en l&#39;absence de Cell-Cell Contactez

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Mise en place d’un pH extracellulaire acide système de Culture

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...