Notre protocole décrit comment assembler et caractériser électriquement une biomembrane dopée au peptide qui imite étroitement la composition, la structure et les propriétés de transport des synapses biologiques et qui présente une résistance à la mémoire tunable. Cette technique permet aux utilisateurs d’évaluer la dépendance à l’activité, la résistance à la mémoire et la plasticité à court terme dans les systèmes conçus à des échelles de temps et des niveaux d’excitation pertinents pour les synapses biologiques et les canaux irionaux. Cette technique fournit un cadre pour caractériser les membranes biomimétiques contenant des canaux irionaux activés par tension, ce qui le rend applicable à la caractérisation d’une variété de processus de transport cellulaire, y compris ceux dans les neurones.
Notre suggestion aux nouveaux chercheurs est d’abord de devenir compétent dans la préparation de solutions liposome et l’assemblage d’une bicouche d’interface gouttelette sur les électrodes de type fil. Voir de première main le processus de distribution et de positionnement des gouttelettes sur les électrodes simplifie cette technique de formation de cales, la rendant immédiatement accessible à tous. Le Dr Joseph Najem, postdoc de mon laboratoire, démontrera cette procédure.
Pour commencer, préparez la solution de stock d’alaméthhicine dans le tube de microcentrifugeuse en dissolvant la poudre de peptides d’alaméthhicine dans l’éthanol à une concentration finale de 2,5 milligrammes par millilitre. Vortex le tube brièvement pour bien mélanger, et stocker la solution de stock dans un congélateur moins 20 degrés Celsius. Dans un tube Safe-Lock de 1,5 millilitre, ajouter un microlitre de solution de stock d’alaméthhicine à 99 microlitres de la solution A pour atteindre une concentration finale d’alaméthhicine de 13 micromolaires dans la suspension liposome.
Vortex pour bien mélanger. La solution liposome peptidique qui en résulte est la solution B.Mix 117 microlitres de la solution A avec 10 microlitres de solution B pour atteindre une concentration finale d’alaméthhicine d’un micromolaire, puis vortex pour bien mélanger. Reportez-vous à la solution qui en résulte sous le nom de C.Store, les solutions B et C à quatre degrés Celsius.
Placez un millimètre d’épaisseur 25 fois 75 millimètres côté verre sur le stade d’un microscope inversé. Distribuez quelques gouttes d’huile d’hexadéconane au centre de la glissière de verre, puis placez le réservoir d’huile directement sur l’huile sur la glissière de verre. Remplissez complètement le réservoir d’huile d’huile d’hexadécane.
Assurez-vous que le réservoir est placé au-dessus de la lentille objective. Branchez ensuite le support d’électrode à l’étage principal d’un amplificateur actuel monté sur un micromanipulateur. Le micromanipulateur minimise la longueur des électrodes et le bruit électrique.
Ensuite, montez le support en verre de micropipette avec le deuxième fil argent-argent-chlorure sur un autre micromanipulateur. À l’aide des micromanipulateurs, placez les électrodes de telle sorte que les extrémités recouvertes d’agarose des fils argent-argent-chlorure soient complètement immergées dans le réservoir d’huile à un plan vertical similaire. Alignez les deux électrodes et séparez-les de quelques millimètres.
Pour former la bicouche lipidique, déplacez les électrodes verticalement dans la phase d’huile. Utilisez la micropipette pour déposer 200 nanolitres de solution lipidique A sur chacun des fils. Attendez de trois à cinq minutes pour permettre l’assemblage spontané de monomouche lipidique à l’interface de l’huile d’eau.
Les gouttelettes peuvent s’affaisser si l’huile environnante est suffisamment moins dense. Après cela, abaissez les électrodes pour les reimmerger jusqu’à ce que les extrémités des deux électrodes touchent à peine le fond du réservoir d’huile. Ensuite, pour former la bicouche, déplacez les électrodes horizontalement pour mettre les gouttelettes en contact.
Pour obtenir la relation pincée, hystérique et de tension actuelle, utilisez un générateur de fonction pour appliquer la forme d’onde triangulaire ou sinusoïdienne de tension à une membrane lipidique sans alaméthicine assemblée avec des gouttelettes de solution A.Enregistrez la réponse actuelle induite à travers plusieurs fréquences. Pour enregistrer la taille de la bicouche lipidique interfaciale, mesurer le diamètre de la membrane lipidique sur ordinateur ou enregistrer l’amplitude de courant de pointe à pointe résultant de l’onde triangulaire de 10 hertz, 10 millivolts pour calculer la zone de la membrane. Retirez les fils de la phase d’huile pour enlever les gouttelettes qui ne contiennent pas d’alaméthhicine.
Ajouter de nouvelles gouttelettes aqueuses à l’aide de la solution C et former une bicouche lipidique. Basé sur l’amplitude du courant d’onde carrée, utilisez les micromanipulateurs pour ajuster le contact entre les gouttelettes, de sorte que la bicouche a une zone similaire à celle formée précédemment. Appliquez ensuite une forme d’onde de tension de 10 hertz et de 10 millivolts, et enregistrez la réponse actuelle induite comme précédemment.
Pour mener des expériences d’impulsion à l’aide d’un logiciel de programmation personnalisé et d’une source de tension analogique, générer des impulsions de tension avec des amplitudes élevées et basses spécifiques à temps et hors temps. Enregistrez le courant en réponse aux impulsions appliquées. L’intrigue du courant par rapport à la tension montre la réponse de courant non-zéro lors de l’application d’un biais de tension à une bicouche lipidique sans alaméthhicine.
Ajouter 0,017 hertz, une fréquence où l’impédance est dominée par la résistance membranaire. Une réponse de courant ohmic bas est montrée pour la membrane fortement isolante. L’intrigue d’une bicouche lipidique formée entre deux gouttelettes contenant des peptides d’alaméthhicine montre des courants augmentant exponentiellement à des tensions supérieures au seuil d’insertion de 100 millivolts.
À haute tension, les peptides d’alaméthhicine résidant à la surface de la caleuse lipidique s’insèrent dans la membrane et s’agrègent pour former des pores conductrices. Les réponses symétriques actuelles aux deux polarités sont dues à l’insertion et à l’agrégation de populations distinctes de peptides des côtés opposés de la membrane. Le courant capacitif doit être soustrait du courant total pour obtenir seulement la réponse memristive et pincée d’hystérie de tension de courant.
La réponse biomoléculaire de memristor aux impulsions suivantes de tension avec une augmentation de conductance pendant le temps, en dépit de reconstituer par intermittence un état isolant pendant chaque temps libre. Le stimulus actuel et les stimuli antérieurs contribuent à l’augmentation actuelle. Des monomères cohésifs sur les deux gouttelettes doivent se former avant de les réunir pour former la bicouche.
Si les gouttelettes sont réunies trop tôt, elles se fondent et aucune bicouche n’est formée. Nous concevons et fabriquons maintenant des réseaux neuronaux de base microfluidiques composés de neurones à l’état solide reliés par des synapses membranaires soutenues par l’optimisation de l’assimilation réseau des superordinateurs haute performance d’ORNL. Ces memristors sont les premiers à avoir la composition, la structure, le mécanisme de commutation, et le transport d’ion des synapses biologiques.
Ils fournissent ainsi une base biomoléculaire meublée en ajoutant l’informatique et la mémoire cérébrales.
