Ce protocole décrit la préparation des échantillons et la réduction des données nécessaires à la réussite des études d’écho de spin neutronique des fluctuations membranaires collectives pertinentes pour les fonctions biologiques et les applications pratiques des membranes lipidiques. NSE accède directement à la dynamique membranaire sur les échelles de temps nanosecondes des fonctions membranaires clés avec l’avantage unique de la sensibilité isotopique pour sonder les caractéristiques sélectives de la membrane inaccessibles avec d’autres techniques. Les études de la dynamique membranaire à l’échelle nanométrique sont essentielles pour comprendre les propriétés membranaires sous-jacentes du mécanisme moléculaire et les interactions membrane-protéine impliquées dans diverses pathologies cellulaires.
La méthode fournit aux chercheurs qui débutent dans la NSE des lignes directrices détaillées sur la conception, la préparation et la caractérisation des vésicules lipidiques pour des expériences réussies et l’analyse et l’interprétation ultérieures de la réduction des données. Teshani Kumarage et Julie Nguyen, une étudiante diplômée et une étudiante de premier cycle du laboratoire, feront la démonstration de la procédure. En travaillant à l’intérieur d’une hotte, préparez la suspension lipidique en dissolvant les lipides pesés avec précision dans un millilitre de solvant avec un mélange manuel.
Sécher la solution lipidique en versant doucement un gaz inerte dans le flacon tout en le faisant tourner lentement à un angle. Pour bien éliminer le solvant résiduel, placez les flacons pendant la nuit dans un four à vide à 35 degrés Celsius. Le lendemain, hydratez le film lipidique avec deux millilitres d’eau lourde pour obtenir une concentration lipidique de 50 milligrammes par millilitre et vortex la suspension lipidique hydratée jusqu’à ce que le film lipidique soit complètement dissous.
Ensuite, effectuez cinq cycles de congélation-décongélation en stockant le flacon de suspension lipidique hydratée à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit congelé. Et puis en le transférant dans un bain-marie à 35 degrés Celsius pour décongeler la suspension lipidique. Vortex la suspension décongelée jusqu’à ce qu’elle soit homogène avant de passer au cycle suivant.
Avant de commencer l’expérience, assemblez la configuration de l’extrudeuse à l’aide d’une membrane en poly-bicarbonate entre deux supports de membrane et ajoutez deux filtres en papier de chaque côté pour fournir un soutien supplémentaire. Utilisez des seringues en verre hermétiques pour hydrater la membrane en polycarbonate en faisant passer plusieurs fois 0,3 millilitre d’eau lourde à travers l’assemblage de la membrane. Après avoir hydraté la membrane, insérez une seringue étanche aux gaz d’un millilitre avec une solution lipidique de couleur blanche laiteuse préparée dans une extrémité et une seringue vide dans l’extrémité opposée de l’appareil d’extrusion.
Une fois les seringues connectées, placez l’assemblage dans le bloc d’extrusion. Programmez la pompe en maintenant enfoncé le bouton Taux pour entrer le taux d’extrusion et appuyez sur le bouton Diamètre pour entrer le diamètre de la seringue. Ensuite, appuyez sur Retirer jusqu’à ce que le voyant s’allume.
Appuyez sur Démarrer et attendez que l’échantillon commence à être distribué dans la seringue vide. Appuyez sur le bouton Arrêter juste avant que la seringue d’échantillon ne soit complètement vide. Enregistrez le volume distribué, puis maintenez le bouton Taux enfoncé jusqu’à ce que la première phase apparaisse à l’écran.
En maintenant le voyant De retrait éteint, appuyez sur le bouton de volume pour entrer le volume distribué enregistré précédemment. Appuyez à nouveau sur le bouton Taux et utilisez la flèche la plus à droite vers le haut pour accéder à la phase deux. Appuyez sur volume pour entrer la même valeur que le volume distribué enregistré précédemment.
Dans cette phase, appuyez sur le bouton Retirer jusqu’à ce que le voyant Retirer soit allumé. Répétez le cycle de la phase trois en appuyant sur le bouton de volume jusqu’à ce que LP:SE apparaisse à l’écran et réglez-le sur 20. Enfin, appuyez sur le bouton Taux, accédez à la phase quatre et appuyez sur le bouton de volume pour accéder à la fonction Arrêter et terminer la configuration de la pompe.
Une fois la pompe programmée, appuyez sur Démarrer pour commencer le cycle d’extrusion. Effectuez 15 à 20 cycles d’extrusion avant de collecter la suspension lipidique extrudée bleu opale transparent dans un flacon propre pour les mesures. Ouvrez le logiciel DAVE et sélectionnez Réduire les données NSE dans le menu Réduction des données.
Téléchargez les fichiers de données sur différentes valeurs Q à l’aide de l’option Ouvrir les fichiers d’écho du menu Fichier. Les fichiers téléchargés apparaîtront sous les ensembles de données disponibles. Faites un clic droit sur le fichier sélectionné et étiquetez-le en fonction de la mesure à laquelle il correspond, comme Échantillon, Cellule ou Résolution.
À l’aide de l’onglet Ensemble de données, regroupez les pixels du détecteur en 2 X 2 pour améliorer le rapport signal/bruit. Appliquez le même binning à tous les fichiers de Resolution, Cell et Sample. Inspectez les données sur tous les groupes de pixels et masquez ceux dont les signaux sont faibles en appuyant sur la touche Fin du clavier.
Appuyez sur Entrée pour accéder à une fenêtre contextuelle afin d’appliquer le même masque à vos quatre heures. Les pixels masqués deviennent verts. Assurez-vous que les données collectées se trouvent sous la forme d’un signal d’écho.
Commencez à ajuster le fichier de résolution à partir de la liste des fichiers téléchargés en cliquant avec le bouton droit de la souris sur le fichier souhaité et en sélectionnant Ajuster les opérations, Ajuster la résolution des échos dans le menu contextuel. Assurez-vous que les ajustements des signaux d’écho donnent des paramètres d’ajustement raisonnables. Pour inspecter l’erreur associée à chaque paramètre de raccord sur l’ensemble du détecteur, sélectionnez Options d’image, puis sélectionnez le paramètre d’ajustement qui vous intéresse.
Ensuite, faites un clic droit sur l’image du détecteur pour accéder à une fenêtre contextuelle affichant une carte de barre d’erreur. Si l’ajustement sur un pixel spécifique n’est pas satisfaisant, réajustez le signal sur ce pixel en le sélectionnant, en appuyant sur l’onglet Raccord, puis en appuyant sur Ajuster le pixel. Entrez de nouveaux paramètres de départ pour la phase et la période dans l’onglet Raccord.
Réduisez l’exemple de fichier en sélectionnant le fichier correspondant dans la liste des fichiers téléchargés et étiquetés. Inspectez tous les pixels et masquez les pauvres comme décrit ci-dessus. Ensuite, faites un clic droit sur le fichier et sélectionnez Ajuster les opérations, Phases d’importation.
Pour le fichier de résolution, ajustez les signaux d’écho comme décrit précédemment avec les valeurs de la période inchangées et le point de phase d’écho importé à partir de la résolution correspond. Entrez le centre de faisceau pour tous les fichiers de données en accédant à l’onglet Général et en entrant les valeurs de centre de faisceau X et Y enregistrées à partir de l’expérience. Une fois les ajustements terminés, calculez la fonction de diffusion intermédiaire normalisée en cliquant à droite sur le fichier d’échantillon souhaité dans la liste des fichiers ajustés et en sélectionnant Calculer I de Q dans le menu contextuel.
Entrez les informations requises pour la résolution et les fichiers de cellule et le nombre d’arcs Q dans la fenêtre contextuelle, puis appuyez sur OK pour afficher les résultats. Notez que les données en cyan montrent un signal médiocre en raison des effets de bord du détecteur et doivent être éliminées lors de la compilation de différents ensembles de données Q. Enfin, enregistrez les ensembles de données réduits en tant que fichiers ASCII et enregistrez la session entière en tant que projet DAVE dans le dossier souhaité.
Dans cette étude, les mesures NSE d’échantillons liposomaux préparés avec différents schémas de deutération ont été effectuées. Les mesures NSE des fluctuations de flexion de la membrane sont effectuées sur des liposomes entièrement contrastés. Ce schéma de deutération entraîne une grande différence de longueur de diffusion entre le noyau de la membrane et l’environnement fluide deutéré, améliorant considérablement le signal de diffusion des membranes liposomales et améliorant les statistiques de mesure de la dynamique de flexion.
D’autre part, les mesures NSE des fluctuations d’épaisseur de membrane des liposomes montrent des écarts par rapport au Q à la troisième dépendance des fluctuations de flexion. Pour isoler le signal de fluctuation d’épaisseur, le signal obtenu est divisé par Q au troisième et la dynamique excédentaire est ajustée à une fonction lorentzienne dans Q.Cette méthode dépend de données de bonne qualité, ce qui est plus réalisable avec des échantillons de concentrations élevées et de signaux de diffusion forts. La dynamique sondée par NSE peut être explorée en synergie par relaxométrie RMN au deutérium et simulations moléculaires-dynamiques pour illustrer comment les structures lipidiques moléculaires et les motifs d’emballage influencent les fonctions membranaires.
Les études NSE sur les membranes lipidiques apportent un nouvel éclairage sur la biophysique membranaire, les relations complexes de la structure et de la dynamique membranaires, et leur impact sur les fonctions membranaires et les interactions membrane-protéine.
