Le protocole suivant présente comment mettre en place une expérience Neutron Spin Echo pour mesurer la fonction de diffusion intermédiaire et étudier la dynamique des protéines en solution. Le principal avantage de la spectroscopie d’écho de spin neutronique est sa capacité à examiner le réarrangement des domaines et des sous-domaines protéiques sur l’échelle de temps pico à la nanoseconde; qui est la gamme de ralentis dans les protéines dans leur environnement presque naturel, et dans la solution protéique encombrée. Neutron Spin Echo est également sensible à la configuration isotopique, ce qui permet des études très spécifiques et ciblées utilisant l’appariement de contraste.
Les connaissances sur la dynamique du domaine protéique constituent une partie importante de la recherche biophysique dans la tâche difficile en cours de relayer les mouvements du domaine des protéines avec leur fonctionnalité biologique. Le protocole présenté ici peut être généralement appliqué à toute mesure de l’écho de spin neutronique effectuée au spectromètre SNS-NSE, quel que soit votre choix d’échantillons, si l’on reste dans le domaine des matériaux de matière molle. Pour mettre en place l’expérience, commencez par sélectionner l’épaisseur de la charge de l’échantillon cellulaire, en fonction de la concentration de l’échantillon de protéines, de la température nécessaire à la mesure et de la quantité de solution disponible.
Nettoyez la cellule avec du détergent à vaisselle sans phosphate, de l’eau désionisée et du diéthanol à 70%. Sécher la cellule dans le four à convection. Chargez quatre millilitres de solution protéique dans la cellule et fermez avec des bouchons.
Utilisez un film de cire ou tout autre scellant pour sceller les cellules de l’échantillon. Chargez quatre millilitres de tampon de dialyse dans un récipient identique à celui de l’échantillon de protéines et scellez. Transporter les échantillons jusqu’à la ligne de faisceau.
Fermez l’obturateur et entrez dans la zone de la grotte de l’enceinte du spectromètre. Montez la cellule d’échantillon sur le porte-échantillon en aluminium en serrant les vis et les plaques de maintien. Montez l’échantillon de graphite et l’échantillon de poudre d’oxyde d’aluminium chargés dans un récipient identique à celui de l’échantillon de protéines.
Placez le même support en le faisant glisser doucement dans la boîte du système de forçage de température. Fermez le couvercle du système de forçage de température et réglez la température à la valeur souhaitée en accédant à l’écran interactif du système de forçage de température. Montez la caméra à neutrons pour l’alignement des échantillons sur le faisceau.
Pour collecter les données de spectroscopie d’écho de spin neutronique, alignez l’échantillon dans le faisceau de neutrons à l’aide de la caméra à neutrons et des quatre ouvertures d’échantillon indépendantes. Ouvrez la source de neutrons de spallation, le logiciel de collecte de données neutron-spin echo spectroscopy et collectez des statistiques d’échantillons en exécutant des analyses de déflation pour les angles de diffusion et la longueur d’onde souhaités. Configurez les paramètres de mesure en fonction des statistiques collectées pour chaque échantillon en éditant les macros de mesure fournies par le scientifique de l’instrument d’assistance.
Commencez l’analyse en tapant le nom du protocole dans le prompteur de commandes et en acquérant des échos pour l’exemple. Connectez-vous au cluster Neutron Sciences Remote Analysis avec les informations d’identification de l’utilisateur ORNL et appuyez sur le bouton de lancement de la session. Dans le répertoire utilisateur, ouvrez une fenêtre de terminal et tapez la commande de configuration du logiciel.
Ensuite, tapez la commande d’environnement. Créez un dossier pour la réduction des données dans le répertoire de base et copiez les scripts et macros fournis à partir du répertoire partagé. Modifiez, renommez et enregistrez la macro de réduction fournie en conséquence.
Tapez drspine"à l’invite de commandes et appuyez sur Entrée pour démarrer l’environnement de réduction logicielle. Tapez le nom de la macro de réduction dans le prompteur de commandes de l’environnement logiciel, puis appuyez sur Entrée. Modifiez le script Python fourni par Assisting Instrument Scientist avec les noms des données de fichier réduites.
Modifiez la fonction pour l’adapter à partir de la bibliothèque fournie. Tapez le nom du script modifié dans le prompteur de commandes, puis appuyez sur Entrée pour lire, ajuster et tracer des données NSE réduites. La fonction de diffusion intermédiaire mesurée par NSE pour les protéines IgG et MBP montre un net écart par rapport à un simple processus de relaxation de type diffusion sur la courte échelle de temps de quatre ans, indiquant l’accessibilité de la dynamique interne des protéines par NSE, et la nécessité d’un modèle plus complexe pour décrire les processus dynamiques observés.
Les résultats des calculs de la fonction de diffusion intermédiaire ajustés par modélisation atomique des deux protéines à l’aide de modèles développés par étaient en excellent accord avec les données expérimentales de nSE. Les résultats ont prouvé que la dynamique plus lente observée à des temps de fourrage plus longs peut être attribuée aux processus globaux de diffusion translationnelle et rotationnelle, tandis que la dynamique observée aux courtes échelles de temps peut être attribuée à la dynamique des domaines protéiques. Une chose importante à retenir est la nécessité d’échantillons bien préparés et propres pour les mesures NSE.
Un bon échantillon pour un Spin Echo a un rapport de retournement supérieur à trois, qui est le rapport entre la diffusion cohérente et incohérente de l’échantillon. De plus, pendant la préparation de l’échantillon et le chargement de l’échantillon dans les cellules NSE, la solution de l’échantillon doit être conservée en toute sécurité et exempte de toute contamination croisée chimique ou biologique. Pour des raisons de sécurité, l’entrée dans l’enceinte du spectromètre ne doit être tentée qu’après la fermeture de l’obturateur et un temps supplémentaire d’une demi-heure a été accordé pour le refroidissement par rayonnement de l’enceinte.
La diffusion neutronique à petit angle est recommandée pour évaluer la forme et la structure des protéines dans une solution concentrée. Cela peut être fait avant ou en parallèle avec l’expérience NSE. Des méthodes supplémentaires telles que la diffusion dynamique de la lumière et les mesures de viscosité fournissent des informations sur la diffusion translationnelle et l’interaction hydrodynamique dans la solution protéique concentrée, et sont également recommandées.
