Bu yöntem, tümör immünolojisinde, periferik dokulardan tümöre özgü bağışıklık hücrelerinin yenilenmesi olup olmadığı, tümör mikroortamında yeni sızmış ve zaten var olan bağışıklık hücreleri arasındaki geçişler ve immünoterapiye verdikleri yanıtlar dahil olmak üzere kilit soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir. Bu, periferi kaynaklı hücreleri tümör kaynaklı bağışıklık hücrelerinden ayırt etmek ve bu hücrelerin dinamik, fenotipik ve fonksiyonel değişikliklerini uzunlamasına tahlillerde izlemek için kullanışlı ve takip edilmesi kolay bir tekniktir. Hazırlanan B16F10-OVA hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini 1 mL'lik bir tüberkülin şırıngasına çekerek başlayın.
Herhangi bir kabarcığı üste taşımak için namluya dokunun ve hava kabarcıklarını gidermek için pistonu yavaşça itin. Karnını açığa çıkarmak için fareyi kısıtlayın. Sol kasık bölgesinin derisini sıkılaştırmak için sol arka bacağına serçe parmağınızla bastırın.
Farenin saçını sol alt karnından elektrikli tıraş makinesi ile çıkarın. Sol karın bölgesinin arka kadranını temizlemek için% 75 etanol içine batırılmış pamuk kullanın. Şırıngayı 0 ila 15 derece arasında sığ bir açıyla tutun ve iğnenin eğimi yukarı bakacak şekilde sol üst uyluğun yanına yerleştirin.
İğneyi deri altı dokusundan kasık bölgesine 0,5 ila 1 santimetre ilerletin. Enjekte etmeden önce pistonu geri çekin. Negatif basınç varsa, pistonu tamamen bastırın ve subkutiste küçük bir sıvı cebinin veya bir bolusun oluşumunu gözlemleyin.
Enjeksiyon yapıldıktan sonra iğneyi çıkarın. Fareyi serbest bırakın ve tekrar kafese yerleştirin. B16F10-OVA implantasyonundan sonraki altıncı ila sekizinci günde, tümör boyutunu vernier bir ölçekle ölçün.
Yaklaşık üç milimetre çapında veya maş fasulyesi büyüklüğünde bir tümöre sahip fareleri seçin ve bunları eşit ve rastgele iki gruba bölün. 200 mikrolitre OT-1 hücre süspansiyonunu 100 üniteli 29 gauge insülin şırıngasına çekin ve kabarcıkları çıkarın. Kuyruk damarını genişletmek için fareyi ayrı ayrı bir kafese yerleştirin, kafesin üzerinde 5 ila 10 dakika boyunca kızılötesi bir lamba kullanın.
Fareyi uygun boyutta bir kısıtlama cihazıyla hareketsiz hale getirin. Düzeltmek için kuyruğu tutun ve damarı görünür kılmak için% 75 etanol püskürtün. Şırıngayı damara paralel tutun ve damara 0 ila 15 derecelik bir açıyla yerleştirin.
Pistonu hafifçe geri çekin ve namluya kan girerse, süspansiyonu dakikada bir mililitreden fazla olmayan bir hızda yavaşça ve sabit bir şekilde enjekte edin. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, şırıngayı çıkarın ve kanamayı durdurmak için enjeksiyon bölgesine üç ila beş saniye boyunca hafifçe bastırın. Fareyi kafese geri döndürün ve olumsuz reaksiyonlar için birkaç dakika boyunca yakından gözlemleyin.
Normal hareketliliğe ve burun akıntısına sahipse, diğer farelerin yanına geri yerleştirin. Evlat edinilen transferden 8 ila 10 gün sonra, transplantasyon cerrahisi için yaklaşık beş milimetre çapında karşılaştırılabilir tümör kütlesi taşıyan donör fareleri seçin. Bir biyogüvenlik dolabına 100 milimetre x 20 mililitrelik bir tabak yerleştirin ve 10 mililitre steril, buz gibi soğuk PBS ekleyin.
Fareyi ötenazi yaptıktan sonra, üç ila beş dakika boyunca% 75 etanol içine batırın. Fareyi, biyogüvenlik kabinindeki temiz emici kağıtla kaplı bir diseksiyon panosu üzerine sırtüstü konuma getirin. Fare uzuvlarını diseksiyon iğneleriyle kısıtlayın.
Cildi orta hat boyunca üretral deliğin üstünden makasla ksifoide doğru kesin. Cildi cımbızla fare gövdesinin sol tarafına doğru gerin ve cildi diseksiyon iğneleriyle kısıtlayın. Kapsülünü mümkün olduğunca sağlam tutarak tümörü tüketin.
Tümörün yakınındaki bağ dokusunu cerrahi makasla dikkatlice ve nazikçe çıkarın, ardından tümör dokusunu sonraki nakil için steril, buz gibi soğuk PBS içeren kaba yerleştirin. Kurumasını önlemek için gözlerde veteriner merhem kullanın. Farenin sol kanadını elektrikli tıraş makinesiyle tıraş edin, ardından kalan saçları çıkarmak için tüy dökücü bir krem uygulayın.
Fareyi biyogüvenlik kabininin içine, temiz emici kağıtla kaplı bir diseksiyon panosu üzerinde, farenin dikey ekseni paralel ve başı deneycinin sağ tarafına gelecek şekilde eğilimli bir konumda yerleştirin. Tıraş edilen bölgenin cildini povidon-iyota batırılmış pamukla ovalayın. Cerrahi cımbızla fare kalça eklemleri arasındaki orta noktada cildi kaldırın.
Beş milimetre uzunluğunda dikey eksizyon yapmak için makası kullanın ve kesimi dorsal orta hat boyunca rostral olarak yaklaşık 10 ila 15 milimetreye kadar uzatın. Makasın kapalı uçlarını kesiye sokarak ve ardından sol kanadın peritonunu deriden ve yumuşak dokudan ayırmak için açarak keskin bir diseksiyon yapın. Sol kanatta bir cilt cebi oluşturmak için birkaç kez keskin diseksiyon yapın.
Kapsüllenmiş, sağlam, donör kaynaklı tümör kütlesini cebe koyun. Her kesi için iki veya üç dikiş kullanarak kesilmiş bir dikişle insizyonu kapatın. Kesimin etrafındaki cildi povidon-iyota batırılmış pamukla dezenfekte edin.
Fareyi yanal konuma temiz ve ılık bir kafese yerleştirin. Sternal yassılığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar sürekli olarak izleyin. Buprenorfin'i deri altından, her sekiz saatte bir vücut ağırlığının kilogramı başına 0.1 miligramlık bir dozda, toplam üç doz boyunca uygulayın.
Nakil alıcısını diğer hayvanların şirketine ancak tamamen iyileştikten sonra iade edin. Akım sitometrisi kullanılarak, CD45.1-pozitif donör kaynaklı ve CD45.1-negatif ve CD45.2-pozitif alıcı kaynaklı tümör infiltrasyonu CD8-pozitif T hücreleri dahil olmak üzere CD44-negatif ve CD8-pozitif tümör antijenine özgü T hücrelerinin iki popülasyonu tümör mikroortamında kolayca tanımlanmıştır. Transplantasyon sonrası ikinci günde, nakledilen tümör içinde donör kaynaklı antijen spesifik CD8-pozitif T hücrelerinin yaklaşık% 83'ü vardı ve alıcı kaynaklı meslektaşlarından daha baskındı.
Alıcı kaynaklı OT-1 hücrelerinin oranı, tümörigenezin geç evresinde, donörden türetilen tümöre özgü OT-1 hücrelerini aşarak yükselmiştir. Hatırlanması gereken en önemli şey, deri altı tümör nakli sırasında, özellikle granüler lenf nodunda, çevre dokularda yaralanmaları önlemek için nazik bir diseksiyon yapılmasıdır.
