마우스에서 종양 침윤성 CD8⁺ T 세포의 역학을 평가하기 위한 종양 이식

이 방법은 말초 조직에서 종양 특이 면역 세포의 보충이 있는지 여부, 종양 미세 환경 내에서 새로 침윤 된 면역 세포와 이미 존재하는 면역 세포 간의 전이 및 면역 요법에 대한 반응을 포함하여 종양 면역학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이는 종양 침윤된 면역 세포로부터 주변부 유래 세포를 구별하고 종방향 분석에서 이들 세포의 동적, 페노티픽 및 기능적 변화를 추적하기 위해 편리하고 따라하기 쉬운 기술이다. 먼저 제조된 B16F10-OVA 세포 현탁액 100 마이크로리터를 1 mL 투베르쿨린 주사기 내로 인출한다.

배럴을 탭하여 거품을 위쪽으로 이동시키고 플런저를 부드럽게 밀어 기포를 제거합니다. 마우스를 제지하여 복부를 노출시킵니다. 새끼 손가락으로 왼쪽 뒷다리를 눌러 왼쪽 사타구니 부위의 피부를 조입니다.

전기 면도기로 왼쪽 하복부에서 마우스의 머리카락을 제거하십시오. 75 % 에탄올에 적신 면화를 사용하여 왼쪽 복부의 후부 사분면을 청소하십시오. 주사기를 0도에서 15도 사이의 얕은 각도로 잡고 바늘의 경사가 위쪽을 향하게하여 왼쪽 위 허벅지 측면에 삽입하십시오.

바늘을 0.5 ~ 1 센티미터로 피하 조직을 통해 사타구니 영역으로 밀어 넣으십시오. 주입하기 전에 플런저를 뒤로 당깁니다. 음압이있는 경우 플런저를 완전히 누르고 서브 큐티스에 작은 유체 주머니 또는 볼루스가 형성되는 것을 관찰하십시오.

주사가 수행 된 후 바늘을 제거하십시오. 마우스를 떼어 케이지에 다시 넣습니다. B16F10-OVA 이식 후 6일째 내지 여덟 일째에, 버니어 스케일로 종양 크기를 측정한다.

대략 세 밀리미터 직경 또는 녹두 크기의 종양을 가진 마우스를 선택하고 동등하고 무작위로 두 그룹으로 나눕니다. 200 마이크로리터의 OT-1 세포 현탁액을 100 유닛 29 게이지 인슐린 주사기로 회수하고 기포를 제거하십시오. 마우스를 케이지에 별도로 놓고 새장 위에 적외선 램프를 두어 5 ~ 10 분 동안 꼬리 정맥을 확장시킵니다.

적절한 크기의 억제 장치로 마우스를 고정시킵니다. 꼬리를 잡고 곧게 펴고 75 % 에탄올을 뿌려 정맥을 보이게하십시오. 주사기를 정맥에 평행하게 잡고 0 ~ 15도 각도로 정맥에 삽입하십시오.

플런저를 약간 뒤로 당기고 혈액이 배럴에 들어가면 천천히 그리고 꾸준히 분당 한 밀리리터 이하의 속도로 현탁액을 주입하십시오. 주사가 완료된 후, 주사기를 제거하고 주사 부위를 삼 ~ 다섯 초 동안 부드럽게 눌러 출혈을 멈추십시오. 마우스를 케이지로 돌려 놓고 부작용이 있는지 몇 분 동안 면밀히 관찰하십시오.

정상적인 이동성과 비강 분비물이있는 경우 다른 마우스의 회사에 다시 넣으십시오. 입양 이식 후 8 내지 10일 후, 이식 수술을 위해 대략 5밀리미터 직경의 유사한 종양 질량을 갖는 공여체 마우스를 선택한다. 생물 안전 캐비닛에 100 밀리미터 x 20 밀리리터 접시를 놓고 멸균 된 얼음처럼 차가운 PBS 10 밀리리터를 넣으십시오.

마우스를 안락사시킨 후, 75%에탄올에 3~5분 동안 담그십시오. 마우스를 생물 안전 캐비닛의 깨끗한 흡수 종이로 덮인 해부 보드의 수핀 위치에 놓습니다. 해부 바늘로 마우스 팔다리를 제지하십시오.

요도 오리피스 위에서 가위로 xiphoid까지 중간 선을 따라 피부를 자릅니다. 핀셋으로 마우스 몸의 왼쪽으로 피부를 스트레칭하고 해부 바늘로 피부를 억제하십시오. 종양을 소비하고 캡슐을 가능한 한 그대로 유지하십시오.

수술 가위로 종양 근처의 결합 조직을 조심스럽게 부드럽게 제거한 다음, 후속 이식을 위해 멸균되고 빙냉 PBS가 들어있는 접시에 종양 조직을 놓습니다. 눈에 수의학 연고를 사용하여 건조하지 않도록하십시오. 전기 면도기로 마우스의 왼쪽 측면을 면도 한 다음 탈모 크림을 바르고 나머지 머리카락을 제거하십시오.

마우스를 깨끗한 흡수성 종이로 덮인 해부 보드의 쉬운 위치에 생물 안전 캐비닛 안에 놓고 마우스의 수직 축을 평행하게하고 머리는 실험자의 오른쪽에 놓습니다. 면도 부위의 피부를 포비돈 요오드에 적신 면화로 문지릅니다. 수술 핀셋으로 마우스 엉덩이 관절 사이의 중간 지점에서 피부를 들어 올립니다.

가위를 사용하여 5 밀리미터 길이의 수직 절제를하고 등쪽 미드 라인을 따라 로스트랄로 컷을 약 10 ~ 15 밀리미터까지 확장하십시오. 가위의 닫힌 끝을 절개에 삽입 한 다음 왼쪽 측면의 복막을 피부와 연조직으로부터 분리하여 열어 날카로운 해부를 수행하십시오. 날카로운 해부를 여러 번 수행하여 왼쪽 측면에 피부 주머니를 생성합니다.

캡슐화되고 손상되지 않은 공여체 유래 종양 덩어리를 주머니에 넣으십시오. 각 절개에 대해 두 개 또는 세 개의 바늘을 사용하여 중단 된 봉합사로 절개를 닫습니다. 포비돈 요오드에 적신 면화로 컷 주위의 피부를 소독하십시오.

마우스를 깨끗하고 따뜻한 케이지의 옆 위치에 놓습니다. 흉골 잔해를 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 지속적으로 모니터링하십시오. 부프레노르핀을 8시간마다 체중 1kg당 0.1밀리그램의 용량으로 피하 투여하여 총 세 번 복용한다.

이식 수혜자를 완전히 회복 한 후에 만 다른 동물의 회사로 돌려 보내십시오. 유세포 분석기를 사용하여, CD44 음성 및 CD8 양성 종양 항원-특이적 T 세포의 두 집단을 종양 미세환경에서 쉽게 동정하였고, 여기에는 CD45.1 양성 공여자 유래 및 CD45.1 음성 및 CD45.2 양성 수용자 유래 종양 침윤 CD8 양성 T 세포가 포함된다. 이식 후 둘째 날에, 이식된 종양 내에 공여체 유래 항원 특이적 CD8 양성 T 세포의 약 83%가 존재하였으며, 이는 그들의 수용자 유래 대응물보다 더 우세하였다.

수용자 유래 OT-1 세포의 비율은 종양 발생의 후기 단계에서 상승하였고, 공여자로부터 유래된 종양 고유 OT-1 세포를 초과하였다. 기억해야 할 가장 중요한 것은 주변 조직, 특히 과립 림프절에서 부상을 피하기 위해 피하 종양 이식 중에 부드러운 해부를 수행하는 것입니다.