Este método pode ajudar a responder às principais questões da imunologia tumoral, incluindo se há uma reposição de células imunes específicas do tumor de tecidos periféricos, as transições entre células imunes recém-infiltradas e já existentes dentro do microambiente tumoral, e suas respostas à imunoterapia. Esta é uma técnica conveniente e fácil de seguir para distinguir as células derivadas da periferia das células imunes infiltradas por tumores e rastrear as mudanças dinâmicas, fenotípicas e funcionais dessas células em ensaios longitudinais. Comece retirando 100 microliters da suspensão celular B16F10-OVA preparada em uma seringa tuberculina de 1 mL.
Toque no barril para mover quaisquer bolhas para cima e empurre suavemente o êmbolo para remover bolhas de ar. Contenha o rato para expor seu abdômen. Pressione a perna traseira esquerda com o dedo mindinho para apertar a pele da região inguinal esquerda.
Remova o cabelo do rato do abdômen inferior esquerdo com uma máquina de barbear elétrica. Use algodão encharcado em 75% de etanol para limpar o quadrante posterior do abdômen esquerdo. Segure a seringa em um ângulo raso entre 0 a 15 graus e, com o bisel da agulha voltado para cima, insira-a no lado da coxa superior esquerda.
Avance a agulha de 0,5 a 1 centímetro através do tecido subcutâneo para a região inguinal. Puxe para trás no êmbolo antes de injetar. Se houver pressão negativa, deprimi o êmbolo inteiramente e observe a formação de um pequeno bolso fluido, ou um bolus, na subcutia.
Remova a agulha após a injeção ser realizada. Solte e coloque o rato de volta na gaiola. No sexto ao oitavo dia após a implantação de B16F10-OVA, meça o tamanho do tumor com uma escala vernier.
Selecione os camundongos com aproximadamente três milímetros de diâmetro ou um tumor do tamanho de um grão-mung, e divida-os igual e aleatoriamente em dois grupos. Retire 200 microliters de suspensão celular OT-1 em uma seringa de insulina de 100 unidades de 29 mingações e remova bolhas. Coloque o mouse separadamente em uma gaiola, com uma lâmpada infravermelha sobre a gaiola por 5 a 10 minutos para dilatar a veia da cauda.
Imobilize o mouse com um dispositivo de contenção de tamanho apropriado. Segure a cauda para endireitar e pulverize 75% de etanol para tornar a veia visível. Segure a seringa paralela à veia e insira-a na veia em um ângulo de 0 a 15 graus.
Puxe ligeiramente o êmbolo, e se o sangue entrar no barril, injete lentamente e firmemente a suspensão a uma taxa de não mais de um mililitro por minuto. Depois que a injeção for concluída, remova a seringa e pressione a área de injeção suavemente por três a cinco segundos para parar o sangramento. Devolva o mouse para a gaiola e observe-o de perto por alguns minutos para reações adversas.
Se tiver mobilidade normal e descarga nasal, coloque-o de volta na companhia dos outros ratos. 8 a 10 dias após a transferência adotiva, selecione camundongos doadores com massa tumoral comparável de aproximadamente cinco milímetros de diâmetro para cirurgia de transplante. Coloque um prato de 100 milímetros por 20 mililitros em um armário de biossegurança e adicione 10 mililitros de PBS estéreis e gelados.
Depois de eutanásia do mouse, mergulhe-o em 75% de etanol por três a cinco minutos. Coloque o mouse na posição supina em uma placa de dissecção coberta com papel absorvente limpo no armário de biossegurança. Contenha os membros do rato com agulhas de dissecção.
Corte a pele ao longo da linha média de cima do orifício uretrais ao xiphoide com uma tesoura. Estique a pele em direção ao lado esquerdo do corpo do rato com pinças e contenha a pele com agulhas de dissecção. Extirula o tumor, mantendo sua cápsula o mais intacta possível.
Retire cuidadosamente e suavemente o tecido conjuntivo perto do tumor com uma tesoura cirúrgica, em seguida, coloque o tecido tumoral na antena contendo PBS estéril e gelado para posterior transplante. Use pomada veterinária nos olhos para evitar que sequem. Raspe o flanco esquerdo do mouse com uma máquina de barbear elétrica e aplique um creme depilatório para remover o cabelo restante.
Coloque o mouse dentro do armário de biossegurança em uma posição propensa em uma placa de dissecção coberta com papel absorvente limpo, com o eixo vertical do mouse paralelo e sua cabeça para o lado direito do experimentador. Esfregue a pele da área raspada com algodão encharcado em povidone-iodo. Levante a pele no ponto médio entre as articulações do quadril do rato com pinças cirúrgicas.
Use a tesoura para fazer uma excisão vertical de cinco milímetros de comprimento e estender o corte rostrally ao longo da linha dorsal para cerca de 10 a 15 milímetros. Realize uma dissecção afiada inserindo as pontas fechadas da tesoura na incisão e, em seguida, abrindo para separar o peritônio do flanco esquerdo da pele e tecido mole. Faça dissecação afiada várias vezes para gerar um bolso de pele no flanco esquerdo.
Deposite a massa tumoral encapsulada, intacta e derivada do doador no bolso. Feche a incisão por uma sutura interrompida, usando dois ou três pontos para cada incisão. Desinfete a pele ao redor do corte com algodão encharcado em povidone-iodo.
Coloque o mouse na posição lateral em uma gaiola limpa e quente. Monitore-o continuamente até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter a recumbência severa. Administre a buprenorfina subcutânea a uma dose de 0,1 miligrama por quilograma de peso corporal a cada oito horas, totalizando três doses.
Devolva o receptor de transplante para a companhia de outros animais somente depois de totalmente recuperado. Utilizando citometria de fluxo, duas populações de células T específicas de antígeno tumor cd44 negativo e CD8 positivo foram facilmente identificadas no microambiente tumoral, incluindo células T CD45.1 positivas derivadas de doadores e CD45,1 negativo e CD45,2 positivo derivados do tumor CD8-positivo. No segundo dia pós-transplante, havia aproximadamente 83% das células T cd8-positivas derivadas de antígenos derivados de doadores dentro do tumor transplantado, mais predominantes do que suas contrapartes derivadas do receptor.
A proporção de células OT-1 derivadas do receptor foi elevada no estágio final da tumorigênese, excedendo as células OT-1 inerentes ao tumor derivadas do doador. O mais importante a lembrar é que realizar uma dissecção suave durante o transplante de tumor subcutâneo para evitar lesões nos tecidos circundantes, especialmente no linfonodo granular.
