この方法は、末梢組織からの腫瘍特異的免疫細胞の補充があるかどうか、腫瘍微小環境内で新たに浸潤した免疫細胞と既存の免疫細胞との間の遷移、および免疫療法に対するそれらの応答を含む、腫瘍免疫学における重要な質問に答えるのに役立つ。これは、末梢由来細胞と腫瘍浸潤免疫細胞を区別し、縦断アッセイでこれらの細胞の動的、表現的、および機能的変化を追跡するための便利でわかりやすい技術です。まず、調製したB16F10-OVA細胞懸濁液100マイクロリットルを1mLツベルクリンシリンジに引き込む。
バレルをタップして気泡を上部に移動し、プランジャーを静かに押して気泡を取り除きます。腹部が露出するようにマウスを拘束します。左後肢を小指で押して、左鼠径部の皮膚を引き締めます。
マウスの毛を左下腹部から電気シェーバーで取り除きます。75%エタノールに浸した綿を使用して、左腹部の後象限をきれいにします。シリンジを0〜15度の浅い角度で持ち、針の斜めを上に向けて、左上腿の側面に挿入します。
針を皮下組織を通って鼠径部に0.5〜1センチメートル進める。注入する前にプランジャーを後ろに引いてください。負圧がある場合は、プランジャーを完全に押し下げて、サブキューティスに小さな液体ポケットまたはボーラスの形成を観察します。
注射が行われた後に針を取り外す。マウスを放してケージに戻します。B16F10-OVA移植後6~8日目に、腫瘍サイズをバーニアスケールで測定する。
直径約3ミリメートルまたは緑豆サイズの腫瘍を有するマウスを選択し、それらを均等かつランダムに2つのグループに分割する。200マイクロリットルのOT-1細胞懸濁液を100ユニットの29ゲージインスリンシリンジに引き出し、気泡を除去する。マウスをケージに別々に置き、ケージの上に赤外線ランプを5〜10分間かけて尾静脈を拡張します。
マウスを適切なサイズの拘束装置で固定する。尾をまっすぐに伸ばし、静脈を見えるように75%エタノールをスプレーします。シリンジを静脈と平行に保持し、0〜15度の角度で静脈に挿入する。
プランジャーをわずかに引き戻し、血液がバレルに入った場合は、毎分1ミリリットル以下の速度で懸濁液をゆっくりと着実に注入します。注射が完了したら、注射器を取り外し、注射領域を3〜5秒間静かに押して出血を止めます。マウスをケージに戻し、副作用がないか数分間注意深く観察します。
それが正常な可動性と鼻汁を持っているならば、それを他のマウスの会社に戻してください。養子移入の8〜10日後に、直径約5ミリメートルの同等の腫瘍塊を有するドナーマウスを移植手術のために選択する。バイオセーフティキャビネットに100ミリメートル×20ミリリットルの皿を置き、10ミリリットルの滅菌、氷冷PBSを加える。
マウスを安楽死させた後、75%エタノールに3〜5分間浸漬する。バイオセーフティキャビネット内の清潔な吸収紙で覆われた解剖ボードの上にマウスを仰臥位に置きます。解剖針でマウスの四肢を拘束する。
はさみで尿道オリフィスの上から剣状体まで正中線に沿って皮膚を切断する。ピンセットで皮膚をマウスの体の左側に伸ばし、解剖針で皮膚を拘束します。腫瘍を切除し、そのカプセルをできるだけ無傷に保つ。
外科用はさみで腫瘍の近くの結合組織を注意深く穏やかに除去し、その後移植するために滅菌された氷冷PBSを含む皿に腫瘍組織を置く。目に獣医用軟膏を使用して、乾燥を防ぎます。マウスの左脇腹を電気シェーバーで剃り、脱毛クリームを塗って残りの毛を取り除きます。
マウスの縦軸が実験者の右側に平行で、マウスの頭が平行になるように、清潔な吸収紙で覆われた解剖ボード上のバイオセーフティキャビネットの内側にマウスを置きます。ポビドンヨードに浸した綿で剃った部分の皮膚をこすります。マウスの股関節の中間点にある皮膚を外科用ピンセットで持ち上げます。
はさみを使用して長さ5ミリメートルの垂直切除を行い、背側正中線に沿って吻側に切断を約10〜15ミリメートルまで伸ばす。はさみの閉じた先端を切開部に挿入し、左脇腹の腹膜を皮膚および軟部組織から分離するために開いて鋭い解剖を行う。鋭い解剖を数回行い、左脇腹に皮膚ポケットを作ります。
封入された無傷のドナー由来の腫瘍塊をポケットに預ける。切開部ごとに2つまたは3つのステッチを使用して、中断された縫合糸によって切開部を閉じる。ポビドンヨードに浸した綿でカットの周りの皮膚を消毒します。
マウスを清潔で暖かいケージの横の位置に置きます。胸骨の臥位を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、継続的に監視してください。ブプレノルフィンを皮下投与し、体重1kgあたり0.1ミリグラムを8時間ごとに投与し、合計3回投与する。
移植レシピエントは、完全に回復した後にのみ他の動物の会社に返してください。フローサイトメトリーを用いて、CD45.1陽性ドナー由来およびCD45.1陰性およびCD45.2陽性レシピエント由来腫瘍浸潤CD8陽性T細胞を含む、腫瘍微小環境においてCD44陰性およびCD8陽性腫瘍抗原特異的T細胞の2つの集団を容易に同定した。移植後2日目には、移植腫瘍内にドナー由来抗原特異的CD8陽性T細胞が約83%存在し、レシピエント由来のCD8陽性T細胞よりも優勢であった。
レシピエント由来OT-1細胞の割合は、腫瘍形成の後期段階で上昇し、ドナー由来の腫瘍固有のOT-1細胞を上回った。覚えておくべき最も重要なことは、皮下腫瘍移植中に穏やかな解剖を行い、周囲の組織、特に顆粒リンパ節の損傷を避けることです。
