Ce protocole identifie quatre domaines clés pour aider à améliorer la méthodologie et avoir une transplantation pulmonaire fiable. La première est une technique de brassard reproductible. Deuxièmement, il faut identifier avec précision et reproductibilité le quatrième espace intercostal, une fermeture complète de la plaie, puis comment récupérer et obtenir des échantillons pour analyse.
Ces techniques permettent de développer une méthode fiable de transplantation pulmonaire pour travailler sur les mécanismes moléculaires et développer des interventions thérapeutiques. Commencez par la configuration du dispositif chirurgical en allumant l’équipement de surveillance de la fréquence cardiaque / saturation en oxygène et en réchauffant la planche à 42 degrés Celsius. Allumez également l’appareil de ventilation et d’anesthésie pour préchauffer l’évaporateur d’isoflurane.
Remplissez une seringue d’anesthésie avec 10 millilitres d’isoflurane liquide et montez la seringue sur l’appareil de ventilation et d’anesthésie. Ensuite, allumez le microscope chirurgical avec la hauteur et la mise au point ajustées aux préférences et démarrez l’appareil d’électrocautérisation. De même, préparez et disposez les outils chirurgicaux.
Déterminez la taille correcte de la jauge de l’angiocathéter à utiliser pour fabriquer les menottes en fonction du poids corporel du rat en vous référant au tableau un. Après avoir préparé les brassards pour l’artère pulmonaire, les bronches et la veine pulmonaire, placez l’angiocathéter de la taille appropriée sur une surface stérile sous le microscope chirurgical. Ensuite, utilisez une lame chirurgicale numéro 11 pour couper l’angio-cathéter à un angle de 90 degrés pour former un corps de brassard de deux millimètres de long avec une largeur et une hauteur d’un millimètre au sommet du corps du brassard.
Après avoir préparé l’enveloppement pour la chirurgie, faites une incision cutanée médiane de trois à quatre centimètres de long, mi-cou, avec les ciseaux, et disséquez soigneusement les tissus sous-cutanés et les muscles à l’aide de forceps. Pour l’intubation endotrachéale, enfilez une suture de soie 4-0 autour de la trachée. Ensuite, insérez un angiocathéter de calibre 16 dans la trachée et attachez fermement la suture autour de la trachée avec un double nœud, suivi d’un seul nœud pour maintenir l’angio-cathéter en place.
Connectez l’angio-cathéter au ventilateur pour maintenir un plan chirurgical d’anesthésie chez le rat avec 1 à 2% d’isoflurane. Utilisez les ciseaux pour effectuer une laparo-sternotomie, comme une incision médiane et transversale combinée. Ensuite, injectez 1 000 unités par kilogramme d’héparine avec une seringue à insuline via la veine cave inférieure, ou IVC, et attendez 10 minutes pour la circulation systémique.
Pendant que les poumons sont ventilés, coupez les oreillettes droite et gauche avec des ciseaux à ressort à microdissection, puis introduisez un angiocathéter de calibre 18 à travers l’artère pulmonaire pour rincer les poumons par gravité avec 20 millilitres de solution de conservation dans une seringue suspendue à 28 centimètres d’eau, reliée au tube et à l’angio-cathéter. Débranchez le ventilateur du tube endotrachéal pour le connecter à une seringue de cinq millilitres remplie d’un volume d’air approprié en fonction du poids corporel. Après une heure d’ischémie chaude, excisez le bloc cœur-poumon avec les ciseaux à ressort et les pinces à microdissection et placez-le sur une gaze stérile imbibée de PBS glacé sur une boîte de Petri stérile sur glace.
Coupez soigneusement la zone hilaire du poumon gauche avec des ciseaux à ressort Vannas-Tubingen et procurez-vous la veine pulmonaire gauche, l’artère pulmonaire et les bronches. Utilisez un hémostatique de moustique pour saisir la languette du brassard. Ensuite, prenez l’extrémité distale de la veine pulmonaire, de l’artère pulmonaire ou de la bronche à travers le corps de brassard approprié et inversez le tissu supplémentaire autour du brassard avant de fixer avec 8-0 Suture en nylon.
Une fois cela fait, utilisez des ciseaux à ressort Vannas-Tubingen pour couper le tissu supplémentaire et le brassard autour du corps du brassard. Pour préparer le rat receveur, tracez une ligne sur la poitrine du rat de l’encoche suprasternale au processus xiphoïde. Au milieu de cette ligne, tracez une ligne le long du côté gauche de la poitrine qui mesure la moitié de la mesure de l’encoche suprasternale au processus xiphoïde.
À l’aide du câble à fibre optique connecté à une lumière LED du kit d’intubation endotrachéale, visualisez et intuberez le receveur avec un angio-cathéter de calibre 16. Une fois les poumons retirés, placez une gaze stérile autour du poumon gauche tout en le tenant avec une pince de bouledogue Dieffenbach et appliquez une pince Yasargil sur la zone hilaire du poumon gauche aussi proximale que possible. Lorsque le rat est préparé, procédez à l’anastomose de la veine pulmonaire en plaçant une suture en nylon 7-0 autour de la veine pulmonaire du receveur.
Inciser la veine pulmonaire du receveur à l’aide des ciseaux à ressort Vannas-Tubingen en coupant transversalement les veines segmentaires supérieure et inférieure aussi distalement que possible, et rincer le sang avec 0,2 millilitre d’une unité internationale par millilitre de solution saline héparinée à l’aide d’une seringue à insuline. Placez le poumon du donneur enveloppé d’une gaze glacée, humide et stérile dans la cavité thoracique et insérez la veine pulmonaire brassée du donneur dans la veine pulmonaire du receveur avant de fixer l’anastomose avec la suture en nylon prépositionnée 7-0. Pour l’anastomose bronchique ou bronche, placez une suture en nylon 7-0 autour de la bronche du receveur avant d’inciser la bronche du receveur en coupant transversalement les voies respiratoires segmentaires supérieure et inférieure aussi distalement que possible.
Après avoir inséré la bronche brassée du donneur dans la bronche du receveur, fixez l’anastomose avec la suture en nylon prépositionnée 7-0. Ensuite, effectuez l’anastomose de l’artère pulmonaire comme décrit précédemment. Pour permettre la reprofusion et la ventilation du poumon du donneur transplanté, retirez la pince Yasargil sur le hile, puis fermez l’incision de thoracotomie avec une suture en nylon 6-0.
Recueillir le liquide BAL des poumons natifs ou transplantés comme vous le souhaitez. Le rapport poids humide/sec des lobes a été calculé pour mesurer l’œdème pulmonaire. Le lobe transplanté a montré une augmentation significative du rapport poids humide / sec par rapport au lobe natif du donneur ou du receveur, indiquant l’absence d’œdème pulmonaire.
À notre avis, les deux étapes critiques de cette procédure sont d’une part, utiliser avec précision des repères anatomiques pour identifier le quatrième espace intercostal, puis deux, sélectionner et utiliser de manière appropriée les brassards pour avoir une technique de brassard reproductible. Un modèle de transplantation pulmonaire de rat à la fois reproductible et cohérent est une base pour les études moléculaires sur la reprofusion ischémique et la transplantation en général.
