Ce protocole décrit la préparation d’échantillons d’ARN et la configuration RMN pour les mesures de dispersion de relaxation R1rho de protons afin d’examiner l’échange confirmationnel dans les molécules d’ARN. Étant donné que les protons sont sondés, la méthode n’a pas besoin d’un marquage isotopique et peut accéder directement à des caractéristiques structurelles telles que l’appariement de bases décalées. La pipette est assez modulaire dans le sens où la dispersion de relaxation R1rho peut être mesurée même si l’échantillon est produit avec une méthode différente.
Commencez par préparer l’échantillon de plasmide et mettre en place une transcription in vitro et une réaction de clivage comme décrit dans le manuscrit du texte. Incuber la réaction à 37 degrés Celsius pendant une heure. Diluer ensuite un microlitre de l’échantillon dix fois dans la solution de chargement.
Et exécutez un microlitre sur un gel PAGE dénaturant. Si la réaction de clivage réussit, mettez-la à l’échelle au volume souhaité et exécutez-la pendant la nuit. Ensuite, exécutez un autre gel PAGE dénaturant et évaluez si la réaction de clivage a été terminée.
En cas de clivage incomplet, chauffer la solution réactionnele dans un four à micro-ondes conventionnel à 450 watts pendant 15 secondes. Ensuite, refroidissez lentement la solution à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes pour réanneal l’ARN et le guide de clivage. Et notez la formation d’un nouveau précipité.
Ajouter plus de pyrophosphatase inorganique et de RNase H.Incuber la réaction pendant une à trois heures à 37 degrés Celsius. Confirmez ensuite l’achèvement de la réaction de clivage avec la dénaturation PAGE. Lorsque la réaction de clivage de la RNase H est terminée, éteindre la réaction en ajoutant de l’EDTA à une concentration finale de 50 millimolaires.
Et vortex à fond. Filtrer la solution à travers un filtre à seringue de 0,2 micron. Et concentrez la solution sur un volume injectable dans un système HPLC pour la purification.
Avant d’ajouter l’échantillon concentré et purifié au tube RMN, nettoyez le tube en rinçant avec de l’eau abondante. Ensuite, réactif de décontamination de la RNase, eau et éthanol à 95%. Après le rinçage final à l’eau, laissez-le sécher.
Rincez le piston avec de l’eau et utilisez une lingette non pelucheuse pour nettoyer avec un réactif de décontamination RNase et de l’éthanol à 95%. Après avoir séché le tube et le piston, ajoutez 10% de D2O à l’échantillon RMN. Utilisez une grande pointe de pipette pour transférer l’échantillon d’ARN dans le tube RMN, en le filtrant le long du côté de la paroi du tube.
Insérez le piston dans le tube en le poussant vers le bas avec un mouvement de torsion rapide pour éliminer les bulles d’air, puis tirez le piston lentement vers le haut sans créer de nouvelles bulles d’air. Et fixez-le avec un film de cire de paraffine. Créez un nouvel ensemble de données basé sur un ensemble de données HSQC de carbone protonique aromatique utilisé sur des échantillons d’ARN entièrement marqués pour l’assignation d’ARN.
Définissez les paramètres généraux et les paramètres spécifiques à RD. Réglez ensuite la puissance de verrouillage du spin du proton à 1,2 kilohertz pour le test. Générez une liste vd de test avec une seule entrée, zéro milliseconde, définissez TDF1 sur une et mettez à jour D30 pour exécuter un spectre de test.
Après avoir configuré une liste de vd de test, mettez à jour D30 et TDF1. Et tracez l’intensité du pic pour différentes longueurs de verrouillage de rotation. Identifiez la longueur de verrouillage de spin à laquelle l’intensité du pic d’origine diminue à un tiers.
À partir du résultat des séries de tests, créez la liste vd finale à utiliser dans l’expérience. Sélectionnez le nombre de scans de sorte que le pic le plus faible de la liste ait un rapport signal/bruit d’au moins 10. Les résultats de plusieurs réactions de clivage des transcriptions en tandem sont présentés ici.
Un ARN cible de 20 nucléotides a été généré lors d’une réaction réussie. Des réactions infructueuses ont entraîné un clivage incomplet et défaillant de l’échantillon. L’injection HPLC de l’échantillon d’ARN a révélé un pic pour l’ARN cible pur à 38 minutes.
Alors que les produits plus longs et plus courts étaient bien séparés du pic d’intérêt. L’analyse de l’épingle à cheveux à ARN a montré que le nombre de protons imino observés correspondait au nombre de protons imino attendus d’une simulation de structure secondaire. Le spectre HSQC du carbone protonique des résonances aromatiques de l’ARN a montré quatre signaux après le repliement.
Et seulement trois signaux avant le pliage. Dans les courbes représentatives sur résonance obtenues pour deux atomes H8 différents et deux épingles à cheveux à ARN synthétique différentes, le G6H8 connaît un échange confirmationnel. Alors que l’A4H8 ne le fait pas.
Pour G6H8, les puissances de verrouillage de spin colorées ont été sélectionnées et les données de résonance désactivées ont été enregistrées. Dans la construction CG où l’échange est lent, les valeurs de ligne R1rho par rapport au tracé décalé affichaient déjà une légère asymétrie de la courbe, indiquant le signe de la différence de décalage chimique delta omega. Cela devient encore plus évident dans le tracé R2 plus REX où la contribution R1 est supprimée.
D’autre part, la construction GC connaît un échange plus rapide et les valeurs R1rho par rapport au diagramme décalé ont présenté une courbe plus large où l’extraction de delta omega devient moins évidente même dans le diagramme R2 plus REX. Une fois que la dynamique de l’ARN a été élucidée, les états peuvent être caractérisés et piégés. Ces états piégés peuvent, par exemple, être testés dans des essais biologiques.
Cette méthode nous permet d’observer des changements fonctionnels et pertinents d’appariement de bases dans un complexe de miARN microARN actif, des réarrangements de boucle dans l’ARN ribosomique et la stabilité de la paire de bases sur des renflements de nucléotides uniques.
