L’objectif global de l’article suivant sur la méthode est de démontrer un protocole utile pour étudier les interactions de l’ARN avec les protéines ou d’autres facteurs à l’aide de pinces optiques couplées à la microscopie confocale. Au cours de la dernière décennie, plusieurs techniques sophistiquées ont été développées pour étudier les propriétés des macromolécules individuelles. L’une de ces techniques est la pince optique à molécule unique.
Avec la nouvelle pince optique assistée par fluorescence, non seulement les forces nécessaires au déploiement des molécules d’ARN, ainsi que les événements de liaison pendant la traduction peuvent être surveillés en détail. Ici, nous nous concentrons sur les mesures dans lesquelles les molécules d’ARN sont étirées avec et sans facteurs de transaction qui régulent la traduction. Nous illustrons également comment la technique peut être appliquée pour surveiller la traduction à l’aide de ribosomes étiquetés.
Le protocole sera démontré par deux étudiants diplômés de mon groupe, Lukas Pekarek et Stefan Park. Dans cette vidéo, nous allons vous guider à travers la configuration et l’exécution d’une expérience de pince à épiler optique. Nous décrivons également le flux de travail simple d’analyse des données.
L’avantage de cette technique est qu’elle est simple et robuste. Une molécule est attachée entre deux perles, sanglée dans le foyer des faisceaux laser, et le changement et la force lors du déplacement peuvent être mesurés avec précision dans des expériences dites de rampe de force. Les structures secondaires à l’intérieur d’une attache se déploient à une certaine force en fonction de l’énergie interne de la molécule.
Cette transition dynamique entre plusieurs structures peut être étudiée plus avant avec des mesures de force constantes. En outre, l’utilisation parallèle de l’imagerie fluorescente peut être utilisée pour visualiser les événements de liaison en temps réel. Un profil force-distance distinct d’une attache peut varier après la liaison de facteurs de transaction potentiels qui influencent sa stabilité.
Tout d’abord, l’ARN d’intérêt doit être cloné dans un vecteur d’ADN. En amont et en aval de cette séquence, des parties supplémentaires, les poignées sont nécessaires pour attacher la construction finale ADN-ARN entre les perles. Après un clonage et une amplification réussis du plasmide, trois réactions PCR différentes sont effectuées.
Pour chaque réaction de PCR, mélanger les réactifs selon le tableau un du protocole. Exécutez la PCR en aliquotes de 50 microlitres dans un cycleur thermique approprié. Le premier aboutit à un ADN double brin de l’ensemble de la construction avec le promoteur T7 pour une transcription in vitro ultérieure.
La deuxième PCR produit les cinq poignées principales. Alors que la dernière réaction aboutit aux trois poignées principales. Les poignées 5 prime et 3 prime doivent être étiquetées en fonction des perles utilisées.
Les trois poignées principales sont marquées pendant la PCR à l’aide d’une amorce inverse marquée à la digoxigénine, et les cinq poignées principales doivent être marquées en une étape supplémentaire par biotinylation. La biotinylation des trois premiers des cinq premiers manchons est réalisée à l’aide de T 40 et d’une polymérase. La réaction est réalisée pendant une à deux heures à température ambiante.
Ensuite, effectuez la transcription in vitro à l’aide de la polymérase T7. Incuber la réaction à 37 degrés pendant deux à quatre heures, selon la longueur de l’ARN. Dans une dernière étape, les poignées sont recuites avec l’ARN de la transcription in vitro pour obtenir la construction finale ADN-ARN avec la région simple brin d’intérêt entre les poignées double brin.
Pour recuit l’hybride ARN-ADN souhaité, mélangez les poignées et l’ARN dans un tampon de recuit. Chauffer, le mélange de recuit jusqu’à 85 degrés pendant 10 minutes, puis refroidir lentement l’échantillon à quatre degrés. Mélanger l’échantillon recuit avec 1/10e de volume de trois acétate de sodium molaire et trois volumes d’éthanol glacé et incuber moins 80 degrés pendant au moins une heure.
Centrifugez les échantillons à 15 000 xg pendant 30 minutes à quatre degrés. Jeter le surnageant et sécher la pastille sous vide. Les petites aliquotes de la pastille remise en suspension sont congelées dans de l’azote liquide et conservées à moins 80 degrés jusqu’à ce qu’elles soient utilisées.
Retirez d’abord l’eau de Javel des seringues et remplissez un mL d’eau sans RNase. Ajouter 50 microlitres de thiosulfate de sodium 0,5 molaire et laver le système avec une barre. Veillez à ce que le système microfluidique ne s’assèche jamais pour éviter les bulles d’air dans le système.
Ensuite, jetez la solution de thiosulfate de sodium restante et remplacez les seringues par de nouvelles. Ensuite, laver à nouveau avec au moins 0,5 mL d’eau sans RNase. Pour mettre en place le système optique de la machine, placez deux gouttes d’huile d’immersion sur l’objectif.
Mettez la cellule d’écoulement en place et relevez l’objectif jusqu’à ce que le liquide touche la cellule d’écoulement. Ensuite, placez deux gouttes d’huile d’immersion sur le dessus de la cellule d’écoulement. Maintenant, allumez l’unité de direction de piège et le laser de piégeage.
L’objectif est réglé à l’aide de l’outil de recherche Z des caméras de diagnostic de la machine. En tournant la micro vis, l’axe Z est ajusté au milieu de la chambre entre la deuxième et la troisième réflexion. Où les anneaux de réfraction sont les plus grands.
Passez les caméras de diagnostic en mode lune et réduisez le laser de piégeage à environ 50%, puis abaissez le condenseur et ajustez sa position pour voir environ 10 bandes lumineuses. La chambre de mesure a cinq canaux, et avant l’expérience, différentes possibilités de configuration doivent être envisagées. Pour une simple expérience de rampe de force, perles-tampons-perles est un arrangement de canal pratique.
Pour les mesures avec le quatrième composé, comme les ribosomes fluorescents ou les facteurs de transaction, le facteur perles-perles-tampon est un meilleur arrangement, mais il rend plus difficile la capture des perles. Une aliquote de la construction recuite est incubée avec trois microlitres de suspension de billes AD, un microlitre d’inhibiteurs de la RNase et huit microlitres du tampon d’essai à température ambiante pendant 10 à 20 minutes. Ensuite, l’échantillon est dilué dans un tampon de dosage de 500 microlitres et placé dans le canal respectif.
Pour le deuxième type de billes, 0,8 microlitre de billes d’essai sont mélangés à un mL de tampon d’essai et administrés dans le canal correspondant. Les canaux sont ouverts et lavés à basse pression. Maintenant, allumez le laser de piégeage.
Pour attraper les perles, les lasers sont éloignés les uns des autres et une perle AD est prise dans un piège. Ensuite, l’étape est déplacée vers le canal de perles SA et une perle est prise dans le piège deux. Pour éviter de perdre les perles, ou pour en attraper une seconde dans le même piège, la scène est déplacée vers le canal tampon et tous les canaux sont fermés.
Dans la mémoire tampon, un étalonnage de piège est effectué. Les perles capturées doivent être définies comme modèles visuels pour les mesures ultérieures. Et le score de similitude doit être maintenu au-dessus de 90% entre les mesures pour garantir la comparabilité.
Enfin, les perles sont rapprochées et on peut commencer à attraper une seule attache. Cela se fait en déplaçant les perles près pendant quelques secondes, puis en quittant lentement les perles à nouveau. Une formation d’attache entraîne une augmentation de la force mesurée en éloignant les deux perles l’une de l’autre.
Le nombre et la qualité des attaches peuvent être vérifiés en trouvant le plateau de surmenage et en comparant la trajectoire avec le modèle de chaîne librement articulée ou de chaîne en forme de ver. Le plateau de surmenage devrait être compris entre 50 et 60 piconewtons pour une seule attache. Pour effectuer les mesures de fluorescence, allumez les lasers confocaux et le nombre de photons sur l’unité et la pince optique.
Ensuite, allumez le laser d’excitation de la longueur d’onde souhaitée et l’interface logicielle et réglez la puissance du laser à 5% ou plus, en fonction du fluorophore. Maintenant, l’imagerie peut être démarrée en utilisant les fonctions d’image ou de kymographe du logiciel. Afin d’obtenir des images bien focalisées, assurez-vous que le plan focal du microscope confocal et les pièges optiques sont alignés.
À cette fin, l’autofluorescence des billes de polystyrène dans le canal laser bleu peut être utilisée. Déplacez-vous de haut en bas avec le plan focal des pièges optiques jusqu’à ce que l’autofluorescence des perles atteigne son diamètre le plus élevé. À cette position, les signaux de fluorescence qui ont lieu au niveau de la molécule attachée peuvent être détectés.
Pour les deux fonctions, il est important de sélectionner les régions d’intérêt appropriées. Tout au long de la mesure, la composition du tampon peut être facilement modifiée soit en déplaçant les billes vers différents canaux, soit en changeant le tampon fourni dans le système microfluidique. Pour éviter le photoblanchiment, éteignez toujours le laser d’excitation lorsque vous ne mesurez pas.
La sortie de données brutes de l’appareil contient souvent beaucoup de bruit. Par conséquent, afin d’analyser davantage les données dispersées, il faut d’abord les pré-traiter. La première étape consiste à échantillonner et à filtrer les données avec le filtre Butterworth passe-bas, de bons résultats ont été obtenus.
Pour les expériences de rampe de force, les événements de déploiement doivent être marqués aux régions pliées et dépliées correspondantes de la première courbe de distance peuvent être ajustées à l’aide de chaînes en forme de ver ou de modèles de chaînes librement articulées. Pour les données de force constante, la distance dans le temps peut être tracée et il est utile de générer un histogramme pour quantifier la conformation prédominante à une force donnée. Ici, il est montré que les paramètres du filtre sont cruciaux pour distinguer les différents états de pliage.
Pour mieux comprendre ce qui peut être réalisé avec cette technique, certains résultats représentatifs sont montrés. Voici à quoi ressemble une courbe force-distance standard d’une expérience de rampe de force. Dans ce cas, nous avons étudié l’élément de changement de cadre SARS-coronavirus-2.
Nous avons observé le déroulement en plusieurs étapes autour de 15 piconewton. Lorsque la direction est inversée et que les perles se rapprochent à nouveau, l’attache se replie à force légèrement inférieure. Lorsque nous avons mesuré le même ARN en présence de la protéine antivirale ZAP du doigt de zinc, un schéma similaire de déploiement a été observé.
Mais la structure secondaire de l’ARN ne s’est pas repliée. C’est un bon exemple pour montrer quelle grande influence la liaison aux protéines peut avoir sur la cinétique de l’ARN. En regardant les données de force constante, la cinétique de déploiement peut être étudiée plus en détail.
La distance dans le temps est tracée pour différentes forces et l’histogramme des différents états observés est ajouté à droite. À 10 piconewtons, l’ARN est complètement à l’état plié. À 11,5 piconewton, il bascule entre les états, et à 13 piconewton, l’ARN est en permanence dans un état déplié.
Cependant, lorsque l’élément de changement de cadre SARS-coronavirus-2 a été mesuré avec ZAP, l’ARN était complètement dans un état déplié à 11 piconewtons, et a même montré très peu de transition vers un état plié à 10 piconewton. Cela indique que ZAP se lie à l’élément de déplacement de cadre simple brin et empêche la formation d’une structure secondaire. Enfin, nous examinerons certaines données de pinces optiques couplées à la microscopie confocale.
Dans cette expérience, un colorant fluorescent a été utilisé qui marque les acides nucléiques double brin, non spécifiquement avec une force croissante. Le kymographe montre que lorsque les perles sont éloignées les unes des autres, l’intensité de fluorescence augmente et disparaît complètement une fois que l’attache est trop étirée et se brise. Dans la dernière figure, des ribosomes marqués par fluorescence ont été ajoutés par le canal quatre.
Dans cette expérience, une liaison spécifique du ribosome à l’attache de l’ARN a été observée. Nous espérons que cette vidéo vous a donné un aperçu des pinces optiques et de ce qui peut être effectué cette technique incroyable.
