Ici, nous avons mis en place un système expérimental simple qui permet la reconstitution de complexes d’allongement pol II actifs adaptés pour étudier le couplage fonctionnel de la transcription pol II et le plafonnement de l’ARN. Avec cette méthode, les complexes d’allongement fonctionnel peuvent être facilement assemblés avec seulement quelques composants. Les complexes d’allongement sont immobilisés sur des perles magnétiques, il est donc facile de changer les conditions de réaction.
Pour immobiliser l’oligo d’ADN contenant de la biotine sur les perles magnétiques, ajoutez d’abord 200 microlitres de perles magnétiques à un tube liant à faible teneur en protéines de 1,5 millilitre, puis placez le tube sur une grille magnétique pendant deux minutes. Pendant que le tube est sur la grille magnétique, utilisez une pipette pour retirer le liquide du tube sans déranger les perles. Pour laver les perles, retirez le tube de la grille et ajoutez un millilitre de tampon de lavage contenant du tris-hydrochlorure, de l’EDTA et du chlorure de sodium.
Remettre le tube sur la grille. Après deux minutes, retirez la solution de lavage et répétez les lavages deux fois de plus à l’aide de 200 microlitres du même tampon. Resuspendez les perles magnétiques en 400 microlitres de tampon 2X.
Ensuite, ajoutez 380 microlitres d’eau et 20 microlitres d’oligo d’ADN biotinylé non modèle de 10 micromolaires à mélanger. Placer le tube sur un nutator et incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Après cela, laver les perles avec l’oligo d’ADN non-modèle immobilisé trois fois en utilisant 200 microlitres de tampon, puis trois fois avec 200 microlitres de stockage et tampon de dilution.
Conservez le tube à quatre degrés Celsius pendant la nuit pour finir de bloquer les perles avec du BSA. Le lendemain, jetez la solution, réutilisez les perles dans 200 microlitres de tampon de stockage et de dilution, pour atteindre une concentration approximative d’ADN de cinq micromolaires, puis transférez la solution avec les perles dans un nouveau tube. Pour obtenir le duplex ADN-ARN, préparez un mélange annealing de 10 microlitres dans un tube PCR avec un rapport molaire ARN-ADN de deux pour un, tel que décrit dans le protocole écrit.
Placer le tube dans un cycleur thermique. Réglez le programme à 45 degrés Celsius pendant cinq minutes, suivi de 12 cycles de deux minutes chacun, à partir de 43 degrés Celsius et en diminuant la température de deux degrés Celsius par cycle. Enfin, gardez-le inactif à quatre degrés Celsius.
Pour charger la polymélase II purifiée de l’ARN sur l’hybride ADN-ARN, mélangez un microlitre de duplex ADN-ARN avec 13 microlitres de tampon polymélas II fraîchement préparé dans un tube. Ajouter un microlitre de polymésase d’ARN purifié II, et mélanger en pipetant doucement de haut en bas et en remuant avec la pointe pipette, sans introduire de bulles. Incuber le tube pendant 10 minutes à 30 degrés Celsius.
Pour compléter le complexe d’allongement, ajoutez un microlitre de perles oligo d’ADN immobilisées non modèles à 14 microlitres de tampon d’ADN non modèle, ajoutez le mélange de 15 microlitres au tube précédemment incubé et incubez-le pendant encore 10 minutes à 37 degrés Celsius. Placez l’échantillon sur la grille magnétique pendant deux minutes. Lavez l’échantillon une fois avec 30 microlitres de tampon de lavage pour éliminer la polymése II non incorporée et les oligos.
Pour radiolabel les complexes d’allongement avec RNA 23mers, ajouter un microlitre d’ATP et un microlitre d’UTP radiolabeled à 23 microlitres de tampon d’impulsion, et ajouter ce mélange aux perles magnétiques lavées pour résuspendre. Incuber la réaction pendant 10 minutes pour permettre la synthèse de radiolabeled 23mers. Ajouter 1,5 microlitres de solution contenant 100 micromolaires ATP et 100 micromolaires UTP mix à 3,5 microlitres de tampon chase, et ajouter le mélange au tube contenant des complexes d’allongement préassemblés sur perles.
Encore une fois, incuber le tube pendant cinq minutes pour chasser toutes les transcriptions naissantes en 23mers. Ensuite, placez le tube sur la grille magnétique, et lavez comme cela a été fait précédemment pour enlever les nucléotides non incorporés. Resuspendez l’échantillon dans 30 microlitres de tampon de lavage.
Pour générer des complexes d’allongement avec des transcriptions plus longues, suivez les procédures précédentes, et échellez quatre fois pour générer 120 microlitres de complexes d’allongement lavés pour quatre réactions. Étiquetez trois nouveaux tubes 23mer, 25mer et 29mer. Transférer 30 microlitres de complexes d’allongement lavés dans le tube de 23mer et ajouter 94 microlitres de mélange stop contenant de la proteinase K et du glycogène.
Placez le tube contenant les 90 microlitres restants de complexes d’allongement lavés sur la grille magnétique pendant deux minutes, retirez le supernatant et réutilisez les perles dans 90 microlitres de BTB complétés par 1,2 microlitres d’ATP et de CTP. Incuber pendant 10 minutes à 30 degrés Celsius. Après lavage avec 90 microlitres de tampon de lavage, transférer 30 microlitres de complexes d’allongement au tube de 25mer, et ajouter 94 microlitres de mélange stop contenant de la proteinase K et du glycogène.
Encore une fois, placez le tube contenant les 60 microlitres restants des complexes d’allongement sur la grille magnétique pendant deux minutes. Répétez le traitement BTB avec 60 microlitres de tampon complétés par 0,8 microlitres d’ATP et de CTP. Après incubation et lavage comme avant, resuspendez l’échantillon dans 60 microlitres de tampon de lavage.
Transférer 30 microlitres de l’échantillon au tube de 29mer et ajouter 94 microlitres de mélange stop contenant de la proteinase K et du glycogène. Analyser les produits de réaction sur un gel de polyacrylamide dénaturant. Tout d’abord, générer des complexes d’allongement lavés contenant 23mers en haussant 13 fois la procédure décrite précédemment pour obtenir 390 microlitres pour 12 réactions et un supplément.
Pour effectuer la phosphorylation de la polymésase II CTD, retirez le supernatant après avoir placé l’échantillon dans la grille magnétique, et résuspendez les perles dans 377 microlitres de BTB. Étiquetez deux nouveaux tubes plus H et moins H.To plus H, ajoutez trois microlitres du facteur d’initiation à la transcription TFIIH à la concentration de 300 nanogrammes par microlitre, et à moins H, ajoutez neuf microlitres de stockage et de tampon de dilution. Ajouter 87 microlitres des complexes d’allongement lavés au tube plus H et 261 microlitres au tube moins H.
Incuber les tubes pendant 10 minutes et les laver avec un tampon de lavage. Pour effectuer le plafonnement de l’ARN, ajouter 87 microlitres de mélange de plafonnement au tube plus H et 261 microlitres au tube moins H pour résuspendre. Étiquetez quatre nouveaux tubes, cinq plus H, cinq moins H, 15 moins H et 45 moins H, et distribuez trois microlitres de cinq, 15 ou 45 nanogrammes par enzyme de plafonnement de microlitre dans les tubes correspondants.
Ensuite, préparez 12 nouveaux tubes avec 94 microlitres de tampon d’arrêt. Commencez la première réaction de plafonnement en ajoutant 87 microlitres de complexe d’allongement traités avec TFIIH au tube étiqueté cinq plus H.Incubate à 30 degrés Celsius dans un bloc thermique. Les réactions de plafonnement doivent être précisément urbrées à l’aide d’un chronomètre.
Lorsque vous travaillez avec plusieurs réactions, les heures de début de chaque réaction doivent être décalées. Après une, deux ou quatre minutes, transférer 30 microlitres des cinq mélanges de réaction plus aux tubes étiquetés un, deux et trois contenant 94 microlitres de tampon d’arrêt pour arrêter les réactions. Procéder à des réactions de plafonnement pour les échantillons dans les tubes moins H restants exactement de la même manière, en utilisant des complexes d’allongement traités sans TFIIH.
Analyser les produits de réaction sur un gel de polyacrylamide dénaturant. Un diagramme est montré ici pour les molécules d’ADN et d’ARN dans les complexes artificiels d’allongement. Utilisant l’oligo synthétique d’ARN de 20 nucléotides comme amorce d’ARN pendant l’assemblage des complexes artificiels d’allongement, des nucléotides ont été ajoutés pendant chaque étape séquentielle de marche du protocole pour produire un 23mer, un 25mer, et un 29mer.
Des réactions utilisant la polymésase II d’ARN de différentes sources ont été comparées. Des complexes artificiels d’allongement ont été assemblés avec la polymésase II endogène et sauvage-type purifiée du foie de rat ou de la levure de fission et marchaient pour produire 23mères ou 25mers. Un essai a été exécuté pour mesurer le plafonnement des transcriptions radiolabeled liées aux complexes artificiels d’allongement contenant 23 transcriptions de nucléotide avec une extrémité triphosphate de cinq-premier.
Les deux dernières voies montrent les produits des réactions dans lesquelles des complexes d’allongement ont été incubés avec ou sans enzyme de plafonnement en présence de TFIIH. Les bandes qui migrent plus lentement et plus rapidement contiennent des transcriptions plafonnées et non plafonnées, respectivement. Les 12 premières voies montrent le plafonnement des transcriptions associées aux complexes d’allongement avec un CTD phosphorylaté ou non phosphorylaté.
Les activités de la polymése II et d’autres enzymes peuvent varier d’une préparation à l’autre, il est donc nécessaire d’optimiser les conditions de réaction en titrant les concentrations d’enzymes pour définir des niveaux optimaux. Il est important d’utiliser des matières radioactives en toute sécurité et d’éviter la contamination. S’il vous plaît assurez-vous de suivre vos directives de laboratoire et d’institut lors de l’expérimentation de la radioactivité.
